Summary
Dans les sections suivantes, nous décrivons les procédures pour la préparation d'alginate de microsphères pour une utilisation dans des applications biomédicales. Nous spécifiquement illustrent une technique pour créer alginate multicouche microsphères dans le double but de la cellule et l'encapsulation de protéines en tant que traitement potentiel pour les diabétiques de type 1.
Abstract
À base d'alginate matériaux ont reçu une attention considérable pour des applications biomédicales en raison de leur caractère hydrophile, biocompatibilité, et de l'architecture physique. Les applications comprennent l'encapsulation de cellules, l'administration de médicaments, de la culture de cellules souches, et les échafaudages en ingénierie tissulaire. En fait, les essais cliniques sont actuellement en cours d'exécution dans laquelle les îlots sont encapsulés dans des microbilles d'alginate recouvertes OLP en tant que traitement de diabète de type I. Cependant, un grand nombre d'îlots sont nécessaires pour l'efficacité en raison de la transplantation de survie suivant les pauvres. La capacité de stimuler la formation de réseau local microvasculaire autour des cellules encapsulées peut accroître leur viabilité grâce à l'amélioration des transports de l'oxygène, de glucose et d'autres nutriments essentiels. Facteur de croissance des fibroblastes-1 (FGF-1) est un facteur de croissance naturelle qui est capable de stimuler la formation de vaisseaux sanguins et d'améliorer les niveaux d'oxygène dans les tissus ischémiques. L'efficacité du FGF-1 est augmentée quand il est livré dans un sustla mode ained plutôt qu'un seul grand-administration en bolus. Le local à long terme la libération de facteurs de croissance à partir de systèmes d'encapsulation des îlots de Langerhans pourrait stimuler la croissance des vaisseaux sanguins directement vers les cellules transplantées, potentiellement améliorer les résultats fonctionnels greffés. Dans cet article, nous décrivons les procédures pour la préparation d'alginate de microsphères pour une utilisation dans des applications biomédicales. En outre, nous décrivons une méthode que nous avons développé pour générer des microbilles d'alginate multicouches. Les cellules peuvent être encapsulés dans le noyau alginate intérieure, et des protéines angiogéniques dans la couche d'alginate extérieure. La libération de protéines à partir de cette couche externe stimuler la formation de réseaux locaux de microvasculaires directement vers les îlots transplantés.
Protocol
Le protocole décrit ici une procédure en trois étapes pour générer des microbilles d'alginate multicouches (Figure 1). Première, microbilles d'alginate sont formé (figure 2A). Cette procédure est décrite dans la section 1 ci-dessous. Cellules ou des protéines peuvent être ajoutés à des microbilles de cette étape pour agir en tant que système de délivrance. L'étape suivante consiste à la formation d'une couche permsélective sur les microbilles et est décrite dans l'article 2. La dernière étape consiste à la formation d'une couche d'alginate supplémentaire et est décrite dans l'article 3. Cette couche se forme à l'extérieur de la surface des billes (figure 2B) peut être utilisé pour encapsuler et délivrer des molécules thérapeutiques (figure 2C) pour diriger la réponse cellulaire à la transplantation système suivant.
1. Préparation à micro-alginate
- Préparer une solution à 1,5% (p / v) alginate LVM en dissolvant 15 g de l'alginate de LVM dans 1 ml deinterne solution d'alginate couche (25 mM de tampon HEPES, 118 mM de NaCl, 5,6 mM de KCl, et 2,5 mM de MgCl 2 dans de l'eau DI, ajusté à pH 7,4). Mélanger sur un Vortexer jusqu'à ce que le pouvoir d'alginate a complètement dissous pour former une solution claire, visqueuse. Note: Ce protocole décrit les conditions optimales pour l'encapsulation des îlots au sein de microcapsules d'alginate 1 La concentration et la composition des microsphères d'alginate peut être modifiée pour accorder des propriétés pour d'autres applications (par exemple l'administration de médicaments, l'ingénierie tissulaire, etc) Remarque: Pour l'encapsulation des îlots les îlots peut être ajouté à la solution d'alginate à cette étape avant le chargement dans le microencapsulator.
- Préparer la solution de réticulation (22 mM de CaCl 2 dans l'eau DI) en dissolvant 100 mM de CaCl 2 et 10 mM de tampon HEPES dans l'eau DI et ajuster le pH à 7,4. Note: d'autres cations divalents tels que Br 2 +, Sr 2 +, etc peut être utilisé à la place de Ca 2 +, en fonction de la nature de gélification d'alginate desired.
- Mettre en place la microencapsulator deux canaux d'air alginate veste en ajoutant une aiguille de calibre 25 à une seringue, et d'ajuster les soupapes de chaque côté pour s'assurer que l'aiguille est dans le centre de la veste de l'air. Des aiguilles de calibre différents peuvent être utilisés pour cette étape, en fonction de la taille de microbilles d'alginate ciblées.
Cette étape peut également être effectuée avec une seringue, si un microencapsulator ne pas être disponibles. Ajouter la solution d'alginate de la seringue, et sélectionner une aiguille de calibre sur la base de la taille des microbilles souhaités. - Placez un ballon contenant 10 ml de solution de réticulation directement sous l'aiguille. Placez une barre d'agitation dans la solution.
- Injecter des gouttelettes directement dans le solution de CaCl 2 de manière à réticuler l'alginate pour former des microbilles. Incuber les perles dans la solution de réticulation pour durcir pendant au moins quinze minutes, en remuant constamment.
- Transfert des billes dans un tube à centrifuger de 15 ml. Retirer la solution résiduelle,et d'effectuer trois lavages avec un 2 0,2% CaCl dans une solution saline normale pendant deux minutes chacun.
2. Revêtement des microbilles avec Poly-L-ornithine
- Préparer 3 ml d'une solution à 0,1% (p / v) de la poly-L-ornithine (PLO) dans une solution saline normale. Placer la solution sur un vortex jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous, formant une solution claire. Poly-L-lysine (PLL) peut être utilisé à la place de l'OLP pour cette étape, qui se traduit par des niveaux similaires de permsélectivité.
- Transfert des microbilles d'alginate dans la solution OLP. Placer sur un Vortex pendant 30 minutes pour permettre à l'OLP suffisamment de temps pour interagir avec l'alginate, formant un complexe polycation-polyanion. Au bout de 30 minutes, il devrait y avoir un revêtement blanc nettement visible autour des microbilles d'alginate.
- Retirer la solution OLP, et d'effectuer trois lavages avec CaCl 2 0,2% dans une solution saline normale pendant deux minutes chacun.
3. Création de l'alginate extérieur Layer
- Préparer une solution d'alginate de concentration voulue qui doit être utilisé pour créer la couche extérieure. La solution est préparée comme décrit dans (1,1) ci-dessus. La taille de la couche extérieure est influencée par la composition et la concentration d'alginate utilisé (figure 3).
- Transfert des microbilles d'alginate à une cellule-passoire. Utilisez un Kimwipe pour absorber l'excès de solution afin de sécher les microbilles autant que possible.
- Transfert des microbilles sur une surface Parafilm. Autres surfaces lisses comme le verre ou même un plat de Petri en plastique peut être substitué pour Parafilm, si désiré.
- Transférer la solution d'alginate préparée en (3.1) sur les microbilles d'alginate. Le volume de solution d'alginate être doit couvrir complètement les microbilles d'alginate. Laissez-les microbilles restent dans la solution d'alginate pendant 45 minutes.
- Utiliser une pipette pour enlever la solution d'alginate en excès non lié à des microbilles.
- Transfert des microbilles dansà une solution de CaCl 2 22mm. Ce réticule la solution d'alginate autour des microbilles, conduisant à la formation de la couche d'alginate extérieure distincte.
- Effectuer trois lavages avec 22 mM de CaCl 2 dans une solution saline normale pendant deux minutes chacun. Affichage des microbilles au microscope devraient permettre une couche d'alginate extérieure distincte à voir formé autour de la microbille de base.
4. Les résultats représentatifs
Figure 1. Un schéma de la procédure de création des microbilles d'alginate multicouches. Reproduit avec la permission de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010).
Figure 2. (A) et (B) sont des images à contraste de phase de microbilles d'alginate. (A) montre une microbilleaprès l'étape de synthèse (1,7), tandis (B) affiche une couche d'alginate distincte extérieure présente après l'achèvement de l'étape (3.7). (C) est une image FITC de la protéine à marquage fluorescent BSA encapsulé dans la couche externe. Reproduit avec la permission de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010).
Figure 3. La taille de la couche extérieure d'alginate peut être modifiée sur la base de la composition et la concentration d'alginate utilisé. Nos résultats montrent que, à la fois pour LVM et l'alginate de LVG, les augmentations de la taille des calques avec extérieurs concentration d'alginate croissante, et que l'alginate de LVG donne plus épaisses couches externes de l'alginate de LVM à des concentrations égales. Reproduit avec la permission de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010).
Figure 4. Sortie du FGF-1, une protéine facteur de croissance angiogénique, de la couche extérieure d'alginate varier sur la base de la concentration de l'alginate de LVM et LVG utilisé. (A) et (B) la libération pour cent émission, et (C) et (D) représentent la libération de masse correspondante du FGF-1 en fonction du temps pour différentes formulations de couche extérieure. Il s'agit d'une version d'éclatement exposé à toutes les conditions au sein de l'initiale de 5 h (A et C), et à faible dose à libération continue pour un maximum de 30 jours (B et D). Reproduit avec la permission de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov;. 95 (2), 632-40 (2010) Cliquez ici pour agrandir la figure .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alginate est un produit naturel, un polysaccharide acide extraite d'algues et est composé d'unités de 1,4 '-β-D-mannuronique acide (M) et α-L-guluronique (G) 2,3. Gélification simple se produit lorsque des cations divalents, tels que Ca 2 +, Sr 2 +, Ba 2 + ou d'interagir avec du G-monomères formant des ponts entre les chaînes d'alginate ioniques adjacents. Microbilles de l'alginate ont été utilisés pour fournir une variété de protéines, y compris facteur de croissance des fibroblastes-1 (FGF-1), facteur de croissance nerveuse, la leucémie facteur inhibiteur, facteur de croissance vasculaire endothéliale (VEGF), et pour l'encapsulation de cellules chondrocytes, comprenant les hépatocytes et les îlots. Avantages de l'utilisation d'un tel microparticule polymère système comprennent la protection des protéines et de cellules résultant de la dégradation et la réaction dans le corps, le volume des particules petites permettant l'administration par injection facile, et le contrôle de la diffusion soluté par la manipulation des propriétés physiques du matériau.
Alginate microsphères recouvertes d'une couche de polymère à perméabilité sélective sont actuellement en essais cliniques pour le traitement de diabète de type I. Toutefois, la viabilité à long terme des transplantés îlots encapsulés dépend, en partie, sur sa capacité à acquérir de l'oxygène et les nutriments à partir d'un approvisionnement en sang vasculaire. Un système de biomatériau qui peut servir en même temps comme un système d'encapsulation pour des îlots, ainsi qu'un système de délivrance prolongée pour des protéines angiogéniques peut stimuler la croissance vasculaire autour des cellules transplantées, résultant de la viabilité améliorée greffé. Néovascularisation persistante exige la libération prolongée du FGF-1 plutôt que d'une administration d'un bolus unique. Dans cet article, Jupiter, nous présentons une approche pour générer des microbilles d'alginate multicouches (Figure 1). La couche extérieure peut être utilisé pour la libération soutenue d'encapsulation et le FGF-1, tandis que la couche interne peut être utilisé pour l'immuno-isolation de greffes d'îlots (figure 2
Notre laboratoire a montré précédemment que la fourniture durable de FGF-1 plutôt que d'une haute administration-bolus des protéines, des résultats d'une réponse du réseau microvasculaire persistant 4-6. Le système décrit ici peut être utilisé pour générer une couche extérieure pour la livraison des protéines angiogéniques, tels que le FGF-1 (figure 2). La taille de la couche extérieure peut être modifiée sur la base de la composition et la concentration d'alginate utilisé (figure 3). La taille de cette couche externe pourrait jouer un rôle important dans le succès des systèmes. Propriétés de la couche extérieure pourrait influencer à la fois la libération de molécules thérapeutiques dans le tissu environnant et le transport des nutriments et des molécules de signalisation à des cellules dans l'alginate intérieure. Les propriétés de la couche extérieure devra être optimisé pour une application donnée. Pour la livraison de FGF-1, à libération prolongée pourrait être réalisé pour un maximum de 30 jours en fonction de la forme d'alginatement (Figure 4) 7, 8.
Des essais cliniques utilisant des îlots encapsulés dans des microcapsules d'alginate ont montré une certaine promesse dans le traitement de diabète de type I. Cependant, un grand nombre d'îlots sont nécessaires pour l'efficacité en raison de la faible survie après une transplantation. La capacité à encapsuler dans des microcapsules îlots multicouches dans laquelle une protéine angiogénique est libéré de la couche extérieure peut accroître la viabilité des îlots greffés. Cette viabilité amélioré pourrait réduire le nombre d'îlots nécessaires pour le traitement, l'augmentation de l'impact potentiel clinique et de la disponibilité de ces thérapies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par le département américain des Anciens Combattants (Washington DC), les subventions, les 0852048 0731201, 0854430 et de la National Science Foundation (Arlington, VA), et la subvention RO1 DK080897 de la National Institutes of Health (Bethesda, MD) . M. Khanna a reçu le soutien d'un généreux don de M. Edward Ross et le Dr Monica Moya de la Fondation Bill & Melinda Gates Foundation (Seattle, WA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads. J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation. Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).
- Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration. Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).
- Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering. Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells. Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1. J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).
