Summary
Nas seções seguintes, que definirá procedimentos para a preparação de microesferas de alginato para uso em aplicações biomédicas. Nós especificamente ilustram uma técnica para a criação de várias camadas de alginato microesferas para a dupla finalidade de célula e de encapsulamento proteína como um tratamento potencial para a diabetes tipo 1.
Abstract
Materiais à base de alginato têm recebido atenção considerável para aplicações biomédicas devido à sua natureza hidrofílica, biocompatibilidade e arquitetura física. As aplicações incluem encapsulamento de células, a entrega da droga, a cultura de células estaminais, e andaimes de engenharia de tecidos. De facto, os ensaios clínicos estão actualmente a ser executada em que ilhotas são encapsuladas em micro-esferas de alginato PLO revestidos como um tratamento de diabetes do tipo I. No entanto, um grande número de ilhéus são necessários para a eficácia devido ao transplante pobre sobrevivência seguinte. A capacidade de estimular a formação da rede localmente microvascular em torno das células encapsuladas podem aumentar a sua viabilidade através do transporte melhorado de oxigénio, glicose e outros nutrientes essenciais. Factor de crescimento de fibroblastos-1 (FGF-1) é um factor de crescimento de ocorrência natural que é capaz de estimular a formação de vasos sanguíneos e melhorar os níveis de oxigénio nos tecidos isquémicos. A eficácia de FGF-1 é aumentada quando ele é entregue em um Sustmoda ained em vez de uma administração de grande bolus único. A liberação de longo prazo local de fatores de crescimento dos sistemas de encapsulamento de ilhotas pode estimular o crescimento de vasos sanguíneos diretamente para as células transplantadas, podendo melhorar os resultados funcionais dos enxertos. Neste artigo, descrevem procedimentos para a preparação de microesferas de alginato para uso em aplicações biomédicas. Além disso, nós descrevemos um método foi desenvolvido para a geração de micropérolas de alginato de multicamadas. As células podem ser encapsuladas em alginato o núcleo interior, e as proteínas angiogénicas na camada de alginato exterior. A libertação de proteínas a partir desta camada exterior poderia estimular a formação de redes locais de microvasculares directamente para as ilhotas transplantadas.
Protocol
O protocolo aqui descreve um procedimento em três passos para a geração de micropérolas de alginato de multicamadas (Figura 1). Em primeiro lugar, micropérolas de alginato são formados (Figura 2A). Este procedimento é descrito na secção 1 abaixo. Células ou proteínas podem ser adicionadas às microesferas neste passo, a fim de actuar como um sistema de entrega. O passo seguinte envolve a formação de uma camada de permeabilidade selectiva sobre os micro-esferas e é descrita na secção 2. O passo final envolve a formação de uma camada de alginato adicional e é descrito no ponto 3. Isso forma de camada sobre o exterior da superfície das pérolas (Figura 2B) pode ser usado para encapsular e entregar moléculas terapêuticas (Figura 2C) para dirigir a resposta celular ao transplante seguinte sistema.
1. Preparação microbead alginato
- Prepara-se uma 1,5% (w / v) de solução de alginato de MVE por dissolução de 15 gramas de alginato de MVE em 1 mL desolução de alginato interior camada (25 mM de tampão HEPES, 118 mM de NaCl, 5,6 mM de KCl, e 2,5 mM de MgCl2 em água DI, ajustada a pH 7,4). Agitar em Vortexer até que o poder de alginato foi totalmente dissolvido para formar uma solução límpida, viscosa. Nota: Este protocolo descreve condições óptimas para a encapsulação de ilhotas dentro microcápsulas de alginato 1 A concentração e composição do alginato microesferas podem ser alterados para ajustar as propriedades para outras aplicações (por exemplo, a entrega da droga, a engenharia de tecidos, etc). Nota: Para encapsulação de ilhotas as ilhotas pode ser adicionado à solução de alginato neste passo antes de carregar no microencapsulator.
- Preparar a solução de reticulação (22 mM de CaCl2 em água DI) por dissolução de 100 mM de CaCl2 e 10 mM de tampão HEPES em água DI e ajustando para pH 7,4. Nota: outros catiões divalentes tais como Br 2 +, Sr 2 etc + pode ser usado em vez de Ca 2 +, dependendo da natureza de alginato de gelificação desired.
- Configurar a dois canais de ar microencapsulator alginato revestimento por adição de uma agulha de calibre 25 a uma seringa, e ajustar as válvulas de cada lado para se certificar de que a agulha está no centro da camisa de ar. Agulhas de calibre diferentes podem ser usados para este passo, dependendo do tamanho de micropérolas de alginato alvo.
Este passo pode também ser realizada com uma seringa, não deve um microencapsulator estar disponível. Adicionar a solução de alginato para a seringa, e seleccionar uma agulha de calibre com base no tamanho de microsferas desejados. - Colocar um balão contendo 10 ml de solução de reticulação directamente debaixo da agulha. Colocar uma barra de agitação na solução.
- Injectar gotículas directamente na solução de CaCl2 a fim de reticular o alginato para formar microesferas. Incubar as esferas na solução de reticulação para curar durante pelo menos quinze minutos, com agitação contínua.
- Transferir as contas para um tubo de centrífuga de 15 mL. Remover a solução residual,e executar três lavagens com uma 2 CaCl 0,2% em solução salina normal durante dois minutos cada.
2. Revestimento das micropérolas com poli-L-ornitina
- Preparar 3 mL de uma solução a 0,1% (w / v) de poli-L-ornitina (PLO) em solução salina normal. Coloque a solução sobre um vórtice até que esteja completamente dissolvido, formando uma solução transparente. Poli-L-lisina (PLL) pode ser usado em vez de PLO para esta etapa, o que resulta em níveis semelhantes de permselectivity.
- Transferir as micropérolas de alginato na solução PLO. Colocar numa Vortex durante 30 minutos para permitir que o tempo PLO suficiente para interagir com o alginato, formando um complexo policatião polianião. No final dos 30 minutos, deve haver um revestimento nitidamente visível branco em torno das microesferas de alginato.
- Remover a solução PLO, e executar três lavagens com 0,2% de CaCl2 em solução salina normal durante dois minutos cada.
3. Criando o alginato Outer Layer
- Preparar uma solução de alginato de concentração desejada que é para ser usado para criar a camada exterior. A solução é preparada como descrito em (1.1) acima. O tamanho da camada exterior é influenciada pela composição e concentração de alginato utilizado (Figura 3).
- Transferir as micropérolas de alginato a uma célula do filtro. Usar uma Kimwipe para absorver o excesso de solução, a fim de secar as micropérolas tanto quanto possível.
- Transferir as micropérolas a uma superfície de Parafilm. Outros superfícies lisas, tais como vidro ou mesmo uma placa de Petri de plástico pode ser substituído por Parafilm, se desejado.
- Transferir a solução de alginato preparadas em (3.1) sobre os micro-esferas de alginato. O volume de solução de alginato de ser deve cobrir completamente as microesferas de alginato. Deixar que as micro-esferas permanecem na solução de alginato por 45 minutos.
- Usar uma pipeta para remover o excesso de solução de alginato não ligado às microesferas.
- Transferir as micropérolas ema uma solução de CaCl 22mm 2. Este reticula a solução de alginato em torno das microesferas, resultando na formação da camada de alginato distinta exterior.
- Executar três lavagens com 22 mM de CaCl2 em solução salina normal durante dois minutos cada. Vendo as micropérolas sob um microscópio deve permitir uma camada de alginato distinta exterior para ser visto formado em torno da micropérola núcleo.
4. Os resultados representativos
Figura 1. Um esquemática do procedimento para a criação de micropérolas de alginato de multicamadas. Reproduzido com a permissão de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. novembro; 95 (2), 632-40 (2010).
Figura 2. (A) e (B) são imagens de contraste de fase de micro-esferas de alginato. (A) mostra uma micropérolaapós o passo de síntese (1,7), enquanto que (B) mostra uma camada de alginato distinta exterior presente após a conclusão do passo (3,7). (C) é uma imagem de fluorescência FITC-BSA marcado proteína encapsulada na camada exterior. Reproduzido com a permissão de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. novembro; 95 (2), 632-40 (2010).
Figura 3. O tamanho da camada exterior de alginato pode ser variado em função da composição e concentração de alginato utilizado. Os nossos resultados mostram que, para ambos LVM e alginato LVG, os aumentos da camada exterior de tamanho com uma concentração de alginato de expansão e que, de alginato LVG produz mais espessas do que as camadas exteriores LVM alginato em concentrações iguais. Reproduzido com a permissão de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. novembro; 95 (2), 632-40 (2010).
Figura 4. De lançamento do FGF-1, uma proteína factor angiogénico crescimento, a partir da camada exterior de alginato variado em função da concentração de MVE e alginato LVG utilizado. (A) e (B) A libertação por cento mostra, e (C) e (D) denotam a libertação de massa correspondente de FGF-1 em função do tempo para diferentes formulações camada exterior. Existe uma libertação brusca exibiram para todas as condições dentro da inicial 5 h (A e C), e de baixa dose de libertação contínua para até 30 dias (B e D). Reproduzido com a permissão de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. novembro;. 95 (2), 632-40 (2010) Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
O alginato é um polissacárido natural, ácido extraído a partir de algas e é composto por unidades de 1,4 '-β-manurónico-D ácido (M) e α-L-gulurónico ácido (G) 2,3. Gelificação simples ocorre quando os catiões bivalentes, tais como Ca 2 +, Sr 2 +, Ba ou 2 + interagir com G-monómeros que formam pontes iónicas entre as cadeias de alginato adjacentes. Micropérolas de alginato têm sido utilizados para entregar uma variedade de proteínas, incluindo factor de crescimento de fibroblastos-1 (FGF-1), factor de crescimento do nervo, factor de inibição de leucemia, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), e para a encapsulação de células incluindo condrócitos, hepatócitos e ilhotas. Vantagens da utilização de um tal sistema de micropartículas de polímero incluem a protecção das proteínas e células provenientes de degradação ou de reacção no corpo de volume de partículas, permitindo pequeno para administração fácil por meio de injecção, e de controlo da difusão de soluto pela manipulação das propriedades físicas do material.
Revestidos com alginato microsferas com uma camada de polímero permeabilidade selectiva estão actualmente em ensaios clínicos para o tratamento de diabetes do tipo I. No entanto, a viabilidade a longo prazo de transplantados ilhotas encapsuladas é dependente, em parte, da sua capacidade para adquirir oxigénio e nutrientes a partir de um fornecimento de sangue vascular. Um sistema de biomaterial que pode servir simultaneamente como um sistema de encapsulamento para ilhotas, bem como um sistema de entrega sustentada de proteínas angiogénicas podem estimular o crescimento vascular em torno das células transplantadas, resultando na viabilidade do enxerto melhorada. Neovascularização persistente requer a libertação sustentada de FGF-1, em vez de uma administração em bolus único. Neste artigo Jove, apresentamos uma abordagem para a geração de micropérolas de alginato de multicamadas (Figura 1). A camada exterior pode ser usado para a libertação sustentada de encapsulamento e FGF-1, enquanto a camada interior pode ser utilizado para a imunoisolamento de transplantes de ilhotas (Figura 2
O nosso laboratório foi previamente mostrado que uma entrega sustentada de FGF-1, em vez de uma administração em bolo de alta das proteínas, resulta numa resposta da rede persistente microvascular 4-6. O sistema aqui descrito pode ser usado para gerar uma camada exterior para entrega de proteínas angiogénicas, como FGF-1 (Figura 2). O tamanho da camada exterior pode ser variado em função da composição e concentração de alginato utilizado (Figura 3). O tamanho desta camada exterior poderia desempenhar um papel importante no sucesso dos sistemas. Propriedades da camada exterior poderia influenciar tanto a libertação de moléculas terapêuticas para o tecido circundante e ao transporte de nutrientes e moléculas de sinalização para as células do alginato interior. As propriedades das camadas exteriores terão de ser otimizado para uma determinada aplicação. Para a entrega de FGF-1, de libertação sustentada pode ser alcançada por até 30 dias, dependendo da forma de alginatolação (Figura 4) 7, 8.
Os ensaios clínicos utilizando ilhotas encapsuladas em microcápsulas de alginato têm mostrado alguma promessa como um tratamento para a diabetes tipo I. No entanto, um grande número de ilhéus são necessárias para a eficácia por razões de sobrevivência após o transplante de pobre. A capacidade para encapsular ilhotas em microcápsulas de multicamadas em que uma proteína angiogénica é libertado a partir da camada exterior pode aumentar a viabilidade das ilhotas transplantadas. Esta melhoria da viabilidade poderia reduzir o número de ilhotas necessários para o tratamento, o aumento do potencial impacto clínico e disponibilidade destas terapias.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pelo Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA (Washington DC), as bolsas 0852048 e 0731201, 0854430 e da National Science Foundation (Arlington, VA), e conceder RO1 DK080897 do National Institutes of Health (Bethesda, MD) . Mr. Khanna recebeu apoio de uma generosa doação pelo Sr. Edward Ross e Monica Dr. Moya da Fundação Bill & Melinda Gates Foundation (Seattle, WA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
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