Summary
I de följande avsnitten, beskriva vi förfaranden för framställning av alginat mikrosfärer för användning i biomedicinska tillämpningar. Vi illustrerar speciellt en teknik för att skapa flera lager alginatmikrosfärer för det dubbla syftet att cell-och protein inkapsling som en potentiell behandling för typ 1 diabetes.
Abstract
Alginat-baserade material har fått stor uppmärksamhet för biomedicinska tillämpningar på grund av sin hydrofila natur, biokompatibilitet och fysisk arkitektur. Tillämpningar innefattar cellinkapsling, läkemedelstillförsel, stam cellkultur och vävnadsstöd teknik. I själva verket är kliniska försök för närvarande utförs i vilken cellöarna är inkapslade i PLO belagda alginat mikropärlor som en behandling av typ I-diabetes. Emellertid är ett stort antal cellöar som krävs för effektivitet på grund av dålig överlevnad efter transplantation. Förmågan att lokalt stimulera mikrovaskulär nätverksbildning runt inkapslade cellerna kan öka sin lönsamhet genom förbättrade transport av syre, glukos och andra viktiga näringsämnen. Fibroblast tillväxtfaktor-1 (FGF-1) är en naturligt förekommande tillväxtfaktor som har förmåga att stimulera bildningen blodkärl och förbättra syrenivåer i ischemiska vävnader. Effekten av FGF-1 förstärks när den levereras i ett Sustained sätt snarare än en enda stor-bolusadministrering. Den lokala långsiktiga frisättning av tillväxtfaktorer från ö inkapsling system kan stimulera tillväxten av blodkärl direkt mot de transplanterade cellerna, vilket kan förbättra funktionella transplantat resultat. I den här artikeln beskriva vi förfaranden för framställning av alginat mikrosfärer för användning i biomedicinska tillämpningar. Dessutom beskriver vi en metod som vi utvecklat för att skapa flerskiktade alginat mikropärlor. Celler kan inkapslas i den inre alginat kärnan, och angiogena proteiner i det yttre skiktet alginat. Frisläppandet av proteiner från detta yttre lagret skulle stimulera bildandet av lokala mikrovaskulära nät direkt mot de transplanterade öarna.
Protocol
Protokollet här beskriver tre steg förfarande för att generera flerskiktade alginat mikrokulor (figur 1). Först är alginat mikropärlor bildas (figur 2A). Detta förfarande beskrivs i avsnitt 1 nedan. Celler eller proteiner kan tillsättas till de mikropärlorna i detta steg för att fungera som ett avgivningssystem. Nästa steg innebär att bildandet av ett permselektivt skikt på mikropärlorna och beskrivs i avsnitt 2. Det sista steget innebär bildandet av ytterligare alginat skikt och beskrivs i avsnitt 3. Detta skikt bildas på utsidan av ytan hos pärlorna (figur 2B) kan användas för att inkapsla och leverera terapeutiska molekyler (Figur 2C) för att rikta cellulärt gensvar till systemet efter transplantation.
1. Alginat mikrokorn Framställning
- Framställa en 1,5% (vikt / volym) LVM alginat-lösning genom att lösa 15 gram LVM alginat i 1 mlInnerskiktet alginat-lösning (25 mM HEPES-buffert, 118 mM NaCl, 5,6 mM KCl och 2,5 mM MgCl2 i avjoniserat vatten, justerat till pH 7,4). Blanda på en virvelanordning tills alginat strömmen har fullständigt upplöst för att bilda en klar, viskös lösning. Anmärkning: Detta protokoll beskriver förutsättningarna optimala för holmen inkapsling inom alginat mikrokapslar 1 Den koncentration och sammansättning alginatmikrosfärer kan ändras för att stämma egenskaper för andra tillämpningar (t.ex. drug delivery, vävnadsteknik, etc.) Obs:. För holmen inkapsling öarna kan tillsättas till alginatlösningen i detta steg före laddning i microencapsulator.
- Framställa den bryggbildande lösningen (22 mM CaCl2 i Dl-vatten) genom att lösa 100 mM CaCl2 och 10 mM Hepes-buffert i avjoniserat vatten och justera till pH 7,4. Notera: andra tvåvärda katjoner, såsom Br2 +, Sr 2 + etc kan användas i stället för Ca 2 +, beroende på naturen av alginat gelning desired.
- Ställ in två-kanals luften microencapsulator jacka alginat genom att lägga till en 25-nål till en spruta och justera ventilerna på varje sida för att säkerställa att nålen är i mitten av Air Jacket. Olika nålar kan användas för detta steg, beroende på storleken av alginat riktade mikropärlor.
Detta steg kan också utföras med en spruta, bör en microencapsulator inte är tillgängliga. Tillsätt alginat lösningen till sprutan, och välj en nål gauge baserat på storleken av önskade mikropärlor. - Placera en kolv innehållande 10 ml av tvärbindningslösningen direkt under nålen. Placera en omrörarstav i lösningen.
- Injicera små droppar direkt in i CaCl2-lösningen för att tvärbinda alginatet till bildning mikropärlor. Inkubera kulorna i den bryggbildande lösningen för att härda i minst femton minuter under kontinuerlig omröring.
- Överföra pärlorna till en 15 ml centrifugrör. Avlägsna restlösning,och utför tre tvättar med en 0,2% CaCl2 i normal saltlösning under två minuter vardera.
2. Beläggning av mikropärlorna med poly-L-ornitin
- Framställ 3 ml av en 0,1% (vikt / volym) lösning av poly-L-omitin (PLO) i normal saltlösning. Placera lösningen på en virvel tills den är fullständigt upplöst, och bildar en klar lösning. Poly-L-lysin (PLL) kan användas i stället för PLO för detta steg, vilket resulterar i liknande nivåer av permselektivitet.
- Överför de alginat mikropärlorna i PLO lösningen. Placera på en Vortex i 30 minuter för att tillåta PLO tillräcklig tid för att interagera med alginat och bildar en polykatjon-polyanjon komplex. Vid slutet av 30 minuter, bör det finnas en distinkt synlig vit beläggning runt de alginat mikropärlor.
- Avlägsna PLO lösning, och utför tre tvättar med 0,2% CaCl2 i normal saltlösning under två minuter vardera.
3. Skapa Yttre Alginat LayER
- Framställa en alginatlösning med önskad koncentration, som skall användas för att skapa det yttre skiktet. Lösningen framställs såsom beskrivs i (1,1) ovan. Storleken på det yttre skiktet påverkas av sammansättningen och koncentrationen av alginat som används (figur 3).
- Överför alginat mikropärlorna till en cell-sil. Använd en Kimwipe att absorbera överflödig lösning för att torka mikropärlorna så mycket som möjligt.
- Överför mikropärlor på en Parafilm yta. Andra jämna ytor såsom glas eller till och med en petriskål av plast kan användas istället för Parafilm, om så önskas.
- Överföra alginat-lösning framställd i (3,1) på de alginat mikropärlor. Volymen av alginat-lösningen bör fullständigt täcka alginat mikropärlor. Låt mikropärlorna kvar i alginat-lösning under 45 minuter.
- Använda en pipett för att avlägsna överskottet av alginatlösningen inte bunden till mikropärlorna.
- Överför mikropärlor itill en lösning av 22 mM CaCl2. Detta tvärbinder alginatlösningen runt mikropärlor, vilket resulterar i bildningen av den distinkta yttre alginat skiktet.
- Utföra tre tvättningar med 22 mM CaCl2 i normal saltlösning under två minuter vardera. Att visa mikropärlor under ett mikroskop bör möjliggöra en distinkt yttre alginat lagret ses bildas runt kärnan mikrokornet.
4. Representativa resultat
Figur 1. En schematisk av förfarandet för att skapa flerskiktade alginat mikropärlor. Reproducerad med tillstånd från Khanna et al. J Biomed Mäter Res A. november, 95 (2), 632-40 (2010).
Figur 2. (A) och (B) är faskontrast bilder av alginat mikropärlor. (A) visar en mikrokornEfter syntes steg (1,7), medan (B) visar en distinkt yttre skiktet alginat närvarande efter fullbordan av steg (3,7). (C) är en FITC bild av fluorescent-märkt BSA proteinet inkapslat i det yttre skiktet. Reproducerad med tillstånd från Khanna et al. J Biomed Mäter Res A. november, 95 (2), 632-40 (2010).
Figur 3. Storleken hos det yttre skiktet alginat kan varieras baserat på kompositionen och den använda koncentrationen av alginat. Våra resultat visar att både under LVM och LVG alginat, ger det yttre skiktet storlek ökar med ökande koncentration alginat och att LVG alginat tjockare yttre skikt än LVM alginat vid lika koncentrationer. Reproducerad med tillstånd från Khanna et al. J Biomed Mäter Res A. november, 95 (2), 632-40 (2010).
Figur 4. Frisättning av FGF-1, en angiogen tillväxtfaktor-protein, från den yttre alginat skiktet varieras baserat på koncentrationen av LVM och LVG alginat användes. (A) och (B) visar procent frisättning, och (C) och (D) beteckna motsvarande massan frisättning av FGF-1 som funktion av tiden för olika yttre skiktet formuleringar. Det finns en krevadfrisättning ut för alla förhållanden inom den första 5 h (A och C) och låg dos kontinuerlig övergång till upp till 30 dagar (B och D). Reproducerad med tillstånd från Khanna et al. J Biomed Mäter Res A. november,. 95 (2), 632-40 (2010) Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alginat är en naturlig, sur polysackarid extraherad från alger och är sammansatt av enheter av 1,4 '-β-D-mannuronsyra (M) och α-L-guluronsyra (G) 2,3. Enkel gelning inträffar när tvåvärda katjoner, såsom Ca 2 +, Sr 2 + eller Ba2 + interagera med G-monomerer som bildar joniska bryggor mellan intilliggande alginat kedjor. Mikropärlor av alginat har använts för att leverera en mångfald proteiner, inklusive fibroblast tillväxtfaktor-1 (FGF-1), nervtillväxtfaktor, leukemi inhiberande faktor, vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), och för inkapsling av celler inklusive kondrocyter, hepatocyter och holmar. Fördelarna med att använda ett sådant mikropartikel polymersystem innefattar skydd av proteiner och celler från nedbrytning och reaktion i kroppen, liten partikelstorlek volym möjliggöra en enkel administration genom injektion, och kontroll av löst ämne diffusion genom manipulering av de fysikaliska egenskaperna hos materialet.
Alginatmikrosfärer belagd med ett permselektivt polymerskikt är närvarande i kliniska prövningar för behandling av typ I-diabetes. Är dock lång sikt av transplanterade inkapslade öar beror delvis på dess förmåga att förvärva syre och näringsämnen från en vaskulär blodtillförsel. En biomaterialet system som kan fungera samtidigt som en inkapsling för cellöar och en fördröjd avgivningssystem för angiogena proteiner kan stimulera vaskulär tillväxt runt de transplanterade cellerna, vilket resulterar i förbättrad transplantat livsduglighet. Ihållande neovaskularisation kräver fördröjd frisättning av FGF-1 snarare än en enda bolus-administrering. I den här JUPITER artikeln presenterar vi en metod för att generera flerskiktade alginat mikrokulor (figur 1). Det yttre skiktet kan användas för inkapsling och frisättning av FGF-1, medan det inre skiktet kan användas för immunisolering av ö-transplantat (figur 2
Vårt laboratorium har tidigare visat att en fördröjd frisättning av FGF-1 snarare än en hög bolusadministrering av protein, resulterar i en ihållande mikrovaskulär nätverkssvar 4-6. Det system som beskrivs här kan användas för att generera en yttre skikt för avgivning av angiogena proteiner, såsom FGF-1 (figur 2). Storleken på det yttre skiktet kan varieras baserat på sammansättningen och koncentrationen av alginat som används (figur 3). Storleken av detta yttre skikt kan spela en viktig roll för framgången av systemen. Egenskaperna hos det yttre skiktet kan påverka både frisättning av terapeutiska molekyler i den omgivande vävnaden och transport av näringsämnen och signalmolekyler till cellerna i det inre alginat. Det yttre skiktet egenskaper måste optimeras för en given tillämpning. För leverans av FGF-1, kan frisättning uppnås för upp till 30 dagar beroende på alginat formuläretordning (Figur 4) 7, 8.
Kliniska prövningar med öar inkapslade i alginat mikrokapslar har visat lovande som en behandling för typ I-diabetes. Emellertid är ett stort antal cellöar som krävs för effektivitet på grund av dålig överlevnad efter transplantation. Förmågan att inkapsla öarna i flerskiktade mikrokapslar i vilka en angiogen proteinet frisätts från det yttre skiktet kan öka viabiliteten av transplanterade öar. Denna förbättrade lönsamhet skulle minska antalet holmar som krävs för behandling, ökar potentiella kliniska effekten och tillgänglighet av dessa behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av US Department of Veterans Affairs (Washington DC), bidrag 0852048 och 0731201 och 0.854.430 från National Science Foundation (Arlington, VA), och bidrag RO1 DK080897 från National Institutes of Health (Bethesda, MD) . Mr Khanna fick stöd från en generös donation av Mr Edward Ross och Dr Monica Moya från Bill & Melinda Gates Foundation (Seattle, WA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads. J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation. Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).
- Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration. Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).
- Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering. Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells. Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1. J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).
