Summary
I de følgende avsnittene, skissere vi prosedyrer for utarbeidelse av alginat mikrosfærer for bruk i biomedisinske applikasjoner. Vi er spesielt illustrerer en teknikk for å skape flere lag alginat mikrosfærer for den doble formål celle og protein innkapsling som en potensiell behandling for type 1 diabetes.
Abstract
Alginat-baserte materialer har fått betydelig oppmerksomhet for biomedisinske applikasjoner på grunn av deres hydrofile karakter, biokompatibilitet, og fysisk arkitektur. Bruksområdene omfatter celle innkapsling, levering av legemidler, stamcelleforskningen kultur, og tissue engineering stillaser. Faktisk er kliniske studier for tiden blir utført der holmene er innkapslet i PLO belagt alginat microbeads som en behandling av type I diabetes. Men store mengder holmer nødvendig for effekt på grunn av dårlig overlevelse etter transplantasjon. Evnen til lokalt stimulere mikrovaskulær nettverk formasjon rundt den innkapslede cellene kan øke sin levedyktighet gjennom forbedret transport av oksygen, glukose og andre viktige næringsstoffer. Fibroblast vekstfaktor-1 (FGF-1) er en naturlig forekommende vekstfaktor som er i stand til å stimulere blod fartøy dannelse og forbedre oksygennivå i iskemisk vev. Effekten av FGF-1 forsterkes når det er levert i en Transportoversiktained mote snarere enn en enkelt stor bolus administrasjon. Den lokale langsiktige frigjøring av vekstfaktorer fra holme innkapsling systemer kan stimulere veksten av blodkar direkte mot transplanterte cellene, potensielt forbedre funksjonelle pode utfall. I denne artikkelen, skissere vi prosedyrer for utarbeidelse av alginat mikrosfærer for bruk i biomedisinske applikasjoner. I tillegg beskriver vi en metode vi har utviklet for å generere mangefargede alginat microbeads. Celler kan innkapslet i indre alginat kjerne, og angiogenic proteiner i det ytre alginat laget. Utgivelsen av proteiner fra dette ytterste laget ville stimulere dannelsen av lokale mikrovaskulære nettverk direkte mot de transplanterte holmer.
Protocol
Protokollen her beskriver en tre-trinns prosedyre for å generere mangefargede alginat microbeads (figur 1). Først blir alginat microbeads dannes (Figur 2A). Denne fremgangsmåten er beskrevet i kapittel 1 nedenfor. Celler eller proteiner kan legges til microbeads i dette trinnet for å fungere som en levering system. Det neste trinnet innebærer dannelsen av en permselective lag på microbeads og er beskrevet i § 2. Det siste trinnet innebærer dannelsen av en ekstra alginat lag og er beskrevet i kapittel 3. Dette laget skjemaer på utsiden av overflaten av perlene (figur 2B) kan brukes til å kapsle og levere terapeutiske molekyler (figur 2C) for å styre cellulær respons til systemet etter transplantasjon.
1. Alginat Microbead Forberedelse
- Forbered en 1,5% (w / v) LVM alginat løsning ved å løse opp 15 gram LVM alginat i 1 mLinnerlag alginat løsning (25 mM HEPES buffer, 118 mM NaCl, 5,6 mM KCl, og 2,5 mM MgCl 2 i DI vann, justert til pH 7,4). Bland på en Vortexer til alginat makt har fullstendig oppløst å danne en klar, tyktflytende løsning. Merk: Denne protokollen beskriver forholdene optimale for holmen innkapsling innen alginat mikrokapslene en Konsentrasjonen og sammensetningen av alginat mikrosfærer kan endres for å stille eiendommer for andre applikasjoner (f.eks stoffet levering, tissue engineering, etc.) Merk: For holmen innkapsling holmer kan legges til alginat løsning på dette trinnet før lasting i microencapsulator.
- Klargjør crosslinking løsningen (22 mM CaCl 2 i DI vann) ved oppløsning 100 mm CaCl 2 og 10 mm HEPES buffer i DI vann og justere til pH 7,4. Merk: andre divalente kationer som Br 2 +, Sr 2 + osv kan brukes i stedet for Ca 2 +, avhengig av arten av alginat gelation desired.
- Sett opp to-kanals luft jakke alginat microencapsulator ved å legge en 25-gauge kanyle til en sprøyte, og justere ventiler på hver side for å sørge for at nålen er i midten av luft jakken. Ulike måle nåler kan brukes til dette trinnet, avhengig av størrelsen på alginat microbeads målrettede.
Dette trinnet kan også utføres med en sprøyte, bør en microencapsulator ikke være tilgjengelig. Legg til alginat løsningen på sprøyten, og velg en nål måler basert på størrelsen av microbeads ønskede. - Plasser en kolbe som inneholder 10 ml crosslinking løsning rett under nålen. Plasser en bevegelse bar i løsningen.
- Injiser dråper direkte i CaCl 2 løsningen for å kryssbindingsfordelingen at alginat å danne microbeads. Inkuber perler i crosslinking løsningen for å kurere i minst femten minutter, med kontinuerlig røring.
- Overfør perler til en 15 mL sentrifugerør. Fjern den gjenværende løsningen,og utføre tre vasker med en 0,2% CaCl 2 i fysiologisk saltvann i to minutter hver.
2. Belegg Microbeads med Poly-L-ornithine
- Forbered 3 ml av en 0,1% (w / v) løsning av poly-L-ornithine (PLO) i fysiologisk saltvann. Plasser løsning på en vortex til den er helt oppløst, danner en klar løsning. Poly-L-lysin (PLL) kan brukes i stedet for PLO for dette trinnet, noe som resulterer i tilsvarende nivåer av permselectivity.
- Overfør alginat microbeads inn PLO løsningen. Plasser på en Vortex i 30 minutter slik at PLO tilstrekkelig tid til å samhandle med alginat, danner en polycation-polyanion kompleks. På slutten av 30 minutter, bør det være en tydelig synlig hvitt belegg rundt alginat microbeads.
- Fjern PLO løsningen, og utføre tre vasker med 0,2% CaCl 2 i fysiologisk saltvann i to minutter hver.
3. Opprette Ytre Alginat LayER
- Forbered en alginat løsning av ønsket konsentrasjon som skal brukes til å lage det ytterste laget. Løsningen er utarbeidet som beskrevet i (1.1) ovenfor. Størrelsen på det ytre laget er påvirket av sammensetningen og konsentrasjon av alginat brukt (figur 3).
- Overfør alginat microbeads til en celle-sil. Bruk en Kimwipe å absorbere overflødig løsning for å tørke microbeads så mye som mulig.
- Overfør microbeads til en Parafilm overflate. Andre glatte overflater som glass eller plast petriskål kan erstatte Parafilm, hvis ønskelig.
- Overfør alginat løsningen er utarbeidet i (3.1) på alginat microbeads. Volumet av alginat løsning bør fullstendig dekke alginat microbeads. La microbeads forbli i alginat løsningen i 45 minutter.
- Bruk en pipette til å fjerne overflødig alginat løsningen ikke er bundet til microbeads.
- Overfør microbeads itil en løsning av 22mm CaCl 2. Dette kryssbinder den alginat løsningen rundt microbeads, noe som resulterer i dannelsen av distinkte ytre alginat lag.
- Utfør tre vasker med 22 mm CaCl 2 i fysiologisk saltvann i to minutter hver. Vise microbeads under et mikroskop bør gi rom for en tydelig ytre alginat lag å bli sett dannet rundt kjernen microbead.
4. Representative Resultater
Figur 1. En skjematisk av prosedyren for å lage flere lag alginat microbeads. Gjengitt med tillatelse fra Khanna et al. J Biomed Mater Res A. november, 95 (2), 632-40 (2010).
Figur 2. (A) og (B) er fasekontrast bilder av alginat microbeads. (A) viser en microbeadEtter syntese trinn (1,7), mens (B) viser en tydelig ytre alginat lag tilstede etter ferdigstillelse av trinn (3,7). (C) er en FITC bilde av fluorescently-merket BSA protein innkapslet i det ytre laget. Gjengitt med tillatelse fra Khanna et al. J Biomed Mater Res A. november, 95 (2), 632-40 (2010).
Figur 3. Størrelsen på ytre alginat lag kan varieres basert på sammensetning og konsentrasjon av alginat brukt. Våre resultater viser at både LVM og LVG alginat, gir det ytterste laget størrelse øker med økende alginat konsentrasjon, og at LVG alginat tykkere ytre lag enn LVM alginat i like konsentrasjoner. Gjengitt med tillatelse fra Khanna et al. J Biomed Mater Res A. november, 95 (2), 632-40 (2010).
Figur 4. Offentliggjøring av FGF-1, en angiogenic vekst faktor protein, fra den ytre alginat laget varierte basert på konsentrasjonen av LVM og LVG alginat brukt. (A) og (B) viser prosent utgivelsen, og (C) og (D) betegne den tilsvarende massen utgivelsen av FGF-1 versus tid for forskjellige ytre lag formuleringer. Det er en burst utgivelse utstilt for alle forhold innen den første 5 h (A og C), og lav-dose kontinuerlig frigjøring for inntil 30 dager (B og D). Gjengitt med tillatelse fra Khanna et al. J Biomed Mater Res A. november;. 95 (2), 632-40 (2010) Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alginat er en naturlig, syrlig polysakkarid ekstrahert fra alger og er sammensatt av enheter av 1,4 '-β-D-mannuronic syre (M) og α-L-guluronic syre (G) 2,3. Enkelt gelation oppstår når divalente kationer som Ca 2 +, Sr 2 +, eller Ba 2 + samhandle med G-monomerer danner ioniske broer mellom tilstøtende alginat kjedene. Microbeads av alginat har blitt brukt til å levere en rekke proteiner, inkludert fibroblast vekstfaktor-1 (FGF-1), nerve vekst faktor, leukemi hemmer faktor, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og for innkapsling av celler, inkludert chondrocytes og hepatocytter og holmer. Fordeler med å bruke et slikt mikropartikkel polymer systemet omfatter beskyttelse av proteiner og celler fra degradering og reaksjon i kroppen, liten partikkel volum muliggjør enkel administrasjon gjennom injeksjon, og kontroll av løst stoff diffusjon av manipulasjon av de fysiske egenskapene til materialet.
Alginat mikrosfærer belagt med en permselective polymer lag er for tiden i kliniske studier for behandling av type I diabetes. Imidlertid er den langsiktige levedyktigheten av transplanterte innkapslet holmer avhengig, delvis på dens evne til å tilegne seg oksygen og næringsstoffer fra en vaskulær blodtilførsel. Et biomateriale system som kan fungere samtidig som en innkapsling system for holmer, samt en vedvarende levering system for angiogenic proteiner kan stimulere vaskulær vekst rundt det transplanterte cellene, noe som resulterer i forbedret pode levedyktighet. Vedvarende kalles neovaskularisasjon krever vedvarende utgivelsen av FGF-1 snarere enn en enkel bolus administrasjon. I denne Jove artikkelen presenterer vi en tilnærming for å generere mangefargede alginat microbeads (figur 1). Det ytre laget kan brukes til innkapsling og vedvarende utgivelsen av FGF-1, mens det indre laget kan brukes til immunoisolation av holmen transplantasjoner (figur 2
Vårt laboratorium har tidligere vist at en vedvarende levering av FGF-1 snarere enn en high-bolusadministrasjon av proteinet, resulterer i en vedvarende mikrovaskulær nettverk respons 4-6. Systemet er beskrevet her kan brukes til å generere et ytre lag for levering av angiogenic proteiner, slik som FGF-1 (figur 2). Størrelsen på det ytre laget kan varieres basert på sammensetning og konsentrasjon av alginat brukt (figur 3). Størrelsen på dette ytre laget kan spille en viktig rolle i suksessen av systemene. Egenskaper ved det ytre laget kunne påvirke både frigjøring av terapeutiske molekyler inn i omkringliggende vev og transport av næringsstoffer og signalmolekyler til cellene i den indre alginat. De ytre lagegenskaper må være optimalisert for en gitt applikasjon. For levering av FGF-1, kan vedvarende utgivelsen oppnås i opptil 30 dager avhengig alginat skjemaulation (figur 4) 7, 8.
Kliniske forsøk med holmer innkapslet i alginat mikrokapsler har vist noen lover som behandling for type I diabetes. Men store mengder holmer nødvendig for effekt på grunn av dårlig overlevelse etter transplantasjon. Evnen til å kapsle holmer i flerlags mikrokapsler der en angiogenic protein frigjøres fra det ytre laget kan øke levedyktigheten av transplanterte holmer. Dette forbedret levedyktighet kunne redusere antall holmer som kreves for behandling, har økt potensialet klinisk betydning og tilgjengeligheten av disse behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av US Department of Veterans Affairs (Washington DC), tilskudd 0852048 og 0731201, og 0854430 fra National Science Foundation (Arlington, VA), og stipend RO1 DK080897 fra National Institutes of Health (Bethesda, MD) . Mr. Khanna fikk støtte fra en sjenerøs donasjon av Mr. Edward Ross og Dr. Monica Moya fra Bill & Melinda Gates Foundation (Seattle, WA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads. J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation. Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).
- Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration. Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).
- Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering. Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells. Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1. J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).
