Summary
Aşağıdaki bölümlerde, biyomedikal uygulamalarda kullanım için aljinat mikroküreler hazırlanması için prosedürleri özetlemektedir. Biz özellikle tip 1 diyabet için potansiyel bir tedavi olarak hücre ve protein encapsulation çift amaçlı çok katmanlı aljinat mikroküreler oluşturmak için bir teknik göstermektedir.
Abstract
Aljinat esaslı malzemeler nedeniyle hidrofilik doğa, biyouyumluluk ve fiziksel mimari biyomedikal uygulamalar için oldukça dikkat çekmektedir. Uygulamalar hücre kapsülleme, ilaç dağıtım, kök hücre kültürü ve doku mühendisliği iskeleleri bulunmaktadır. Aslında, klinik çalışmalarda şu anda adacık tip I diyabet bir tedavi olarak FKÖ kaplı aljinat mikro kapsüllü hangi yapılmaktadır. Bununla birlikte, adacıklar, çok sayıda sağkalım aşağıdaki transplantasyonundan dolayı etkinliği için gereklidir. Yerel kapsüllü hücrelerinin etrafında mikrovasküler ağ oluşumunu teşvik yeteneği oksijen, glikoz ve diğer hayati besin gelişmiş ulaşım yoluyla canlılığı arttırabilir. Fibroblast büyüme faktörü-1 (FGF-1) kan damarlarının oluşumunu teşvik ve iskemik dokularda oksijen seviyelerini artırmak için mümkün olan bir doğal olarak meydana gelen büyüme faktörüdür. Bir sust olarak temin edildiğinde FGF-1 etkinliği arttırılıryerine tek bir büyük-bolus daha ained moda. Adacık kapsülleme sistemlerinden büyüme faktörlerinin yerel uzun vadeli sürüm potansiyel fonksiyonel greft sonuçlarının iyileştirilmesi, nakledilen hücrelerin doğrudan katkıda kan damarlarının büyümesini teşvik edebilir. Bu yazıda, biyomedikal uygulamalarda kullanım için aljinat mikroküreler hazırlanması için prosedürleri özetlemektedir. Buna ek olarak, biz çok katmanlı aljinat, mikro-küreler üretmek için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Hücreler dış tabakadaki aljinat iç çekirdek aljinat, ve anjiyojenik proteinleri içinde kapsüllenmektedir edilebilir. Bu dış katmandaki proteinlerin serbest nakledilen adacıklar yönelik doğrudan yerel mikrovasküler ağların oluşumunu teşvik etmektedir.
Protocol
Burada protokol katmanlı aljinat mikro (Şekil 1) oluşturmak için üç aşamalı bir yordam açıklanır. İlk olarak, aljinat, mikro-küreler (Şekil 2A) oluşturulmaktadır. Bu prosedür, aşağıdaki bölümde 1 'de tarif edilmektedir. Hücreleri ya da proteinler bir dağıtım sistemi olarak hareket etmek için, bu aşamada mikroboncukları eklenebilir. Bir sonraki adım mikroboncukları bir permselective tabakasının oluşturulmasını içerir ve 2. bölümünde tarif edilmiştir. Son adım ek bir aljinat tabakasının oluşturulmasını içerir ve bölüm 3'te tarif edilmektedir. Boncuklar yüzeyi (Şekil 2B) dış kısmında, bu tabaka formları sistemi aşağıdaki nakli için hücresel tepkidir yönlendirmek için terapötik molekülleri (Şekil 2C) saklanması ve sağlamak için kullanılabilir.
1. Aljinat microbead Hazırlık
- 1 mL LVM aljinat 15 gram eritilmesi ile bir% 1.5 (w / v) LVM aljinat çözeltisi hazırlayıniç tabaka aljinat çözeltisi (pH 7.4 'e ayarlanır DI su içinde 25 mM HEPES tampon, 118 mM NaCI, 5.6 mM KCI, 2.5 mM MgCl2,). Aljinat gücü tamamen açık, viskoz bir çözüm oluşturmak için çözünmüş kadar bir Vortexer üzerinde karıştırın. Not: Bu protokol aljinat mikrokapsüller içinde adacık encapsulation için en uygun koşulları açıklar 1 konsantrasyon ve aljinat mikroküreler kompozisyonu diğer uygulamalar (örneğin ilaç dağıtım, doku mühendisliği, vb) Not özelliklerini ayarlamak için değiştirilebilir. Adacık kapsülleme için adacıklar önceden microencapsulator olarak yüklenmesi için bu aşamada aljinat çözeltisine ilave edilebilir.
- 100 mM CaCI2 ve DI su içinde 10 mM HEPES tampon çözücü ve pH 7.4 'e ayarlayarak çapraz bağlayıcı çözelti (DI su içinde 22 mM CaCl2) hazırlayın. Not: Br 2 gibi başka iki değerlikli katyon +, Sr 2 + + gibi, aljinat jelleşme d doğasına bağlı olarak yerine Ca 2 kullanılabilmektediresired.
- Bir şırınga için 25-gauge iğne ekleyerek ve iğne hava yeleği merkezinde olduğundan emin olmak için her iki tarafta vanalar ayarlamak tarafından iki kanallı hava yeleği aljinat microencapsulator ayarlayın. Farklı mastar iğnelerin hedeflenen aljinat mikroboncuk boyutuna bağlı olarak, bu adım için kullanılabilir.
Bu aşama, aynı zamanda, bir şırınga ile yapılabilir, bir microencapsulator mevcut olmamalıdır. Şırıngaya aljinat çözeltisi ekleyin ve istenilen mikroboncuk boyutuna göre bir iğne gösterge seçin. - Doğrudan iğne altında çapraz bağlayıcı çözelti 10 mL içeren bir şişeye yerleştirin. Çözelti içinde bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
- Mikro-küreler oluşturmak üzere aljinat çapraz bağ amacıyla CaCI2 çözeltisi içine doğrudan damlacıklar enjekte edilir. Sürekli karıştırılarak, en az beş dakika boyunca tedavi etmek çapraz bağlayıcı çözelti içinde boncuklar inkübe.
- Bir 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne boncuklar transfer edin. , Artık çözelti çıkarınve iki dakika her biri için normal tuzlu su çözeltisi içinde% 0.2 CaCI2 ile üç yıkama gerçekleştirmek.
2. Poli-L-ornitin ile kaplama mikroboncukları
- Normal serum fizyolojik içinde poli-L-ornitin (FKÖ) bir% 0.1 (w / v) çözeltisi 3 mL hazırlayın. Tamamen açık bir çözeltisinin oluşturulması, eriyene kadar bir girdap üzerine çözeltisi yerleştirin. Poli-L-lisin (PLL) seçici geçirgenliğe benzer seviyeleri ile sonuçlanır Bu adımda, bunun yerine FKÖ'nün kullanılabilir.
- FKÖ çözüm içine aljinat mikroküreler aktarın. FKÖ yeterli zaman polikatyon-polianyon kompleks oluşturarak, aljinat ile etkileşim sağlamak için 30 dakika boyunca bir vorteks koyun. 30 dakika sonunda, aljinat, mikro-küreler etrafında belirgin bir görünür beyaz kaplama olması gerekir.
- FKÖ çözüm çıkarın ve iki dakika her biri için normal salin% 0.2 CaCl2 ile üç yıkar gerçekleştirin.
3. Dış Aljinatta oluşturma Layer
- Dış katman oluşturmak için kullanılacak olan istenilen konsantrasyonu bir aljinat çözeltisi hazırlayın. (1,1) 'da anlatıldığı gibi solüsyonu hazırlanır. Dış tabakasının boyutları (Şekil 3) kullanılan aljinat bileşimi ve konsantrasyonu tarafından etkilenir.
- Bir hücre-süzgeç için aljinat mikroküreler aktarın. Mikroküreler mümkün olduğunca kurutmak için fazla çözüm emmek için bir Kimwipe kullanın.
- Bir parafilm yüzeye mikro aktarın. Arzu edilirse, cam ya da plastik Petri tabağı gibi diğer düz yüzeyler, parafilm için ikame edilebilir.
- Aljinat mikroküreler üzerine (3.1) hazırlanan aljinat çözüm aktarın. Aljinat çözeltisi hacmi tamamen aljinat mikroküreler kapsamalıdır edilebilir. Mikro-küreler 45 dakika boyunca aljinat çözelti içinde kalmasını sağlar.
- Mikroküreler bağlı olmayan aşırı aljinat çözüm çıkarmak için bir pipet kullanın.
- Içinde mikro-küreler aktarmak22mm CaCI2 içindeki bir çözeltisine. Bu, farklı dış aljinat tabakasının oluşumu ile sonuçlanarak, mikro-küreler etrafında aljinat çözeltisi çapraz bağlar.
- Iki dakika her biri için serum fizyolojik CaCI2 22 mM üç yıkama yapın. Mikroskop altında mikro görüntüleniyor çekirdek microbead etrafında oluşan görülen ayrı bir dış aljinat kat için izin vermelidir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. Çok katmanlı aljinat, mikro-küreler oluşturmaya yönelik prosedürün şematik. Khanna ve ark izniyle. J Biomed Mater Res A. Kasım; 95 (2), 632-40 (2010).
Şekil 2,. (A) ve (B) aljinat mikroboncuk faz kontrast görüntülerdir. (A) 'a microbead gösterirsonra, Sentez, aşama (1,7), (B) adım (3,7) tamamlanmasından sonra, mevcut farklı bir dış tabaka aljinat gösterir iken. (C) dış tabaka içinde kapsüllenmektedir floresan-etiketli BSA bir protein FITC görüntüsüdür. Khanna ve ark izniyle. J Biomed Mater Res A. Kasım; 95 (2), 632-40 (2010).
Şekil 3. Dış aljinat tabakasının boyutları kullanılan aljinat bileşimi ve konsantrasyonuna dayalı çeşitlendirilebilir. Bizim sonuçlarımız LVM ve LVG aljinat her ikisi için, artan aljinat konsantrasyonu ile dış tabaka boyutu artar ve bu LVG aljinat eşit konsantrasyonlarda LVM aljinat daha kalın dış katmanları verir, göstermektedir. Khanna ve ark izniyle. J Biomed Mater Res A. Kasım; 95 (2), 632-40 (2010).
Şekil 4. FGF-1 salınması, LVM ve LVG aljinat kullanılan bir konsantrasyon göre değiştiği dış tabakadan aljinat, bir büyüme faktörü anjiyojenik proteini. (A) ve (B) göstermektedir oranında salınma ve (C) ve (D) farklı bir dış tabaka formülasyonlar için zaman karşısında FGF-1, karşılık gelen yığın yayın temsil eder. Bir patlama ilk 5 h (A ve C) içindeki tüm koşulları için sergilenen bırakma ve 30 güne kadar düşük doz sürekli sürüm (B ve D) vardır. Khanna ve ark izniyle. J Biomed Mater Res A. Kasım;. 95 (2), 632-40 (2010) büyük rakamı görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aljinat yosunu çıkarılan ve 1,4 '-β-D-mannuronic asit (M) ve α-L-guluronic asit (G) 2,3 ünitelerinden oluşan bir doğal, asidik polisakkarittir. Basit jelleşme oluşur Ca 2 gibi iki değerlikli katyonlar, +, Sr 2 + ve Ba 2 + bitişik aljinat zincirleri arasındaki iyonik köprü oluşturan G-monomerler ile etkileşim. Aljinat mikroküreler kondrosit, hepatosit dahil fibroblast büyüme faktörü-1 (FGF-1), sinir büyüme faktörü, lösemi inhibitör faktör, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve hücrelerin encapsulation dahil proteinlerin çeşitli sunmak için kullanılmaya başlanmıştır ve adacıklar. Böyle bir sistemin mikropartikül polimeri kullanarak avantajları enjeksiyon yoluyla kolay uygulaması için izin gövdesi, küçük partikül hacim proteinleri ve bozunma ve reaksiyon hücreleri korunması, ve malzeme fiziksel özelliklerinin manipülasyonu ile çözünen difüzyon kontrolü içerir.
Bir permselective polimer tabakası ile kaplanmış aljinat mikrosferler tip I diyabet tedavisi için klinik denemeler aşamasındadır. Ancak, nakledilen kapsüllü adacık uzun vadede kalıcılığı bir damar kan dolaşımı oksijen ve besin elde etmek için onun yetenek, kısmen bağlıdır. Adacık için bir kaplama sistemi gibi anjiyogenik proteinlerin sürekli bir taşıyıcı sistem olarak aynı anda hizmet verebilir bir biyomateryal sistemi geliştirilmiş greft canlılığı ile sonuçlanan, nakledilen hücrelerin etrafında vasküler büyümeyi teşvik edebilir. Kalıcı neovaskülarizasyonun yerine tek bir bolus uygulaması daha FGF-1 arasında sürekli salimli gerektirir. Vallahi bu yazıda, çok katmanlı aljinat mikro (Şekil 1) oluşturmak için bir yaklaşım sunuyoruz. Iç tabaka adacık nakli immunoisolation için kullanılabilir ederken dış katman (Şekil 2 FGF-1 kapsülleme ve sürekli salım için kullanılabilir
Bizim laboratuar Daha önce gösterilmiş olduğu yerine bir kalıcı mikrovasküler ağ yanıt olarak 4-6 protein, bir sonuç yüksek bolus uygulaması daha FGF-1, devamlı bir teslimat. Burada açıklanan sistem, FGF-1 (Şekil 2) gibi anjiyojenik proteinlerin iletim için bir dış tabaka oluşturmak için de kullanılabilir. Dış tabakasının boyutları (Şekil 3) kullanılan aljinat bileşimi ve konsantrasyonuna dayalı çeşitlendirilebilir. Bu dış tabakasının büyüklüğü sistemlerin başarısında önemli bir rol oynayabilir. Dış katmanın özelliklerini çevreleyen dokuya terapötik molekülleri serbest bırakılması ve iç aljinat içinde hücrelere besin ve sinyal molekülleri ile hem de nakil etkileyebilir. Dış katman özellikleri, verilen bir uygulama için optimize edilmesi gerekir. FGF-1 teslimat için sürekli salma aljinat şekline bağlı olarak 30 güne kadar elde edilebilirulation (Şekil 4) 7, 8.
Aljinat nanozomlarında adacıklar kullanarak klinik çalışmalarda tip I diyabet tedavisi için bazı umut vermiştir. Transplantasyonundan sonra zayıf hayatta kalma Bununla birlikte, adacıklar, çok sayıda etkinliği için gereklidir. Anjiyojenik protein dış tabaka serbest olduğu çok katmanlı mikrokapsüller içinde adacıklar saklanması yeteneği nakledilen adacık canlılığı artırabilir. Bu geliştirilmiş canlılık bu tedavilerin potansiyel klinik etki ve durumu artırarak, tedavisi için gerekli adacık sayısını azaltabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri ABD Savaş Gazileri İşleri Bakanlığı (Washington DC), ödenek 0.852.048, 0.731.201, 0.854.430 ve Ulusal Bilim Vakfı (Arlington, VA) gelen, ve hibe RO1 DK080897 (Bethesda, MD) tarafından desteklenmiştir . Sayın Khanna Bill & Melinda Gates Vakfı (Seattle, WA) Sayın Edward Ross ve Dr Monica Moya cömert bir bağış destek aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads. J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation. Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).
- Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration. Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).
- Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering. Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells. Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1. J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).
