Summary
In den folgenden Abschnitten beschreiben wir Verfahren zur Herstellung von Alginat-Mikrokugeln für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen. Wir illustrieren speziell eine Technik zur Erstellung mehrschichtiger Alginat-Mikrokugeln für den doppelten Zweck der Zell-und Protein-Kapselung als potenzielle Therapie für Typ 1 Diabetes.
Abstract
Alginat-Basis-Werkstoffe haben beträchtliche Aufmerksamkeit für biomedizinische Anwendungen aufgrund ihrer hydrophilen Natur, Biokompatibilität und physikalischen Architektur erhalten hat. Zu den Anwendungen gehören der Verkapselung von Zellen, Drug-Delivery-, Stammzellen-Kultur, und Tissue Engineering Scaffolds. In der Tat sind derzeit klinische Studien durchgeführt, in dem Inselchen in PLO beschichteten Alginat-Mikrokugeln werden als eine Behandlung von Typ-I-Diabetes eingeschlossen. Allerdings sind eine große Anzahl von kleinen Inseln auf Wirksamkeit aufgrund der schlechten Überleben nach der Transplantation erforderlich. Die Fähigkeit, lokal anregen mikrovaskulären Netzwerk Formation um den verkapselten Zellen können ihre Lebensfähigkeit durch verbesserte Transport von Sauerstoff, Glukose und anderen lebenswichtigen Nährstoffen zu erhöhen. Fibroblasten-Wachstumsfaktor-1 (FGF-1) ist ein natürlich vorkommendes Wachstumsfaktor, der in der Lage, die Bildung von Blutgefäßen fördern und zu verbessern Sauerstoffgehalt im ischämischen Gewebe ist. Die Wirksamkeit von FGF-1 wird verbessert, wenn es in einem sust geliefert wirdained Weise statt eines einzelnen großen Bolus-Verabreichung. Der lokale langfristige Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus Inselchen Verkapselung Systeme könnten das Wachstum von Blutgefäßen stimulieren direkt gegenüber den transplantierten Zellen, die möglicherweise die Verbesserung der funktionellen Ergebnisse Transplantat. In diesem Artikel beschreiben wir Verfahren zur Herstellung von Alginat-Mikrokugeln für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, die wir zur Erzeugung von vielschichtigen Alginat-Mikrokugeln entwickelt. Die Zellen können in der inneren Alginat Kern und angiogenen Proteine in der äußeren Schicht Alginat verkapselt werden. Die Freisetzung von Proteinen aus dieser äußeren Schicht würde die Bildung von lokalen Netzwerken mikrovaskulären direkt stimulieren gegenüber den transplantierten Inseln.
Protocol
Das Protokoll beschreibt hier ein dreistufiges Verfahren zur Erzeugung von vielschichtigen Alginat-Mikrokugeln (Abbildung 1). Zunächst werden Alginat-Mikrokugeln gebildet (Abbildung 2A). Dieses Verfahren wird in Abschnitt 1 beschrieben. Zellen oder Proteine können die Mikrokügelchen in diesem Schritt zugegeben werden, um als ein Abgabesystem zu handeln. Der nächste Schritt beinhaltet die Bildung einer Schicht auf den permselektive Mikroperlen und wird in Abschnitt 2 beschrieben. Der letzte Schritt beinhaltet die Bildung einer zusätzlichen Schicht Alginat und wird in Kapitel 3 beschrieben. Diese Schicht bildet sich auf der Außenseite der Oberfläche der Kügelchen (2B) kann zum Kapseln und liefern therapeutische Moleküle (2C), um zelluläre Reaktion auf das System nach der Transplantation zu leiten.
1. Alginat Nichtmetallisches Vorbereitung
- Vorbereiten einer 1,5% (w / v) LVM Alginatlösung durch Auflösen von 15 g LVM Alginat in 1 mlInnenschicht Alginat-Lösung (25 mM HEPES-Puffer, 118 mM NaCl, 5,6 mM KCl und 2,5 mM MgCl 2 in DI-Wasser, eingestellt auf pH 7,4). Mischen Sie auf einem Vortexer, bis das Alginat Macht vollständig aufgelöst hat, um eine klare, viskose Lösung zu bilden. Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt Bedingungen optimal für Insel-Kapselung innerhalb Alginat-Mikrokapseln 1 Die Konzentration und Zusammensetzung der Alginat-Mikrokugeln verändert werden, um Eigenschaften für andere Anwendungen (z. B. Drug Delivery, Tissue Engineering, etc.) Hinweis abzustimmen. Für Inselchen Kapselung die Inseln Sie können der Alginatlösung in diesem Schritt vor dem Laden in der microencapsulator zugesetzt werden.
- Bereiten Sie die Vernetzungslösung (22 mM CaCl 2 in DI-Wasser) durch Lösen von 100 mM CaCl 2 und 10 mM HEPES-Puffer in DI-Wasser und Einstellen auf pH 7,4. Hinweis: andere zweiwertige Kationen, wie Br 2 +, Sr 2 + usw. können anstelle von Ca 2 +, je nach Art von Alginat Gelierung d verwendet werdenesired.
- Richten Sie die Zwei-Kanal-Luftmantel Alginat microencapsulator durch Zugabe einer 25-Gauge-Nadel mit einer Spritze, und passen Sie die Ventile auf jeder Seite um sicherzustellen, dass die Nadel in der Mitte des Luft-Jacke. Kanülen unterschiedlicher Größe kann für diesen Schritt verwendet werden, abhängig von der Größe der Alginat-Mikrokugeln ausgerichtet.
Dieser Schritt kann mit einer Spritze durchgeführt werden, sollte ein microencapsulator nicht zur Verfügung. Fügen Sie die Alginat-Lösung mit der Spritze, und wählen Sie einen Nadelabstand von der Größe der gewünschten Mikroperlen basiert. - Stellen Sie ein Kolben, der 10 ml Vernetzungslösung direkt unterhalb der Nadel. Legen Sie einen Rührstab in der Lösung.
- Spritzen Tröpfchen direkt in die CaCl 2-Lösung, um das Alginat zu vernetzen, um Mikrokügelchen zu bilden. Inkubieren der Kügelchen in der Vernetzungslösung zu mindestens fünfzehn Minuten härten, unter kontinuierlichem Rühren.
- Übertragen der Perlen zu einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie die restliche Lösung,und führen Sie drei Waschungen mit einer 0,2% igen CaCl 2 in physiologischer Kochsalzlösung für zwei Minuten.
2. Die Beschichtung der Mikrokügelchen mit Poly-L-Ornithin
- Planen 3 ml einer 0,1% (w / v) Lösung von Poly-L-Ornithin (PLO) in normaler Kochsalzlösung. Legen Sie die Lösung auf einem Vortex, bis es vollständig gelöst ist, bildet eine klare Lösung. Poly-L-Lysin (PLL) kann anstelle der PLO für diesen Schritt, der in ähnlichen Niveaus von Permselektivität Ergebnissen verwendet werden.
- Übertragen Sie die Alginat-Mikrokugeln in die PLO-Lösung. Platz auf einem Vortex für 30 Minuten, damit sich die PLO genügend Zeit, um mit dem Alginat interagieren und bilden eine Polykation-Polyanion-Komplex. Am Ende der 30 Minuten, sollte es eine deutlich sichtbare weiße Beschichtung um die Alginat-Mikrokugeln sein.
- Entfernen Sie die PLO-Lösung, und führen Sie drei Waschungen mit 0,2% CaCl 2 in normaler Kochsalzlösung für zwei Minuten.
3. Erstellen der Outer Alginat LayER
- Planen einer Alginatlösung einer gewünschten Konzentration, die verwendet werden, um die äußere Schicht zu erzeugen ist. Die Lösung wird hergestellt, wie in (1.1) beschrieben. Die Größe der äußeren Schicht wird durch die Zusammensetzung und Konzentration von Alginat verwendet (3) beeinflusst.
- Übertragen der Alginat-Mikrokugeln auf eine Zelle-Sieb. Mit einem Kimwipe um überschüssige Lösung zu absorbieren, um die Mikroperlen so weit wie möglich zu trocknen.
- Übertragen Sie die Mikrokugeln zu einem Parafilm Oberfläche. Andere glatten Oberflächen wie Glas oder einer Kunststoff-Petrischale für Parafilm substituiert sein kann, falls gewünscht.
- Übertragen Sie die Alginat-Lösung in (3,1) auf die Alginat-Mikrokugeln vorbereitet. Das Volumen der Alginat-Lösung werden sollte vollständig abdecken Alginat-Mikrokugeln. Wir bleiben die Mikrokügelchen in der Alginat-Lösung für 45 Minuten.
- Mit einer Pipette, um die überschüssige Alginat-Lösung nicht auf die Mikroperlen gebunden zu entfernen.
- Übertragen Sie die Mikrokügelchen inZu einer Lösung von 22 mm CaCl 2. Diese vernetzt das Alginat-Lösung in der Umgebung der Mikrokügelchen, was zur Bildung der verschiedenen äußeren Schicht Alginat.
- Führen Sie drei Wäschen mit 22 mM CaCl 2 in normaler Kochsalzlösung für zwei Minuten. Anzeigen der Mikrokügelchen unter einem Mikroskop sollte für eine bestimmte äußere Alginat zu bildende Schicht um den Kern Mikrokügelchen gesehen werden können.
4. Repräsentative Ergebnisse
1. Eine schematische Darstellung des Verfahrens zum Erstellen mehrschichtigen Alginat-Mikrokugeln. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010).
2. (A) und (B) Phasenkontrastaufnahmen der Alginat-Mikrokugeln. (A) zeigt eine Mikroperlenach der Synthese der Schritt (1.7), während (B) zeigt eine deutliche äußeren Alginatschicht vorliegenden nach Beendigung des Schrittes (3,7). (C) ein FITC Bild von fluoreszenzmarkierten BSA-Protein in der äußeren Schicht eingekapselt. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010).
3. Die Größe des äußeren Alginat-Schicht kann bezogen auf die Zusammensetzung und Konzentration von Alginat variiert werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass für LVM und LVG Alginat, die äußere Schicht Größe zunehmen Alginatkonzentration, und daß LVG Alginat dickeren äußeren Schichten liefert als LVM Alginat bei gleichen Konzentrationen. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010).
4. Freigabe von FGF-1, einem angiogenen Wachstumsfaktor-Proteins, von der äußeren Schicht variiert Alginat bezogen auf die Konzentration der LVM und LVG Alginat verwendet. (A) und (B) zeigen prozentuale Freisetzung, und (C) und (D) bezeichnen die entsprechende Masse Freisetzung von FGF-1 gegen die Zeit für verschiedene äußere Schicht Formulierungen. Es gibt eine Burst-Release für alle Bedingungen innerhalb der ersten 5 h (A und C) ausgestellt, und niedrig dosierte kontinuierliche Freisetzung für bis zu 30 Tage (B und D). Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. November;. 95 (2), 632-40 (2010) Hier klicken, um größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Alginat ist ein natürliches, saures Polysaccharid aus Algen extrahiert und aus Einheiten von 1,4 '-β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G) 2,3 besteht. Einfache Gelierung auftritt, wenn zweiwertigen Kationen, wie Ca 2 +, Sr 2 + oder Ba 2 + interagieren mit G-Monomeren unter Bildung ionischer Brücken zwischen benachbarten Alginatketten. Mikrokugeln aus Alginat verwendet worden, um eine Vielzahl von Proteinen, einschließlich Fibroblasten-Wachstumsfaktor-1 (FGF-1), Nerven-Wachstumsfaktor, Leukämie inhibierender Faktor, den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und zur Verkapselung von Zellen, einschließlich Chondrozyten, Hepatozyten zu liefern und Inselchen. Vorteile der Verwendung eines solchen Mikropartikels Polymersystem sind der Schutz der Proteine und Zellen aus und Reaktionsprodukte im Körper, kleine Partikel-Volumen erlaubt eine einfache Verabreichung durch Injektion, und die Steuerung des gelösten Stoffes Diffusion durch die Manipulation der physikalischen Eigenschaften des Materials.
Alginat-Mikrokugeln mit einem beschichteten permselektive Polymerschicht sind derzeit in klinischen Studien zur Behandlung von Typ-I-Diabetes. Allerdings ist die langfristige Lebensfähigkeit der transplantierten Inseln gekapselten abhängig, zum Teil auf seiner Fähigkeit, Sauerstoff und Nährstoffen aus einer vaskulären Blutversorgung zu erwerben. Biomaterial, das gleichzeitig dazu dienen können als Umhüllung für Inseln sowie eine anhaltende Abgabe für angiogenen Proteine können Gefäßwachstum in der Umgebung der transplantierten Zellen zu stimulieren, was zu einer verbesserten Lebensfähigkeit Transplantats. Persistent Neovaskularisierung erfordert die verzögerte Freisetzung von FGF-1 anstelle eines einzelnen Bolus-Verabreichung. In diesem JoVE Artikel stellen wir einen Ansatz zur Erzeugung von vielschichtigen Alginat-Mikrokugeln (Abbildung 1). Die äußere Schicht kann für die Verkapselung und Freisetzung von FGF-1 verwendet werden, während die innere Schicht für die Immunisolierung von Insel-Transplantationen verwendet werden können (Abbildung 2
Unser Labor hat bereits gezeigt, dass eine verzögerte Freisetzung des FGF-1 als eine hohe-Bolus-Verabreichung des Proteins führt zu einer anhaltenden mikrovaskulären Netzwerk Reaktion 4-6. Das hier beschriebene System kann verwendet werden, um eine äußere Schicht für die Lieferung von angiogenen Proteine, wie FGF-1 (2) zu erzeugen. Die Größe der äußeren Schicht kann auf der Basis der Zusammensetzung und Konzentration von Alginat verwendet (3) veränderbar ist. Die Größe dieses äußere Schicht könnte eine wichtige Rolle für den Erfolg der Systeme zu spielen. Eigenschaften der äußeren Schicht beeinflussen könnten sowohl die Freisetzung von therapeutischen Moleküle in das umgebende Gewebe und den Transport von Nährstoffen und Signalmolekülen zu den Zellen in der inneren Alginat. Die äußere Schicht sollten die Eigenschaften für eine gegebene Anwendung optimiert werden. Für die Lieferung von FGF-1, konnte zur verzögerten Freisetzung für bis zu 30 Tage in Abhängigkeit von der Alginat-Form erreicht werdenordnung (Abbildung 4) 7, 8.
Klinische Studien mit kleinen Inseln in Alginat-Mikrokapseln eingekapselt haben einige Versprechen für die Behandlung von Diabetes Typ I gezeigt. Allerdings sind viele kleine Inseln für die Wirksamkeit erforderlich wegen der schlechten Überleben nach der Transplantation. Die Fähigkeit, kleine Inseln in mehrschichtigen Mikrokapseln, in denen eine angiogene Protein aus der äußeren Schicht freigesetzt wird kapseln kann Verbesserung der Lebensfähigkeit der transplantierten Inseln. Diese verbesserte Rentabilität konnte die Zahl der Inseln für die Behandlung erforderlich ist, erhöht den potenziellen klinischen Auswirkungen und die Verfügbarkeit dieser Therapien.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch das US Department of Veterans Affairs (Washington DC), Zuschüsse 0852048, 0731201, 0854430 und von der National Science Foundation (Arlington, VA), und Grant RO1 DK080897 von den National Institutes of Health (Bethesda, MD) unterstützt . Herr Khanna erhielt Unterstützung von einer großzügigen Spende von Herrn Edward Ross und Dr. Monica Moya von der Bill & Melinda Gates Foundation (Seattle, WA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
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