Medicine

慢性缩窄大鼠坐骨神经疼痛过敏测试

Published: March 13, 2012 doi: 10.3791/3393

Paul J. Austin¹, Ann Wu¹, Gila Moalem-Taylor¹

¹School of Medical Sciences, University of New South Wales

Summary

由于手术简单和健壮的行为结果，坐骨神经慢性缩窄是神经痛卓越的动物模型之一。手术后24小时内，疼痛过敏建立并可以使用冯弗雷触觉（机械测试）和足底的镇痛米（热试验）的定量测定。

Abstract

慢性神经性疼痛，从中央或周围神经系统的损害，是一种普遍的和虚弱的状态，影响7-18人口的^1,2％。症状包括自发性疼痛（刺痛，烧灼，电休克一样），感觉迟钝，感觉异常，痛觉异常（通常非疼痛刺激产生疼痛）和痛觉过敏（增加疼痛刺激的反应）。感觉症状与行为障碍，如失眠和抑郁，病态的合作。为了研究慢性神经痛几个模仿周围神经损伤的动物模型已开发，使用最广泛的是贝内特和谢的（1988）单方面坐骨神经慢性压迫性损伤^{（CCI）3（} 图1）。在这里，我们提出一个表演CCI和测试疼痛过敏的方法。

CCI是在麻醉下进行，一方面通过使暴露坐骨神经亲属的切口，并通过切割之间的臀肌浅和股二头肌肌肉结缔组织。四个铬肠道结扎坐骨神经周围松散地绑在1毫米的间隔，只是阻挡而不是逮捕epineural的血流量。关闭伤口缝合肌肉和皮肤中的主食。然后，动物被允许恢复从手术前24小时开始疼痛过敏测试。

行为测试，老鼠被放入测试设备，并允许习惯于测试过程。测试的区域是中旬的后肢跖面（ 图2），属于坐骨神经分布区域内。通过机械刺激使用电子动态足底冯弗雷触觉或手册·冯·弗雷毛发⁴受伤和未受伤的后爪机械痛阈值评估。机械撤出门槛是施加最大的压力（克），触发爪子撤出。热退缩潜伏期哈格里夫斯等人（1988）首次描述，测量，后肢被暴露在辐射热束通过一个透明的玻璃表面，使用足底镇痛米^5,6。记录的时间为受伤和未受伤的后爪缩爪退缩潜伏期的热量刺激。继CCI的，机械的退出门槛，以及受伤的爪子热退缩潜伏期均明显减少，比基线测量和未受伤的爪子（ 图3）。周围神经损伤与疼痛过敏测试相结合的CCI模型提供了一个模型系统调查的潜在治疗药物的有效性，修改慢性神经性疼痛。在我们的实验室中，我们利用热和机械灵敏度的后爪一起CCI调查的发病机制的神经免疫相互作用的作用治疗神经性疼痛。

Protocol

1。慢性坐骨神经

无菌技术应该用于外科手术。外科工作表面用70％乙醇消毒和灭菌准备提前无菌文书（例如，罚款的剪刀，镊子，拉钩），纱布，订书钉和棉签。对于多次手术，清洁，并用70％乙醇或干大鼠之间的珠灭菌器resterilise文书。应戴口罩，头发的帽子和无菌手套。

收缩的神经，切成约3厘米长的小件浸泡在无菌生理盐水准备铬肠缝合，以防止干燥。关闭伤口，使用市售无菌丝线。

在室使用在O ₂ 5％异氟醚诱导的大鼠麻醉，然后提供2％异氟醚在O _2，通过自定义作出口罩和监测在程序的anesthetised的动物。常见的替代麻醉药吸入氟烷或腹腔钠苯巴比妥。作为N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，氯胺酮，应避免，因为这些受体在神经性疼痛的发展的重要。
刮胡子的大鼠的左后腿。然后，放置到一个热调节的加热垫的动物在37℃，适用于润滑眼药膏的眼睛。
三个70％的异丙醇和碘溶液备用应用消毒剃光面积。
与老鼠躺在其胸部/胸部，提升左后腿和中与的femor位置保持在90°至脊椎上使用脚胶带。
请在皮肤切口平行，但低于femor 3-4毫米，并从皮肤由通过结缔组织切割的切口周围的肌肉。
使用钝的剪刀，切通过臀肌浅和二头肌之间的结缔组织，股四头肌肌肉。
使用拉钩扩大两肌肉之间的差距，使坐骨神经清晰的可视化。
使用弯曲的钝头镊子，微型剪刀，轻轻地约10毫米坐骨神经周围结缔组织（近端的坐骨神经trifurcation的）。
在显微镜下和良好的光源，配合双结连字（铬肠4.0，爱惜康，美国），相距1毫米到坐骨神经trifurcation的，近端。对于每个结扎，用一个单一的宽松循环的开始，然后抓住接近循环的两端，并拧紧，直到循环只是勉强舒适和沿神经结扎不滑动。举行的循环在适当的位置，放置第一完成结上的第二个循环。最后，周边1mm结扎切断，有始有终。收缩的神经应该是最小的，如果观察一个简短的抽搐立即停止，以防止日逮捕Ëepineural血流量。导致过度拧紧了结扎切断，自残（自残），既不必要的副作用，其中排除成功疼痛过敏测试。
使用缝线（Mersilk 5.0，爱惜康）关闭固定皮肤肌肉层和主食（Autoclip，9毫米）。接下来，用碘液（Riodine）消毒伤口。
密切观察大鼠在麻醉恢复期，并允许它恢复在单独的笼子里，平板纸的床上用品（标准畜牧业床上用品的），为了防止无意识的动物窒息。
给予任何手术后镇痛的调查之前，应考虑到这可能会干扰与疼痛过敏测试。事实上，有证据表明局部麻醉，利多卡因，在伤停补时阶段的应用，可以改变神经痛的发展，并减少前⁷周的痛觉过敏程度。为进一步讨论这个M东北黑钙土看到⁸ Bennett 等人的审查。

2。疼痛行为的测量

在实验开始前几天，每天处理的大鼠建议，以习惯的老鼠，其处理程序，减少咬的压力和风险。
行为测试之前，需要习惯于大鼠的测试程序和动物外壳。测试环境应保持安静，并很好的控制，具有恒定的温度和湿度水平，每个测试会话类似在一天的时间进行。
疼痛过敏测试应执行之前，CCI（基线）和CCI后不同时间点几次，所需。

3。机械痛阈值

在一天的测试，地方大鼠成高架地板测试网笼15-30分钟前撤回阈值测量，允许笼勘探和groo的的明活动，停止和老鼠变得轻松和平稳。
使用一个动态的足底冯弗雷触觉乌戈·巴西莱（意大利），位置与长丝触摸刺激单位直接下中旬的后肢足底表面，避免了金属丝网，按开始键。这升降机的机械刺激增加力量的后肢足底表面的长丝。

手册·冯·弗雷毛发一系列增加直径校准诱导特定的力量时，适用于皮肤的细丝。它们可以被用来作为替代电子动态足底冯弗雷测量缩爪阈值，如前面所述⁴触觉。也有电子冯·弗雷aesthesiometers（如印约理事会），美国，瑞典和Somedic几种可供选择的制造商。

记录从受伤和健侧hindpa机械撤出门槛WS，在平衡重的顺序。此装置适用于压力的爪子和戒断反应时，系统会自动记录和显示应用（克）的最大力量。如果一个含糊的反应时（即在行走或修饰的情况下），重复的刺激，并再次记录阈值。后肢刺激后舔或晃动，伴有疼痛是一种行为的迹象。
重复机械性刺激与刺激之间约5分钟的间隔的3倍，记录阈值，然后计算缩爪阈值的平均值。

4。热退缩潜伏期

在实验开始前，应调整的红外（IR）的足底测试仪器的热强度。在我们的实验室中，我们调整给天真大鼠约10秒平均爪退缩潜伏期的红外线强度，我们定在20秒截止延迟，以避免组织大坝年龄失败删除爪子的情况下。

在一天的测试，地方大鼠成玻璃地板测试测量延迟15-30分钟前笼，允许笼勘探和疏导活动，停止和大鼠变得轻松和平稳。
使用直接下中旬足底表面的后肢足底热镇痛仪（乌戈·巴西莱，意大利），位置的红外源，按下启动键。这暴露的后肢足底表面的热辐射光束通过一个透明的玻璃表面。也有替代足底热镇痛手段（如印地安人条约理事会，美国和Stoelting，美国）制造商。
记录从受伤和未受伤的后爪退缩潜伏期，在平衡重的顺序。此装置会自动记录撤回爪子从热源热刺激发病（秒）的时间。如果发生一个含糊的反应（即在案件ambulaTION或修饰），重复的刺激和记录再次延迟。后肢刺激后舔或晃动，伴有疼痛是一种行为的迹象。
约5分钟刺激之间的间隔至少3次重复热刺激，记录的潜伏期，然后计算平均缩爪潜伏期。

4。代表结果

机械撤出阈值和热退缩潜伏期大鼠同侧（受伤）和对侧（健侧）的爪子的一个例子是前（基线）和CCI 图3A和图3B后2-12天。从这些数字可以看出，CCI导致机械撤回阈值和同侧后肢热撤出潜伏期显着减少，说明存在的机械和热痛过敏，慢性神经痛两种功能。

图1。示意图说明CCI模型结扎的定位。这种神经性疼痛的动物模型，涉及四个宽松的铬肠结扎坐骨神经在大腿中部的水平，安置。它导致受伤，只有部分的传入脚和随后的后肢疼痛过敏。

图2。疼痛测试使用的后肢面积图。中期跖面的脚垫后，由红色虚线圆圈表示，用于疼痛测试。坐骨神经末端分支支配，大多是由该区域。脚跟和脚掌，应避免由于差分皮肤敏感。

3.JPG“/>
图3。在大鼠坐骨神经慢性收缩后的疼痛过敏。 CCI后，有一个缩爪阈值显着减少机械刺激（A）和（B）在受伤的热刺激缩爪潜伏期（同侧），后肢比健侧（对侧）后肢（P均<0.01重复测量2方差分析）。数据显示，平均±SEM，每组7只大鼠。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CCI是一种广泛使用的外周神经损伤模型慢性神经痛。它是相对简单的执行，并产生损伤后一个月至少有一个强大和稳定的疼痛过敏。继CCI的，大鼠表现出受伤的后肢（一起举行的脚趾和足底弯曲，脚掌外翻），以及反复晃动，守卫和受伤的暗示在场的自发痛⁹后肢舔的姿势异常。除了感觉障碍，一些调查显示，CCI的唤起行为障碍，如扰乱社会互动，睡眠障碍，抑郁和焦虑样行为^10-13，但是这是在未能找到这样的行为障碍由他人^14,15。因此，CCI是常用调查的病理生理，和潜在的治疗药物，用于治疗神经性疼痛。

我们DESCR国际教育局单方面收缩左侧坐骨神经，但应注意到，许多实验者右侧坐骨神经CCI类似的疼痛和行为结果，。一些研究者可能会发现它更容易执行在一个特定的方面，由于霸道的手术，在实验中切换，而其他方面排除任何偏见。值得注意的是，已包括使用周围神经^16,17只有2结扎，缝合材料铬，如纯肠道和^{polyglactin（vicryl）18,19}在大鼠肠道以外的原程序的几个变化。 CCI模型，此外，也利用小鼠进行了修改，其中的过程是相同的，除了使用2-3结扎与各种缝合材料，包括铬羊肠线，尼龙，和普理灵^15,20,21。

这种模式的一个限制是CCI的大鼠之间的变异程度，由于variabiliTY缝线结绳记事生产的缢胸闷。这可以部分克服由有经验的研究员，以一致的方式进行手术。此外，用于结扎神经缝合材料的类型，也可以作出贡献的可变性，它被认为化学品从铬肠道调解^19,22在这个模型中观察到的一些行为和神经化学影响。特别应考虑到大鼠性别（男性与女性^）23岁（青年与老^）24,25，饮食²⁶和²⁷株，它可以显着地影响疼痛过敏的发展后，CCI的选择。

疼痛过敏测试，使用电子冯·弗雷触觉或手动用von Frey机械撤出门槛和足底镇痛（哈格里夫斯）米热退缩潜伏期的毛发，以及建立和重新疼痛过敏的小动物的责任量化措施。它们的使用，在与神经性疼痛模型相结合，广泛和允许直接爪子跨越不同的治疗方案的机械和热刺激的敏感性比较，大鼠不同菌株之间。应当指出的是，其他如针点刺试验和冷痛觉异常行为检测，也用于测试CCI引起的疼痛过敏^8。

同时，使用自反撤出机械或热刺激是在这个模型和其他神经性疼痛的重大举措，它最近被批评其与人类的症状和参与相当实验者偏见^28的相关性较差。因此，使用²⁹疼痛和自发发射的行为³⁰操作性的措施，如额外的典范，将是有益的。

然而，DESpite这些限制，CCI模型和缩爪测量疼痛过敏测试是为了解神经性疼痛的机制，并确定新的止痛目标的关键。在我们的实验室中，我们经常执行CCI和测量机械缩足阈值和热爪子撤出潜伏期，以了解神经免疫的相互作用有助于神经痛^31，评估调节免疫系统的潜力，以减轻疼痛过敏。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

动物实验，澳大利亚新南威尔士大学的动物护理和伦理委员会批准，并随后由国际疼痛研究协会发出的指引。

Acknowledgments

笔者想承认CCI模型贝内特和谢（1988）的原始描述。

部分支持这项工作是由国家健康与澳大利亚医学研究理事会（编号568637）和新南威尔士州办事处资助科学和医学研究为GMT。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic gut	Ethicon Inc.	G-211	4-0 thickness
Isoflurane	Delvet Pty. Ltd., Seven Hills, NSW	n/a
Mersilk	Ethicon Inc.	W-580	5-0 thickness
Autoclip	BD Biosciences	427631	9 mm stainless steel
Riodine	Orion	R1000802F	1% w/v iodine
Thermal plantar analgesia instrument	Ugo Basile	37370
Dynamic plantar aesthesiometer	Ugo Basile	37400