Summary
I de følgende afsnit, skitsere vi procedurer for udarbejdelse af alginat mikrosfærer til brug i biomedicinske anvendelser. Vi specifikt illustrerer en teknik til at skabe flerlaget alginat mikrosfærer til det dobbelte formål at celle-og protein indkapsling som en potentiel behandling af type 1 diabetes.
Abstract
Alginat-baserede materialer har fået betydelig opmærksomhed til biomedicinske anvendelser på grund af deres hydrofile natur, biokompatibilitet og fysiske struktur. Anvendelser omfatter celleindkapsling, drug delivery, stamcelle kultur, og vævs-engineering scaffolds. Faktisk er kliniske forsøg øjeblikket udføres der øer er indkapslet i PLO overtrukne alginat mikroperler som en behandling af type I diabetes. Imidlertid stort antal øer kræves for effektivitet på grund af dårlige overlevelse efter transplantation. Evnen til lokalt at stimulere mikrovaskulære netværksdannelse omkring de indkapslede celler kan øge deres levedygtighed gennem forbedret transport af ilt, glucose og andre vitale næringsstoffer. Fibroblast vækstfaktor-1 (FGF-1) er en naturligt forekommende vækstfaktor, der er i stand til at stimulere blodkardannelse og forbedre iltindholdet i iskæmiske væv. Virkningen af FGF-1 forøges, når den afgives med en Sustained måde snarere end en enkelt stor-bolusindgivelse. Den lokale langvarig frigivelse af vækstfaktorer fra ø indkapslingssystemer kan stimulere væksten af blodkar direkte mod de transplanterede celler, som potentielt forbedrer funktionelle podede resultater. I denne artikel skitsere vi procedurer for udarbejdelse af alginat mikrosfærer til brug i biomedicinske anvendelser. Herudover beskriver vi en fremgangsmåde vi udviklet til generering af flerlags alginat mikroperler. Celler kan indkapsles i det indre alginat kerne og angiogene proteiner i den ydre alginat lag. Frigivelse af proteiner fra dette ydre lag vil stimulere dannelsen af lokale mikrovaskulære net direkte mod de transplanterede øer.
Protocol
Protokollen her beskriver en tre-trins procedure til generering af flerlags alginat mikroperler (figur 1). Først bliver alginat mikroperler dannet (figur 2A). Denne procedure er beskrevet i afsnit 1 nedenfor. Celler eller proteiner kan tilsættes til mikroperlerne i dette trin, for at virke som et afgivelsessystem. Det næste trin involverer dannelsen af en permselektiv lag på mikroperlerne og er beskrevet i afsnit 2. Det sidste trin indebærer dannelsen af en ekstra alginat lag og er beskrevet i afsnit 3. Dette lag dannes på ydersiden af overfladen af perlerne (figur 2B) kan anvendes til at indkapsle og levere terapeutiske molekyler (figur 2C) til at dirigere cellulær reaktion til systemet efter transplantation.
1. Alginat mikroperlen Forberedelse
- Fremstilling af en 1,5% (w / v) LVM alginat-opløsning ved at opløse 15 g LVM alginat i 1 mlinderlag alginat-opløsning (25 mM HEPES-buffer, 118 mM NaCl, 5,6 mM KCI og 2,5 mM MgCl2 i DI-vand, justeret til pH 7,4). Bland på en hvirvelomrøreren indtil alginatet strømmen er fuldstændig opløst til dannelse af en klar, viskøs opløsning. Bemærk: Denne protokol beskriver betingelserne optimale for holm indkapsling inden alginatmikrokapsler 1 Koncentrationen og sammensætningen af alginat mikrokugler kan ændres til at tune ejendomme til andre formål (f.eks drug delivery, tissue engineering, osv.). Bemærk: For holm indkapsling holme kan sættes til alginatopløsningen ved dette trin før påsætning på microencapsulator.
- Klargør tværbinding opløsning (22 mM CaCl2 i DI vand) ved at opløse 100 mM CaCl2 og 10 mM HEPES-buffer i DI-vand og justering til pH 7,4. Bemærk: andre divalente kationer, såsom Br2 +, Sr2 + osv. kan anvendes i stedet for Ca2 +, afhængigt af arten af alginat gelering desired.
- Oprettet tokanals luft kappe alginat microencapsulator ved tilsætning af en 25-gauge nål på en sprøjte, og justere ventilerne på hver side for at sikre at nålen er i midten af luften kappen. Forskellige gauge nåle kan anvendes til dette trin, afhængigt af størrelsen af alginat målrettede mikroperler.
Dette trin kan også udføres med en sprøjte, skal en microencapsulator ikke tilgængelige. Tilsættes alginatopløsningen til sprøjten, og vælge en nålestørrelse baseret på størrelsen af ønskede mikroperler. - Placere en kolbe indeholdende 10 ml af tværbinding opløsning direkte under nålen. Placere en omrørerstav i opløsningen.
- Injicer dråber direkte i CaCl2-opløsning for at tværbinde alginatet til dannelse af mikroperler. Inkubér perlerne i tværbindingsopløsningen hærde i mindst femten minutter med kontinuerlig omrøring.
- Overfør perlerne til et 15 ml centrifugerør. Fjernelse af den resterende opløsning,og udføre tre vaskninger med 0,2% CaCl2 i normal saltvandsopløsning i to minutter hver.
2. Overtrækning af mikroperler med Poly-L-ornithin
- Fremstilling af 3 ml af en 0,1% (w / v) opløsning af poly-L-ornithin (PLO) i normalt saltvand. Placere opløsningen på en vortex indtil det er fuldstændigt opløst, hvorved der dannes en klar opløsning. Poly-L-lysin (PLL) kan anvendes i stedet for PLO for dette trin, hvilket resulterer i tilsvarende niveauer af permselektivitet.
- Overfør alginat mikroperlerne i PLO løsning. Sted på en Vortex i 30 minutter for at tillade PLO tilstrækkelig tid til at vekselvirke med alginatet til dannelse af en polykation-polyanion kompleks. Ved slutningen af 30 minutter, bør der være en tydelig synlig hvid belægning rundt alginat mikroperler.
- Fjerne PLO opløsningen, og udføre tre vaskninger med 0,2% CaCl2 i normalt saltvand i to minutter hver.
3. Oprettelse af Ydre Alginatbandager Layis
- Fremstilling af en alginat-opløsning med den ønskede koncentration, der skal anvendes til at skabe det ydre lag. Opløsningen fremstilles som beskrevet i (1.1) ovenfor. Størrelsen af det ydre lag er påvirket af sammensætningen og koncentrationen af alginat, der anvendes (fig. 3).
- Overfør alginat mikrokugler til en celle-si. Anvender en Kimwipe at absorbere overskydende opløsning for at tørre mikrokugler så meget som muligt.
- Overfør mikroperler med en Parafilm overflade. Andre glatte overflader, såsom glas eller endog en plast Petri-skål kan substitueres med Parafilm, hvis det ønskes.
- Overfør alginatopløsningen fremstillet i (3,1) på alginat mikroperler. Volumenet af alginat-opløsning bør fuldstændigt at dække alginat mikroperler. Lod mikroperlerne forbliver i alginatopløsningen i 45 minutter.
- Anvende en pipette for at fjerne overskydende alginatopløsningen ikke er bundet til mikroperlerne.
- Overføre mikroperler iTil en opløsning af 22 mm CaCl2. Dette tværbinder alginatopløsningen omkring mikroperler, hvilket resulterer i dannelsen af særskilte ydre alginat lag.
- Udføre tre vaskninger med 22 mM CaCl2 i normalt saltvand i to minutter. Visning af mikroperler under et mikroskop bør muliggøre en særskilt ydre alginat lag ses dannes rundt om kernen mikroperle.
4. Repræsentative resultater
Figur 1. En skematisk afbildning af fremgangsmåden til at skabe flerlags alginat mikroperler. Gengivet med tilladelse fra Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010).
Figur 2 (a) og (B) er fasekontrast billeder af alginat mikroperler. (A) viser en mikroperleEfter syntese trin (1,7), medens (B) viser en særskilt ydre alginat lag til stede efter afslutning af trin (3.7). (C) er en FITC billede af fluorescens-mærket BSA protein indkapslet i det ydre lag. Gengivet med tilladelse fra Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010).
Figur 3. Størrelse af det ydre alginat lag kan varieres baseret på sammensætningen og anvendte koncentration af alginat. Vore resultater viser, at både LVM og LVG alginat, det ydre lag størrelse med stigende alginatkoncentration, og at LVG alginat giver tykkere ydre lag end LVM alginat lige store koncentrationer. Gengivet med tilladelse fra Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010).
Figur 4. Frigivelse af FGF-1, en angiogen vækstfaktor protein fra den ydre alginat lag varieres baseret på koncentrationen af LVM og LVG alginat anvendt. (A) og (B) viser procent frigivelse, og (C) og (D) betegne tilsvarende masse frigivelse af FGF-1 versus tid for forskellige ydre lag formuleringer. Der er en eksplosiv frigivelse udviste alle forhold i den første 5 timer (A og C) og lav dosis kontinuerlig frigivelse i op til 30 dage (B og D). Gengivet med tilladelse fra Khanna et al. J Biomed Mater Res A. november;. 95 (2), 632-40 (2010) Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alginat er en naturlig, surt polysaccharid udvundet af alger og består af enheder med 1,4 '-β-D-mannuronsyre (M) og α-L-guluronsyre (G) 2,3. Simple gelering finder sted, når divalente kationer, såsom Ca2 +, Sr2 + eller Ba2 + interagerer med G-monomererne, der danner ioniske broer mellem hosliggende alginat kæder. Mikroperler af alginat har været anvendt til at levere en række proteiner, herunder fibroblast vækstfaktor-1 (FGF-1), nervevækstfaktor, leukæmi inhibere faktor, vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), og til indkapsling af celler, herunder chondrocytter, hepatocytter og holme. Fordelene ved at anvende sådan en mikropartikel polymersystem omfatter beskyttelse af proteiner og celler fra nedbrydning og reaktionen i kroppen, lille partikelstørrelse volumen tillader nem indgivelse ved injektion, og kontrol af opløst stof diffusion ved manipulation af de fysiske egenskaber af materialet.
Alginat mikrosfærer overtrukket med en permselektiv polymerlag er tiden i kliniske forsøg til behandling af type I diabetes. Imidlertid langsigtede levedygtighed af transplanterede indkapslede øer afhænger til dels af dets evne til at erhverve oxygen og næringsstoffer fra en vaskulær blodforsyning. Et biomaterialet system, der kan tjene samtidigt som en indkapsling for øvævsceller samt en vedvarende afgivelsessystem for angiogene proteiner kan stimulere vaskulær vækst omkring de transplanterede celler, hvilket resulterer i forbedret implantat levedygtighed. Vedvarende neovaskularisering kræver vedvarende frigivelse af FGF-1 i stedet for en enkelt bolus-administrering. I denne JOVE artiklen, præsenterer vi en metode til at generere flerlagede alginat mikrokugler (figur 1). Det ydre lag kan anvendes til indkapsling og vedvarende frigivelse af FGF-1, mens det indre lag kan anvendes til immunisolering af ø-transplantater (figur 2
Vores laboratorium har tidligere vist, at en langvarig afgivelse af FGF-1 i stedet for en høj-bolus indgivelse af proteiner, resulterer i en vedvarende mikrovaskulær netværk respons 4-6. Den her beskrevne system kan anvendes til at frembringe et ydre lag til levering af angiogene proteiner, såsom FGF-1 (figur 2). Størrelsen af det ydre lag kan varieres baseret på sammensætningen og koncentrationen af alginat, der anvendes (fig. 3). Størrelsen af denne ydre lag kunne spille en vigtig rolle for succesen af systemerne. Egenskaber af det ydre lag kan påvirke både frigivelse af terapeutiske molekyler i det omgivende væv og til transport af næringsstoffer og signaleringsmolekyler til cellerne i den indre alginat. Det ydre lag egenskaber skal være optimeret for en given anvendelse. Til afgivelse af FGF-1, kan vedvarende frigivelse opnås op til 30 dage afhængig af alginat formularenning (figur 4) 7, 8.
Kliniske forsøg med øer indkapslet i alginat-mikrokapsler har vist nogle lovende som en behandling for type I diabetes. Imidlertid stort antal øer kræves til effektivitet på grund af ringe overlevelse efter transplantation. Evnen til at indkapsle øer i flerlags mikrokapsler, hvori en angiogen protein frigives fra det ydre lag kan forbedre levedygtigheden af transplanterede øer. Denne forbedrede levedygtighed vil kunne reducere antallet af øer, der kræves for behandling, øge potentielle kliniske betydning og tilgængeligheden af disse behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af US Department of Veterans Affairs (Washington DC), tilskud 0852048 og 0731201, og 0854430 fra National Science Foundation (Arlington, VA), og tilskud RO1 DK080897 fra National Institutes of Health (Bethesda, MD) . Mr. Khanna modtaget støtte fra en generøs donation af Mr. Edward Ross og Dr. Monica Moya fra Bill & Melinda Gates Foundation (Seattle, WA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads. J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation. Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).
- Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration. Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).
- Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering. Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells. Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1. J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).
