Summary
निम्न अनुभागों में, हम alginate microspheres की जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए तैयार करने के लिए प्रक्रियाओं रूपरेखा. हम विशेष रूप से सेल और टाइप 1 मधुमेह के लिए एक संभावित उपचार के रूप में प्रोटीन encapsulation के दोहरे उद्देश्य के लिए multilayered alginate microspheres बनाने के लिए एक तकनीक का वर्णन.
Abstract
Alginate आधारित सामग्री क्योंकि उनके हाइड्रोफिलिक प्रकृति, biocompatibility, और शारीरिक वास्तुकला की जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए काफी ध्यान दिया है. आवेदन सेल encapsulation के, दवा वितरण, स्टेम सेल संस्कृति, और ऊतक इंजीनियरिंग scaffolds शामिल हैं. वास्तव में, नैदानिक परीक्षणों वर्तमान प्रदर्शन किया जा रहा है जिसमें islets के पीएलओ लेपित alginate microbeads में मैं प्रकार मधुमेह के उपचार के रूप में समझाया जाता है. हालांकि, islets के बड़ी संख्या में गरीब अस्तित्व निम्नलिखित प्रत्यारोपण के कारण प्रभावकारिता के लिए आवश्यक हैं. समझाया कोशिकाओं के आसपास स्थानीय लिए microvascular नेटवर्क के गठन को प्रोत्साहित करने की क्षमता ऑक्सीजन, ग्लूकोज और अन्य महत्वपूर्ण पोषक तत्वों की बेहतर परिवहन के माध्यम से अपने व्यवहार्यता वृद्धि हो सकती है. Fibroblast वृद्धि कारक -1 (FGF -1) एक स्वाभाविक रूप से वृद्धि कारक है कि रक्त वाहिनियों के गठन को प्रोत्साहित करने के लिए और इस्कीमिक ऊतकों में ऑक्सीजन के स्तर में सुधार करने में सक्षम है. FGF-1 की प्रभावकारिता जब यह एक sust में वितरित किया जाता है बढ़ाया हैके बजाय एक एकल प्रशासन बड़े सांस ained फैशन. आइलेट encapsulation के सिस्टम से वृद्धि कारकों के स्थानीय रिहाई लंबे समय तक रक्त वाहिकाओं के विकास सीधे प्रतिरोपित कोशिकाओं की ओर सकता है को प्रोत्साहित, संभावित कार्यात्मक भ्रष्टाचार के परिणामों में सुधार. इस अनुच्छेद में, हम alginate microspheres की जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए तैयार करने के लिए प्रक्रियाओं रूपरेखा. इसके अलावा, हम हम multilayered alginate microbeads पैदा करने के लिए विकसित एक विधि का वर्णन. कोशिकाओं के भीतर alginate कोर, alginate परत बाहरी और angiogenic प्रोटीन में समझाया जा सकता है. इस बाहरी परत से प्रोटीन की रिहाई प्रतिरोपित islets के प्रति स्थानीय microvascular नेटवर्क का गठन सीधे उत्तेजित होता है.
Protocol
यहाँ प्रोटोकॉल एक multilayered alginate microbeads (चित्रा 1) पैदा करने के लिए एक तीन कदम प्रक्रिया का वर्णन करता है. सबसे पहले, alginate microbeads (2A चित्रा) का गठन कर रहे हैं. इस प्रक्रिया के नीचे अनुभाग 1 में वर्णित है. प्रोटीन कोशिकाओं या इस कदम में microbeads करने के लिए जोड़ा जा सकता है क्रम में करने के लिए एक वितरण प्रणाली के रूप में कार्य. अगले कदम microbeads पर permselective परत का गठन शामिल है और धारा 2 में वर्णित है. अंतिम कदम अतिरिक्त alginate परत के गठन शामिल है और धारा 3 में वर्णित है. मोतियों की सतह के बाहर (चित्र 2B) पर इस परत रूपों encapsulate और चिकित्सीय अणुओं (चित्रा -2) देने के लिए प्रणाली निम्नलिखित प्रत्यारोपण के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया प्रत्यक्ष के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
1. Alginate Microbead तैयार
- 1 की एमएल में LVM के alginate की 15 ग्राम भंग द्वारा एक 1.5% (w / v) LVM alginate समाधान तैयारभीतरी परत alginate समाधान (25 मिमी HEPES बफर, 118 मिमी NaCl, 5.6 मिमी KCl, और 2.5 मिमी 2 डि जल में MgCl, 7.4 पीएच को समायोजित). Vortexer पर मिश्रण जब तक alginate शक्ति पूरी तरह से एक स्पष्ट, चिपचिपा समाधान के रूप में भंग कर दिया है. नोट: यह प्रोटोकॉल alginate microcapsules भीतर आइलेट encapsulation के लिए इष्टतम स्थितियों का वर्णन 1 एकाग्रता और alginate microspheres की संरचना के लिए अन्य अनुप्रयोगों (जैसे दवा वितरण, ऊतक इंजीनियरिंग, आदि) नोट के लिए गुण धुन बदला जा सकता है. आइलेट encapsulation के टापू microencapsulator में लोड करने से पहले इस कदम पर alginate समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है.
- 100 मिमी 2 CaCl और डि पानी में 10 मिमी HEPES के बफर भंग और 7.4 पीएच को समायोजित करने crosslinking का समाधान (डि पानी में 22 मिमी 2 CaCl) तैयार करते हैं. नोट: 2 Br के रूप में अन्य द्विसंयोजक फैटायनों +, सीनियर 2 आदि, alginate जमाना चाहते हैं की प्रकृति पर निर्भर करता है 2 सीए के बजाय प्रयोग किया जा सकता हैesired.
- एक सिरिंज के लिए एक 25 गेज सुई जोड़ने, और प्रत्येक पक्ष पर वाल्व को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि सुई हवा जैकेट के केंद्र में है के द्वारा दो चैनल हवा जैकेट alginate microencapsulator सेट. विभिन्न गेज सुई के इस कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, alginate लक्षित microbeads के आकार पर निर्भर करता है.
यह कदम भी एक सिरिंज के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, एक microencapsulator होना करने के लिए उपलब्ध नहीं होना चाहिए. सिरिंज alginate समाधान जोड़ें, और एक सुई वांछित microbeads के आकार के आधार पर गेज का चयन करें. - एक सुई के नीचे सीधे crosslinking समाधान के 10 एमएल युक्त कुप्पी रखें. समाधान में हलचल बार रखें.
- बूंदों सीधे क्रम में alginate Crosslink microbeads फार्म CaCl 2 समाधान में इंजेक्षन. कम से कम पंद्रह मिनट के लिए लगातार सरगर्मी के साथ, इलाज crosslinking समाधान में मोती सेते हैं.
- 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब मोती स्थानांतरण. अवशिष्ट समाधान निकालें,और 0.2% सामान्य नमकीन घोल में दो मिनट के लिए प्रत्येक CaCl 2 के साथ तीन washes के प्रदर्शन.
2. पाली एल ornithine साथ microbeads कोटिंग
- सामान्य नमक में एक पाली एल ओर्निथिन (पीएलओ) के 0.1% (w / v) समाधान के 3 एमएल तैयार. भंवर पर समाधान रखें जब तक यह पूरी तरह से भंग होता है, एक स्पष्ट समाधान बनाने. पाली एल Lysine (पीएलएल) के इस कदम है, जो permselectivity के समान स्तर में परिणाम के लिए पी.एल. ओ के बजाय प्रयोग किया जा सकता है.
- पीएलओ समाधान में alginate microbeads स्थानांतरण. 30 मिनट के पीएलओ पर्याप्त समय alginate के साथ बातचीत करने के लिए, एक जटिल polycation - polyanion बनाने की अनुमति के लिए एक भंवर पर रखें. 30 मिनट के अंत में, वहाँ एक साफ़ दिखाई alginate microbeads चारों ओर सफेद कोटिंग होना चाहिए.
- पीएलओ समाधान निकालें, और 0.2% सामान्य नमक में दो मिनट के लिए प्रत्येक CaCl 2 के साथ तीन washes के प्रदर्शन.
3. बाहरी Alginate बनाना लेटाओएर
- वांछित एकाग्रता है कि करने के लिए बाहरी परत बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा के एक alginate समाधान के तैयार हो जाओ. समाधान के रूप में वर्णित इसके बाद के संस्करण (1.1) तैयार है. बाहरी परत के आकार का इस्तेमाल किया (चित्रा 3) संरचना और alginate की एकाग्रता से प्रभावित है.
- एक सेल छलनी करने के लिए स्थानांतरण alginate microbeads. अतिरिक्त समाधान को अवशोषित करने के लिए जितना संभव हो microbeads सूखी एक Kimwipe का उपयोग करें.
- Microbeads एक Parafilm सतह के लिए स्थानांतरण. कांच या भी एक प्लास्टिक पेट्री डिश के रूप में अन्य चिकनी सतहों Parafilm के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, अगर वांछित.
- स्थानांतरण alginate alginate microbeads पर (3.1) तैयार समाधान. alginate समाधान की मात्रा पूरी तरह से alginate microbeads चाहिए कवर किया जा. Microbeads alginate समाधान में 45 मिनट के लिए रहते हैं.
- अतिरिक्त alginate microbeads करने के लिए बाध्य नहीं समाधान निकालने के एक विंदुक का प्रयोग करें.
- में microbeads स्थानांतरण22mm 2 CaCl की एक समाधान. इस microbeads चारों ओर alginate समाधान crosslinks, अलग बाहरी alginate परत के गठन में जिसके परिणामस्वरूप.
- सामान्य नमक में दो - दो मिनट के लिए 22 मिमी CaCl 2 के साथ तीन washes के प्रदर्शन करते हैं. एक खुर्दबीन के नीचे microbeads देखना एक अलग बाहरी alginate कोर microbead के आसपास का गठन देखा जा परत के लिए अनुमति चाहिए.
4. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 multilayered alginate microbeads बनाने के लिए प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध. खन्ना एट अल से अनुमति के साथ Reproduced. जम्मू Biomed मेटर रिस ए नवम्बर, 95 (2), 632-40 (2010).
चित्रा 2 (ए) और (ख) चरण alginate microbeads के विपरीत छवियाँ हैं. (ए) microbead से पता चलता हैबाद संश्लेषण कदम (1.7), समय (बी) एक अलग बाहरी alginate कदम (3.7) के पूरा होने के बाद वर्तमान परत को प्रदर्शित करता है. (सी) fluorescently लेबल बीएसए बाहरी परत में समझाया प्रोटीन का एक FITC छवि है. खन्ना एट अल से अनुमति के साथ Reproduced. जम्मू Biomed मेटर रिस ए नवम्बर, 95 (2), 632-40 (2010).
चित्रा 3. बाहरी alginate परत के आकार संरचना और alginate की एकाग्रता के आधार पर अलग किया जा सकता है. हमारे परिणाम बताते हैं कि, दोनों LVM और LVG alginate के लिए में, alginate एकाग्रता बढ़ाने के साथ बाहरी परत आकार बढ़ता है, और है कि LVG alginate बराबर मात्रा में LVM alginate से मोटा बाहरी परत पैदावार. खन्ना एट अल से अनुमति के साथ Reproduced. जम्मू Biomed मेटर रिस ए नवम्बर, 95 (2), 632-40 (2010).
चित्रा 4 FGF-1 के रिलीज, बाहरी alginate LVM और LVG alginate इस्तेमाल किया की एकाग्रता पर आधारित विभिन्न परत से एक angiogenic वृद्धि कारक प्रोटीन,. (ए) (बी) शो प्रतिशत रिहाई, और (सी) और (डी) FGF-1 के इसी बड़े पैमाने पर जारी विभिन्न बाहरी परत योगों के लिए समय की तुलना में निरूपित. एक फट प्रारंभिक 5 घंटे (ए और सी) के भीतर सभी स्थितियों के लिए प्रदर्शन जारी है, और कम खुराक 30 दिनों तक के लिए निरंतर जारी (बी और डी) है. खन्ना एट अल से अनुमति के साथ Reproduced. जम्मू Biomed मेटर रिस ए नवम्बर, 95 (2), 632-40 (2010) बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
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Discussion
Alginate एक प्राकृतिक, अम्लीय शैवाल से निकाली और 'β-डी mannuronic एसिड (एम) और α एल guluronic एसिड (D) 2,3 1,4 की इकाइयों से बना है polysaccharide है. सरल जमाना होता है जब ऐसे 2 CA के रूप में द्विसंयोजक फैटायनों, +, 2 सीनियर + या 2 दादी जी monomers आसन्न alginate श्रृंखला के बीच ईओण पुलों के गठन के साथ बातचीत. Alginate की microbeads fibroblast वृद्धि कारक -1 (FGF -1), तंत्रिका वृद्धि कारक है, लेकिमिया बाधा कारक संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF), और कोशिकाओं के encapsulation के लिए chondrocytes hepatocytes सहित सहित, प्रोटीन की एक किस्म देने के लिए उपयोग किया गया है और islets. इस तरह के एक microparticle बहुलक प्रणाली का उपयोग कर के लाभ और शरीर, छोटे कण इंजेक्शन के माध्यम से आसान प्रशासन के लिए अनुमति मात्रा में प्रोटीन गिरावट और प्रतिक्रिया से कोशिकाओं की सुरक्षा, और घुला हुआ पदार्थ प्रसार की सामग्री भौतिक संपत्तियों के हेरफेर से नियंत्रण शामिल हैं.
Alginate एक permselective बहुलक परत के साथ microspheres लेपित प्रकार मुझे मधुमेह के उपचार के लिए नैदानिक परीक्षणों में हैं. हालांकि, प्रतिरोपित समझाया islets के दीर्घकालिक व्यवहार्यता निर्भर है, भाग में एक संवहनी रक्त की आपूर्ति से ऑक्सीजन और पोषक तत्वों को प्राप्त करने की क्षमता पर. एक biomaterial प्रणाली है कि एक साथ एक टापू के लिए एक encapsulation के प्रणाली के रूप में के रूप में अच्छी तरह से angiogenic प्रोटीन के लिए एक निरंतर वितरण प्रणाली के रूप में सेवा कर सकते हैं प्रतिरोपित कोशिकाओं के आसपास संवहनी विकास को प्रोत्साहित करने के लिए, सुधार भ्रष्टाचार व्यवहार्यता में उत्पन्न हो सकता है. लगातार neovascularization FGF-1 के बजाय एक ही सांस में प्रशासन निरंतर जारी की आवश्यकता है. इस जौव लेख में, हम multilayered alginate microbeads (चित्रा 1) पैदा करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं. बाहरी परत encapsulation और निरंतर जारी FGF-1 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि आंतरिक परत आइलेट प्रत्यारोपण के immunoisolation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 2
हमारी प्रयोगशाला पहले दिखाया गया है कि FGF-1 के एक लगातार microvascular नेटवर्क 4-6 प्रतिक्रिया में प्रोटीन, परिणामों के एक उच्च सांस में प्रशासन के बजाय एक निरंतर वितरण. यहाँ वर्णित व्यवस्था angiogenic प्रोटीन की FGF 1 (चित्रा 2) के रूप में वितरण के लिए एक बाहरी परत उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बाहरी परत के आकार का इस्तेमाल किया (चित्रा 3) संरचना और alginate की एकाग्रता के आधार पर अलग किया जा सकता है. इस बाहरी परत के आकार सिस्टम की सफलता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है. बाहरी परत के गुण दोनों चिकित्सकीय अणुओं के आसपास के ऊतकों में आंतरिक alginate में कोशिकाओं को पोषक तत्वों और संकेतन अणुओं की रिहाई और परिवहन को प्रभावित कर सकता है. बाहरी परत गुणों के लिए दिए गए आवेदन के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता होगी. FGF-1 के वितरण के लिए, निरंतर जारी के लिए 30 दिनों alginate प्रपत्र के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है(चित्रा 4) आबादी 7, 8.
नैदानिक परीक्षणों का उपयोग alginate microcapsules में समझाया islets के प्रकार मैं मधुमेह के लिए एक इलाज के रूप में कुछ वादा दिखाया है. हालांकि, islets के बड़ी संख्या प्रभावकारिता के लिए आवश्यक हैं, क्योंकि गरीब अस्तित्व के प्रत्यारोपण के बाद. जो में एक angiogenic प्रोटीन बाहरी परत से जारी है बहुपरत microcapsules में टापू encapsulate करने की क्षमता प्रतिरोपित islets की व्यवहार्यता बढ़ाने सकता है. इस सुधार व्यवहार्यता उपचार के लिए आवश्यक islets की संख्या को कम करने, संभावित नैदानिक और इन उपचारों के प्रभाव की उपलब्धता बढ़ सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन में दिग्गजों मामलों के अमेरिकी विभाग (वाशिंगटन डीसी), ०८,५२,०४८ अनुदान, 0,731,201 और 0,854,430 राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (Arlington, VA) से, और DK080897 RO1 अनुदान स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से (Bethesda, एमडी) द्वारा समर्थित किया गया . श्री खन्ना श्री एडवर्ड रॉस और बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन (सिएटल, WA) से डा. मोनिका मोया ने एक उदार दान से समर्थन प्राप्त किया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
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