Summary
En las secciones siguientes, se describen procedimientos para la preparación de microesferas de alginato para su uso en aplicaciones biomédicas. En especial, ilustran una técnica para la creación de múltiples capas de alginato microesferas para el doble propósito de la celda y la encapsulación de proteínas como un posible tratamiento para la diabetes tipo 1.
Abstract
A base de alginato-materiales han recibido una atención considerable para aplicaciones biomédicas debido a su naturaleza hidrofílica, biocompatibilidad, y la arquitectura física. Las aplicaciones incluyen la encapsulación de células, la administración de fármacos, la cultura de células madre, y los andamios de ingeniería de tejidos. De hecho, los ensayos clínicos se están realizando actualmente en el que los islotes son encapsulados en microesferas de alginato de la OLP, recubiertos en el tratamiento de la diabetes tipo. Sin embargo, un gran número de islotes son necesarios para la eficacia debido a la pobre trasplante siguiente supervivencia. La capacidad de estimular la formación a nivel local red microvascular alrededor de las células encapsuladas pueden aumentar su viabilidad a través de la mejora del transporte de oxígeno, glucosa y otros nutrientes vitales. De crecimiento de fibroblastos factor-1 (FGF-1) es un factor de crecimiento natural que es capaz de estimular la formación de vasos sanguíneos y mejorar los niveles de oxígeno en los tejidos isquémicos. La eficacia de la FGF-1 se incrementa cuando se entrega en una sustla moda ained en lugar de una sola gran bolo de la administración. El local a largo plazo la liberación de factores de crecimiento de los sistemas de encapsulación de los islotes podría estimular el crecimiento de los vasos sanguíneos directamente a las células trasplantadas, lo que podría mejorar los resultados funcionales del injerto. En este artículo, se describen procedimientos para la preparación de microesferas de alginato para su uso en aplicaciones biomédicas. Además, se describe un método que hemos desarrollado para la generación de microperlas multicapa de alginato. Las células pueden ser encapsulados en el núcleo de alginato interior, y las proteínas angiogénicas en la capa de alginato exterior. La liberación de proteínas a partir de esta capa exterior que estimula la formación de redes locales de microvasculares directamente hacia los islotes trasplantados.
Protocol
El protocolo aquí se describe un procedimiento en tres fases para la generación de microperlas multicapa de alginato (Figura 1). En primer lugar, microperlas de alginato se forman (Figura 2A). Este procedimiento se describe en la sección 1 de abajo. Las células o proteínas se pueden añadir a las microperlas en este paso con el fin de actuar como un sistema de suministro. El siguiente paso implica la formación de una capa de permeabilidad selectiva sobre las microperlas y se describe en la sección 2. El paso final implica la formación de una capa adicional de alginato y se describe en la sección 3. Esto forma una capa en el exterior de la superficie de las perlas (Figura 2B) se puede utilizar para encapsular y entregar las moléculas terapéuticas (Figura 2C) para dirigir la respuesta celular al trasplante de los siguientes sistemas.
1. Preparación microesferas de alginato
- Preparar una solución al 1,5% (w / v) de LVM alginato disolviendo 15 gramos de alginato MVI en 1 ml decapa interior solución de alginato (25 mM de tampón HEPES, 118 mM de NaCl, 5,6 mM de KCl, y 2,5 mM de MgCl 2 en agua DI, se ajustó a pH 7,4). Mezclar en un vórtice hasta que el poder de alginato ha disuelto completamente para formar una solución transparente y viscoso. Nota: Este protocolo describe las condiciones óptimas para la encapsulación de islotes dentro de microcápsulas de alginato 1 La concentración y la composición del alginato microesferas pueden ser alterados para ajustar las propiedades para otras aplicaciones (por ejemplo, la entrega de drogas, la ingeniería de tejidos, etc). Nota: Para encapsulación islote los islotes se puede añadir a la solución de alginato en este paso previo a la carga en el microencapsulator.
- Preparar la solución de reticulación (22 mM de CaCl 2 en agua DI) por disolución de 100 mM de CaCl 2 y 10 mM de tampón HEPES en agua desionizada y ajustar a pH 7,4. Nota: otros cationes divalentes tales como Br 2 +, Sr 2, etc + puede utilizarse en lugar de Ca 2 +, dependiendo de la naturaleza de la gelificación de alginato deseado.
- Establecer los dos canales de aire chaqueta microencapsulator alginato mediante la adición de una aguja de calibre 25 a una jeringa, y ajustar las válvulas en cada lado para asegurarse de que la aguja está en el centro de la chaqueta de aire. Diferentes agujas de calibre puede ser utilizado para este paso, dependiendo del tamaño de microperlas de alginato dirigidos.
Este paso puede realizarse también con una jeringa, no debe ser un microencapsulator disponible. Añadir la solución de alginato a la jeringa, y seleccionar una aguja de calibre en función del tamaño de microperlas deseados. - Colocar un matraz que contenía 10 ml de solución de reticulación directamente debajo de la aguja. Coloque una barra de agitación en la solución.
- Inyectar gotitas directamente en la solución de CaCl 2 a fin de reticular el alginato para formar microperlas. Incubar las perlas en la solución de reticulación para curar por lo menos quince minutos, con agitación continua.
- Transferir las perlas a un tubo de centrífuga de 15 ml. Retire la solución residual,y llevar a cabo tres lavados con un 0,2% de CaCl 2 en solución salina normal durante dos minutos cada uno.
2. Recubrimiento las microperlas con poli-L-ornitina
- Preparar 3 ml de una solución al 0,1% (w / v) de poli-L-ornitina (OLP) en solución salina normal. Colocar la solución en un vórtice, hasta que se disuelva completamente, formando una solución clara. Poli-L-lisina (PLL) se puede utilizar en lugar de OLP para este paso, que se traduce en niveles similares de permeselectividad.
- Transferencia de las microesferas de alginato en la solución de la OLP. Colocar en un vórtice durante 30 minutos para permitir que el tiempo OLP suficiente para interactuar con el alginato, formando un complejo policatión-polianión. Al final de 30 minutos, debe haber una capa de pintura blanca claramente visible alrededor de las microperlas de alginato.
- Eliminar la solución OLP, y realizar tres lavados con 0,2% de CaCl 2 en solución salina normal durante dos minutos cada uno.
3. Crear el alginato exterior Layer
- Preparar una solución de alginato de concentración deseada que va a ser utilizado para crear la capa exterior. La solución se prepara como se describe en (1,1) por encima. El tamaño de la capa exterior está influenciada por la composición y concentración de alginato utilizado (Figura 3).
- Transferir las microperlas de alginato a una celda-tamiz. Utilizar un Kimwipe para absorber el exceso de solución con el fin de secar las microperlas tanto como sea posible.
- Transferir las microperlas a una superficie Parafilm. Otras superficies lisas tales como vidrio o incluso una placa Petri de plástico puede ser sustituido por Parafilm, si se desea.
- Transferir la solución de alginato preparado en (3,1) en las microperlas de alginato. El volumen de solución de alginato se debe cubrir completamente las microperlas de alginato. Que las microperlas permanecer en la solución de alginato durante 45 minutos.
- Utilizar una pipeta para retirar el exceso de solución de alginato no unido a las microperlas.
- Transferencia de las microesferas en ela una solución de 22 mm de CaCl 2. Este reticula la solución de alginato alrededor de las microperlas, resultando en la formación de la capa de alginato exterior distinta.
- Realizar tres lavados con 22 mM CaCl 2 en solución salina normal durante dos minutos cada uno. Visualización de las microperlas con un microscopio debe permitir una capa de alginato distinto exterior para ser visto formado alrededor de la microperla núcleo.
4. Los resultados representativos
Figura 1. Un esquema del procedimiento para la creación de microperlas multicapa de alginato. Reproducido con permiso de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. noviembre; 95 (2), 632-40 (2010).
Figura 2. (A) y (B) son imágenes de contraste de fase de microperlas de alginato. (A) muestra una microperladespués de la síntesis paso (1,7), mientras que (B) muestra una capa distinta alginato exterior presente después de la finalización de la etapa (3,7). (C) es una imagen con FITC de proteína marcada con fluorescencia de BSA encapsulado en la capa exterior. Reproducido con permiso de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. noviembre; 95 (2), 632-40 (2010).
Figura 3. El tamaño de la capa exterior de alginato puede ser variado basado en la composición y concentración de alginato utilizado. Nuestros resultados muestran que, tanto para LVM y alginato de LVG, los aumentos de la capa exterior de tamaño con cada vez mayor concentración de alginato, y que el alginato LVG produce gruesas capas exteriores de alginato de LVM en concentraciones iguales. Reproducido con permiso de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. noviembre; 95 (2), 632-40 (2010).
Figura 4. Publicación de FGF-1, una proteína del factor de crecimiento angiogénico, desde la capa exterior de alginato variado basado en la concentración de LVM y alginato LVG utilizado. (A) y (B) muestran liberación por ciento, y (C) y (D) denotan la liberación masa correspondiente de FGF-1 frente al tiempo para diferentes formulaciones capa exterior. Hay un comunicado de explosión en todas las condiciones expuestas en la inicial de 5 h (A y C) y bajas dosis de liberación continua durante un máximo de 30 días (B y D). Reproducido con permiso de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. noviembre;. 95 (2), 632-40 (2010) Haga clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
El alginato es un polisacárido natural, ácido extraído de las algas y se compone de unidades de 1,4 '-β-D-manurónico ácido (M) y α-L-gulurónico ácido (G) 2,3. Gelificación simple se produce cuando los cationes divalentes, como el Ca 2 +, Sr 2 +, o Ba 2 + interactuar con G-monómeros que forman puentes iónicos entre las cadenas de alginato adyacentes. Microesferas de alginato se han utilizado para ofrecer una variedad de proteínas, incluyendo el crecimiento de fibroblastos factor-1 (FGF-1), factor de crecimiento nervioso, factor inhibidor de la leucemia, el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), y para la encapsulación de células incluyendo condrocitos, hepatocitos y los islotes. Las ventajas de utilizar un sistema de micropartículas de polímero incluyen la protección de las proteínas y células de la degradación y la reacción en el cuerpo, el volumen de partícula pequeño que permite una fácil administración a través de la inyección, y el control de la difusión de solutos por la manipulación de las propiedades físicas del material.
Alginato de microesferas recubiertas con una capa de polímero de permeabilidad selectiva se encuentran actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de la diabetes tipo I. Sin embargo, la viabilidad a largo plazo de trasplantados islotes encapsulados es dependiente, en parte, de su capacidad de adquirir oxígeno y nutrientes a partir de un suministro de sangre vascular. Un sistema de biomaterial que puede servir simultáneamente como un sistema de encapsulación de islotes, así como un sistema de liberación sostenida para las proteínas angiogénicos pueden estimular el crecimiento vascular alrededor de las células trasplantadas, resultando en la viabilidad del injerto mejorada. Neovascularización persistente requiere la liberación sostenida de FGF-1 en lugar de una sola administración en bolo. En este artículo Jove, se presenta un enfoque para la generación de microesferas de alginato de varias capas (Figura 1). La capa exterior puede ser utilizado para la liberación sostenida de la encapsulación y el FGF-1 mientras que la capa interna puede ser utilizado para el inmunoaislamiento de los trasplantes de islotes (Figura 2
Nuestro laboratorio ha demostrado previamente que una liberación sostenida de FGF-1 en lugar de una administración de alta bolo de las proteínas, resulta en una respuesta de la red microvascular persistente 4-6. El sistema descrito aquí puede ser usado para generar una capa externa para la entrega de las proteínas angiogénicas, tales como FGF-1 (Figura 2). El tamaño de la capa exterior se puede variar basado en la composición y concentración de alginato utilizado (Figura 3). El tamaño de esta capa exterior podría jugar un papel importante en el éxito de los sistemas. Propiedades de la capa exterior podría influir tanto la liberación de moléculas terapéuticas en el tejido circundante y el transporte de nutrientes y moléculas de señalización a las células en el interior de alginato. Las propiedades de las capas exteriores tendrá que ser optimizado para una aplicación dada. Para la entrega de FGF-1, de liberación sostenida puede lograrse por hasta 30 días dependiendo de la forma de alginatopoblación (Figura 4) 7, 8.
Los ensayos clínicos utilizando islotes encapsulados en microcápsulas de alginato se han mostrado alguna promesa como un tratamiento para la diabetes tipo I. Sin embargo, un gran número de islotes son necesarios para la eficacia debido a la mala supervivencia después del trasplante. La capacidad para encapsular islotes en microcápsulas multicapa en la que se libera una proteína angiogénica de la capa exterior puede mejorar la viabilidad de los islotes trasplantados. Esta mejora de la viabilidad podría reducir el número de islotes necesarios para el tratamiento, aumentando el impacto potencial clínico y la disponibilidad de estas terapias.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por los EE.UU. Departamento de Asuntos de Veteranos (Washington DC), las subvenciones 0852048 y 0731201, y 0854430 de la National Science Foundation (Arlington, VA), y, subvención RO1 DK080897 de los Institutos Nacionales de Salud (Bethesda, MD) . El Sr. Khanna recibido el apoyo de una generosa donación por el Sr. Eduardo Ross y la Dra. Mónica Moya de la Fundación Bill y Melinda Gates (Seattle, WA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
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