Summary
In de volgende paragrafen beschrijven we procedures voor de bereiding van alginaat die voor toepassing in biomedische toepassingen. We specifiek illustreren een techniek voor het maken van meerdere lagen alginaat microsferen voor het tweeledige doel van de cel en eiwitten inkapseling als een potentiële behandeling voor diabetes type 1.
Abstract
Alginaat gebaseerde materialen aanzienlijke aandacht gekregen voor biomedische toepassingen vanwege hun hydrofiele aard biocompatibiliteit en fysieke architectuur. Toepassingen zijn onder andere cel inkapseling, drug delivery, stamcel-cultuur, en tissue engineering steigers. In feite zijn klinische momenteel uitgevoerd waarbij eilandjes zijn ingekapseld in PLO gecoate alginaat microbolletjes als behandeling van type I diabetes. Echter, een groot aantal eilandjes die nodig zijn voor de werkzaamheid als gevolg van een slechte overleving na de transplantatie. De mogelijkheid om microvasculaire netwerkvorming lokaal te stimuleren rond de ingekapselde cellen kunnen verhogen hun levensvatbaarheid door verbeterde transport van zuurstof, glucose en andere essentiële voedingsstoffen. Fibroblast groeifactor-1 (FGF-1) is een natuurlijk groeifactor die kan bloedvaten stimuleren en zuurstof in ischemische weefsels verbeteren. De werkzaamheid van FGF-1 verhoogd wanneer deze wordt geleverd een sustained mode in plaats van een grote bolus-administratie. De lokale lange termijn afgifte van groeifactoren uit eilandje inkapseling systemen kan het stimuleren van de groei van bloedvaten direct naar de getransplanteerde cellen, mogelijk het verbeteren van functionele graft resultaten. In dit artikel beschrijven we procedures voor de bereiding van alginaat die voor toepassing in biomedische toepassingen. Verder beschrijven we een werkwijze ontwikkeld voor het genereren lagen alginaat microbolletjes. Cellen kunnen ingekapseld worden in de binnenste alginaat kern en angiogene eiwitten in de buitenste laag alginaat. De release van eiwitten uit de buitenste laag zou het stimuleren van de vorming van lokale netwerken microvasculaire direct naar de getransplanteerde eilandjes.
Protocol
Het protocol beschrijft hier een drie-stappen-procedure voor het genereren van meerdere lagen alginaat microbolletjes (figuur 1). Eerst worden alginaat microbolletjes gevormd (figuur 2A). Deze procedure is beschreven in paragraaf 1 hieronder. Cellen of eiwitten kunnen toegevoegd worden aan de microkorrels in deze stap om als een afgiftesysteem. De volgende stap omvat de vorming van een permselectief laag op de microkorrels en is beschreven in hoofdstuk 2. De laatste stap gaat de vorming van een extra alginaat laag en wordt beschreven in paragraaf 3. Deze laag vormen op de buitenkant van het oppervlak van de korrels (Figuur 2B) kan worden gebruikt om te kapselen en therapeutische moleculen (figuur 2C) cellulaire respons van het systeem na de transplantatie sturen.
1. Alginaat microbeads Voorbereiding
- Bereid een 1,5% (w / v) LVM alginaatoplossing door het oplossen 15 g LVM alginaat in 1 mlbinnenlaag alginaatoplossing (25 mM Hepes buffer, 118 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,5 mM MgCl2 in DI water, pH 7,4). Meng bij Vortexer tot alginaat kracht volledig opgelost tot een heldere, viskeuze oplossing. Opmerking: Dit protocol beschrijft de voorwaarden optimaal zijn voor eilandje inkapseling binnen alginaat microcapsules 1 De concentratie en samenstelling van de alginaat microsferen kan worden gewijzigd om eigenschappen af te stemmen voor andere toepassingen (bijvoorbeeld drug delivery, tissue engineering, etc.). Opmerking: Voor eilandje inkapseling van de eilandjes kunnen worden toegevoegd aan de alginaatoplossing in deze stap voorafgaand aan het laden in de microencapsulator.
- Bereid de verknoping oplossing (22 mM CaCl2 in DI water) door het oplossen 100 mM CaCl2 en 10 mM HEPES buffer in DI water en het instellen op pH 7,4. Opmerking: andere divalente kationen zoals Br2 +, 2 + Sr, enz. kunnen in plaats van Ca2 + worden gebruikt, afhankelijk van de aard van alginaat gelering desired.
- Stel de twee-kanaals air jack alginaat microencapsulator door het toevoegen van een 25-gauge naald op een spuit, en stel de kleppen aan beide zijden om te controleren of de naald in het midden van de lucht jas. Verschillende gauge naald kan worden gebruikt voor deze stap, afhankelijk van de grootte van gerichte alginaat microkorrels.
Deze stap kan worden uitgevoerd met een injectiespuit, moet microencapsulator niet beschikbaar. Voeg de alginaat oplossing voor de spuit, en selecteer een naalddikte gebaseerd op de grootte van de gewenste microkorrels. - Plaats een kolf met 10 ml van verknoping oplossing direct onder de naald. Plaats een roerstaaf in de oplossing.
- Injecteer direct druppels in de CaCl2-oplossing om de alginaat verknopen microbolletjes te vormen. Incubeer de korrels in de verknoping oplossing uitharden minstens vijftien minuten onder continu roeren.
- Breng de korrels 15 ml centrifugebuis. Verwijder de resterende oplossing,en voer drie wassingen met een 0,2% CaCl2 in fysiologische zoutoplossing twee minuten.
2. Het bekleden van de microkorrels met Poly-L-ornithine
- Bereid 3 mL van een 0,1% (w / v) van poly-L-ornithine (PLO) in zoutoplossing. Zet de oplossing op een vortex totdat het volledig is opgelost, de vorming van een heldere oplossing. Poly-L-lysine (PLL) kan in plaats van PLO worden gebruikt voor deze stap, waardoor hetzelfde niveau van permselectivity.
- Breng de alginaat microbolletjes in de PLO oplossing. Leg ze op een Vortex gedurende 30 minuten om de PLO voldoende tijd om te interageren met het alginaat, de vorming van een polykation-polyanion complex. Aan het einde van 30 minuten, moet er een duidelijk zichtbare witte coating rondom de alginaat microbolletjes.
- Verwijder de PLO oplossing en voer driemaal wassen met 0,2% CaCl2 in fysiologische zoutoplossing twee minuten.
3. Het maken van de Buiten-Alginaat LayER
- Bereid een alginaatoplossing gewenste concentratie die worden gebruikt om de buitenste laag. De oplossing wordt bereid zoals beschreven in (1.1) hierboven. De grootte van de buitenlaag wordt beïnvloed door de samenstelling en concentratie van alginaat gebruikt (Figuur 3).
- Breng de alginaat microkralen naar een cel-zeef. Gebruik Kimwipe overtollige oplossing te absorberen om de microkorrels zoveel mogelijk te drogen.
- Breng de microkorrels een Parafilm oppervlak. Andere gladde oppervlakken zoals glas of een kunststof petrischaaltje kunnen vervangen Parafilm, indien gewenst.
- Breng de alginaatoplossing bereid (3,1) op de alginaat microkorrels. Het volume van alginaat oplossing volledig moet worden betrekking hebben op de alginaat microbolletjes. Laat de microkorrels blijft de alginaatoplossing 45 minuten.
- Gebruik een pipet om het overtollige alginaat oplossing niet gebonden aan de microbolletjes te verwijderen.
- Breng de microbolletjes inaan een oplossing van 22 mm CaCl2. Dit verknoopt de alginaatoplossing rond de microkorrels, resulterend in de vorming van de afzonderlijke buitenste alginaat laag.
- Voer driemaal wassen met 22 mM CaCl2 in fysiologische zoutoplossing twee minuten. Het bekijken van de microkralen onder een microscoop moet het mogelijk maken voor een duidelijke buitenste alginaat laag om gezien te worden gevormd rond de kern microbeads.
4. Representatieve resultaten
Figuur 1. Een schematische weergave van de procedure voor het maken lagen alginaat microbolletjes. Overgenomen met toestemming van Khanna et al.. J Biomed Mater Res A. november, 95 (2), 632-40 (2010).
Figuur 2. (A) en (B) in fase contrastbeelden alginaat microkorrels. (A) toont een Microbeadna synthese stap (1,7), terwijl (B) geeft een duidelijke buitenste laag alginaat aanwezig na voltooiing van stap (3.7). (C) is een afbeelding van FITC fluorescent gelabelde BSA eiwit ingekapseld in de buitenste laag. Overgenomen met toestemming van Khanna et al.. J Biomed Mater Res A. november, 95 (2), 632-40 (2010).
Figuur 3. De grootte van de buitenste laag alginaat kan worden gevarieerd gebaseerd op de samenstelling en concentratie van alginaat gebruikt. Onze resultaten tonen dat voor zowel LVM en LVG alginaat de buitenste laag toeneemt met toenemende concentratie alginaat, en LVG alginaat dikkere lagen levert dan LVM alginaat op gelijke concentraties. Overgenomen met toestemming van Khanna et al.. J Biomed Mater Res A. november, 95 (2), 632-40 (2010).
Figuur 4. Vrijgave van FGF-1, angiogene groeifactor eiwit van de buitenste laag alginaat gevarieerd gebaseerd op de concentratie van LVM en LVG alginaat gebruikt. (A) en (b) tonen procent afgifte en (C) en (D) duiden de corresponderende massa afgifte van FGF-1 tegen de tijd voor verschillende buitenlaag formuleringen. Er is een stootafgifte vertoonden alle omstandigheden in de eerste 5 uur (A en C), en een lage dosis continue afgifte tot 30 dagen (B en D). Overgenomen met toestemming van Khanna et al.. J Biomed Mater Res A. november;. 95 (2), 632-40 (2010) Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alginaat een natuurlijke, zure polysaccharide uit algen en is opgebouwd uit eenheden van 1,4 '-β-D-mannuronzuur (M) en α-L-guluronzuur (G) 2,3. Eenvoudige gelering optreedt wanneer tweewaardige kationen, zoals Ca2 +, 2 + Sr, Ba of 2 + interactie met G-monomeren die ionische bruggen tussen grenzende alginaat ketens. Microkorrels alginaat zijn gebruikt om een verscheidenheid van eiwitten, met inbegrip fibroblast groeifactor 1 (FGF-1), zenuwgroeifactor, leukemie belemmerende factor, vasculaire endotheel groeifactor (VEGF) en voor inkapseling van cellen zoals chondrocyten, hepatocyten leveren en eilandjes. Voordelen van een dergelijke micropartikel polymeersysteem bevatten bescherming van de eiwitten en cellen van afbraak-en reactie in het lichaam, kleine deeltjes volume waardoor gemakkelijke toediening door injectie, en controle van opgeloste diffusie door de manipulatie van de fysische eigenschappen van het materiaal.
Alginaat microsferen bedekt met een permselectieve polymeerlaag zijn op dit moment in klinische studies voor de behandeling van type I diabetes. Echter, de levensvatbaarheid op lange termijn van getransplanteerde ingekapselde eilandjes hangt voor een deel van zijn vermogen om zuurstof en voedingsstoffen te nemen van een vasculaire bloedtoevoer. Een biomateriaal systeem gelijktijdig dienen als een omhulling voor eilandjes en een aanhoudende systeem voor angiogene eiwitten kunnen stimuleren vasculaire groei in de getransplanteerde cellen resulteert in verbeterde graft levensvatbaarheid. Persistent neovascularisatie vereist de langdurige afgifte van FGF-1 in plaats van een enkele bolus administratie. In dit Jove artikel zullen we een aanpak voor het genereren van meerdere lagen alginaat microbolletjes (figuur 1). De buitenste laag kan worden gebruikt voor het inkapselen en aanhoudende afgifte van FGF-1, terwijl de binnenste laag gebruikt kan worden voor de immunoisolation van eiland transplantaten (figuur 2
Ons laboratorium eerder aangetoond dat een aanhoudende afgifte van FGF-1 in plaats van een hoog bolustoediening van de proteïne resulteert in een permanente microvasculaire netwerk reactie 4-6. Het hier beschreven systeem kan worden gebruikt om een buitenlaag voor de levering van angiogene eiwitten, zoals FGF-1 (figuur 2) te genereren. De grootte van de buitenste laag kan worden gevarieerd gebaseerd op de samenstelling en concentratie van alginaat gebruikt (Figuur 3). De grootte van deze buitenste laag kan een belangrijke rol in het succes van de systemen. Eigenschappen van de buitenlaag kunnen beïnvloeden zowel de afgifte van therapeutische moleculen in het omgevende weefsel en het transport van voedingsstoffen en signaalmoleculen de cellen in de binnenste alginaat. De buitenlaag eigenschappen moet geoptimaliseerd worden voor een bepaalde toepassing. Voor de afgifte van FGF-1 kan afgifte worden bereikt tot 30 dagen, afhankelijk van de vorm alginaatbevolking (figuur 4) 7, 8.
Klinische studies met behulp van eilandjes ingekapseld in alginaat microcapsules hebben laten zien een aantal belofte als een behandeling voor type I diabetes. Echter, een groot aantal eilandjes die nodig zijn voor de werkzaamheid als gevolg van een slechte overleving na transplantatie. De mogelijkheid om eilandjes meerlagige microcapsules waarin een angiogene eiwit vrijkomt van de buitenlaag ingekapseld kunnen het levensvatbaarheid van getransplanteerde eilandjes. Deze verbetering van de rentabiliteit zou kunnen verminderen van het aantal eilandjes die nodig zijn voor de behandeling, het vergroten van de potentiële klinische gevolgen en de beschikbaarheid van deze therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Amerikaanse Department of Veterans Affairs (Washington DC), subsidies 0852048, 0731201 en 0854430 van de National Science Foundation (Arlington, VA), en de subsidie RO1 DK080897 van de National Institutes of Health (Bethesda, MD) . De heer Khanna steun gekregen van een gulle donatie van de heer Edward Ross en dr. Monica Moya van de Bill & Melinda Gates Foundation (Seattle, WA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads. J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation. Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).
- Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration. Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).
- Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering. Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells. Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1. J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).
