Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

के मात्रात्मक तुलना सीआईएस नियामक तत्व (CRE) क्रियाएँ ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर Published: December 19, 2011 doi: 10.3791/3395

Summary

लक्षण के लिए प्ररूपी परिवर्तन सीआईएस नियामक तत्व (CRE) है कि नियंत्रण जीन अभिव्यक्ति पैटर्न अनुक्रम में परिवर्तन से परिणाम कर सकते हैं. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में उपयोग करने के लिए प्राप्त तरीके मात्रात्मक जीन संशोधित या स्वाभाविक रूप से होने वाली CRE वेरिएंट द्वारा मध्यस्थता अभिव्यक्ति के स्थानिक और लौकिक पैटर्न के स्तर की तुलना कर सकते हैं.

Protocol

अवलोकन:

यह वीडियो एक मात्रात्मक ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (डी) में सीआईएस नियामक तत्व (CRE) दृश्यों के लिए जीन विनियामक गतिविधियों को मापने के लिए सक्षम प्रोटोकॉल को दर्शाता है. इस प्रोटोकॉल करने के लिए नियामक के पास गतिविधियों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती CRE रूपों, CRE alleles एक प्रजाति भिन्न प्रजातियों के बीच या orthologous Cres के भीतर पाया स्वाभाविक रूप से घटनेवाला.

1. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जीनोम में साइट विशेष संवाददाता transgenes के एकीकरण

ए रिपोर्टर transgene निर्माण

  1. एक पहला कदम के रूप में, किसी भी CRE अलग से एक पत्रकार सदिश है कि एक (1) attB बैक्टीरियल लगाव साइट साइट विशेष transgene 8-11 एकीकरण के लिए इस्तेमाल किया अनुक्रम, (2) एकाधिक क्लोनिंग (3) के अपस्ट्रीम साइट शामिल में जा क्लोन होगा मूल्यांकन heterologous प्रमोटर कि एक फ्लोरोसेंट के लिए (4) अनुक्रम कोडन द्वारा पीछा किया जाता हैप्रोटीन (जैसे EGFP या DsRed रूप).
  2. हालांकि किसी भी सदिश phiC31 मध्यस्थता साइट - विशिष्ट एकीकरण के लिए संगत कर सकते हैं वेक्टर रीढ़ की हड्डी में एक attB अनुक्रम शुरू करने, वेक्टर pS3aG12 14 addgene प्लाज्मिड भंडार से प्राप्त किया जा सकता द्वारा बनाई गई ( http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG पी आधारित vector15 परिवर्तन जिसमें दो जिप्सी insulators के SfIb विसंवाहक द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था के एक अनुकूलित संस्करण है, यह एक बढ़ाया कई क्लोनिंग साइट शामिल है, और एक 250 आधार जोड़ी एक attB अनुलग्नक साइट युक्त अनुक्रम के पास. ब्याज की Cres कई क्लोनिंग एक HSP70 न्यूनतम प्रमोटर और EGFP जीन है कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि नाभिक के लिए localizes के एक बढ़ाया संस्करण encodes के अपस्ट्रीम साइट में डाला जाता है.

बी रिपोर्टर transgenes की साइट - विशिष्ट एकीकरण

  1. Cres जिनकी गतिविधियों की तुलना हो रहे हैं का एक सेट के लिएघ संवाददाता transgene वैक्टर के एक भाग के रूप में, बनाया वैक्टर अलग ही जीनोमिक लैंडिंग साइट में एकीकृत कर रहे हैं. यहाँ phiC31 फेज इंटिग्रेस प्रोटीन बैक्टीरिया (attB) transgene वेक्टर में अनुलग्नक साइट और एक genomically स्थित फेज (attP) अनुलग्नक साइट 9 के बीच यूनिडायरेक्शनल पुनर्संयोजन catalyzes . कई समूहों 8-11 ट्रांसजेनिक लाइनों है कि एक attP साइट (तथाकथित लैंडिंग साइटों) में शामिल हैं और एक जीनोमिक 8 phiC31 का स्रोत है कि रोगाणु कोशिकाओं में इस प्रोटीन व्यक्त होते हैं की एक किस्म का बना दिया है. ये उड़ शेयरों ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र से आसानी से प्राप्त किया जा सकता है (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
  2. एक प्रकाशित प्रोटोकॉल का ब्यौरा मौजूद है ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला साइट विशेष रूप से phiC31 16 इंटिग्रेस का उपयोग कैसे बनाने के लिए . उपकरण और तकनीकी विशेषज्ञता ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लीnes अब कोई आवश्यकता है के रूप में कई विक्रेताओं (तालिका 1) किसके लिए इस सेवा को आउटसोर्स किया जा सकता है मौजूद है.
  3. Transgene व्यवहार काफी एक ऊतक से अगले 11 से भिन्न हो सकते हैं. इस प्रकार एक एकल attP लैंडिंग साइट सभी Cres, विकास के चरणों, और / या अध्ययन के ऊतकों के विश्लेषण के लिए इष्टतम नहीं है . यह सलाह दी जाती है के लिए कई अलग अलग लैंडिंग साइटों में ब्याज की एक CRE की गतिविधि का आकलन करने के लिए एक साइट है जहाँ CRE गतिविधि अंतर्जात लक्ष्य (ओं) जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के प्रतिनिधि है मिल.
  4. प्राप्त ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए यह सलाह दी जाती है उन्हें transgene के लिए homozygous. CRE गतिविधि आमतौर पर transgene की दो प्रतियां और मात्रात्मक मापन के लिए यह जरूरी है कि तुलना transgene प्रतियों की एक ही नंबर के साथ व्यक्तियों के बीच बना रहे हैं के साथ व्यक्तियों में अधिक मजबूत है. Homozygous व्यक्तियों balancer के गुणसूत्रों के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है है. अच्छी तरह से विशेषता लैंडिंग हालांकि साइटों के लिए, यह अक्सर हैimpler कुंवारी पुरुषों और महिलाओं को इकट्ठा करने के लिए, और अधिक तीव्र आँखों का रंग दो सदिश के साथ मिनी सफेद (छवि 1) जीन, के रूप में सफेद उत्परिवर्ती एकीकृत transgene वेक्टर द्वारा प्रदान बचाव व्यक्तियों में अधिक नाटकीय है द्वारा प्रदत्त phenotype के साथ उन लोगों के पार प्रतियां.

2. प्राप्त करने के उपयुक्त विकास मंच के नमूनों या ऊतकों

विकास में समय विश्लेषण के लिए नमूनों प्राप्त जब ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न (ओं) (ओं) endogenously, इसलिए समय था जब जांच के तहत CRE रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति को सक्रिय करना चाहिए होते हैं. ड्रोसोफिला के लिए, यह या तो भ्रूण, लार्वा, पोटा संबंधी या वयस्क चरणों किया जा सकता है. नीचे हमने एक वयस्क और रूपांतरित मक्खियों चरण विधि का वर्णन है, जो बाद puparium, एक हार्ड लार्वा त्वचा है कि स्थिर नमूना शामिल हैं, जब तक यह एक वयस्क के रूप में ecloses के अंदर जगह लेता है.

  1. ट्रांसजेनिक लाइनों का विस्तार करने के लिए specim सुनिश्चितसत्ता के उचित मंच उपलब्ध हैं जब confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए तैयार है. पुरुष और महिला मक्खियों - कई (10 ~ 5) के साथ दो शीशियों प्रत्येक सेट. बारी के दिनों में, शीशियों की एक से एक अप्रयुक्त शीशी मक्खियों टक्कर. एक सप्ताह के लिए इस दोहराएँ. दो सप्ताह के अंत तक, ट्रांसजेनिक फल मक्खियों उपलब्ध हो जाएगा कि लार्वा से वयस्क विकास के चरणों के लिए सीमा होती है.
  2. वयस्क मक्खियों मचान: puparium अंदर खर्च समय की अवधि में महिलाओं के लिए 98 घंटे और पुरुषों के लिए 102 घंटे है जब 25 में पाला डिग्री सेल्सियस प्रौढ़ मक्खियों को आसानी से हो सकता है जब वे puparium से उभरने (नामक eclosion) एकत्र कर सकते हैं. यह timepoint 0 घंटे पोस्ट eclosion माना जा सकता है. वयस्क मक्खियों के विश्लेषण के लिए आवश्यक timepoint तक पाला जा सकता है है. उदाहरण के लिए, CRE मेल oe1 कहा जाता है कि डी. के वयस्क oenocytes में desatF जीन की अभिव्यक्ति नियंत्रण मेलानोगास्टर महिलाओं eclosion लेकिन CRE गतिविधि swi के तुरंत बाद सक्रिय नहीं हैपर एक 14 दिन के बाद tches. जब सही मंच प्राप्त है, मक्खियों anesthetize और एक स्लाइड पर हेलोकार्बन तेल की एक बूंद में और बैठाना confocal मूल्यांकन करने के लिए आगे बढ़ना.
  3. तीसरे instar लार्वा चरण puparium बनाई है के अंत में: कायापलट के दौरान नमूनों मचान. हालांकि इस स्तर पर पशु अभी भी तकनीकी रूप से एक तिहाई instar लार्वा है, इस विकास मंच आसानी से पहचाना है के रूप में गैर - मोबाइल नमूना है, puparium नरम और सफेद है, और spiracles (2A छवि) everted है. यह timepoint 0 घंटे Puparium गठन (hAPF) के बाद माना जा सकता है है. इस स्तर पर, पुरुषों द्विपक्षीय कि पारभासी हलकों के रूप में दिखाई देते हैं शरीर के मध्य के पास स्थित gonads की उपस्थिति से महिलाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है (छवि में बॉक्सिंग 2A और 2A में काला तीर द्वारा संकेत ").

1. कायापलट की लंबाई पर आधारित मचान है:

0 hAPF में, नमूनों एक ताजा शीशी को हस्तांतरित किया जा सकता हैया पेट्री पकवान एक का उपयोग कर पेंट ब्रश सिक्त. नमूनों के लिए बाहर सुखाने से रखने के लिए, Kimwipe का एक टुकड़ा जोड़ने और पानी से गीला. स्थानांतरण शीशी या वांछित hAPF तक पकवान एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर.

2. दिखाई morphological विशेषताओं द्वारा मचान:

यह अक्सर असुविधाजनक 0 hAPF नमूनों के संग्रह के बाद एक विशिष्ट timepoint CRE गतिविधि के लिए नमूनों का विश्लेषण. वैकल्पिक रूप से, एक एक सुविधाजनक समय पर सही ढंग से नमूनों का मंचन किया और कई रूपात्मक (नीचे) विस्तृत मार्करों कि puparium के माध्यम से या puparium हटाने (छवि 2) के बाद दिखाई दे रहे हैं की उपस्थिति की स्थिति पर आधारित विश्लेषण के लिए की पहचान कर सकते हैं.

2a. रूपांतरित चरण approximating के लिए morphological मानदंड:

  • 0 hAPF: व्हाइट prepupa मंच है जहां लार्वा चलती रुक जाता है, पूर्वकाल spiracles everted (. अंजीर 2A में तीर), पार्श्व ट्रेकिआ दिखाई; नरम सफेद puparium (छवि 2A) .
  • ~~ 14 hAPF:Tanned और कठोर Puparium, सिर everted थैली, पार्श्व ट्रेकिआ और gonads कम अलग, पैर और पंख पूरी तरह से पेट के साथ बढ़ाया, Malpighian प्रमुख और नहीं अभी तक हरी tubules (छवि में धराशायी बॉक्स्ड क्षेत्र 2B), आँखों unpigmented हैं (छवि 2B ') .
  • ~ 25 hAPF: दो रंग में समानांतर Malpighian प्रमुख और हरे रंग tubules (चित्र 2C में बॉक्सिंग क्षेत्र धराशायी).
  • काले हरी पीले शरीर Malpighian tubules (लाल. चित्र 2 डी में arrowhead) के पूर्वकाल छोर के बीच तैनात: ~ 40 hAPF .
  • ~ 50 hAPF: पीला Malpighian (चित्र में बॉक्स्ड क्षेत्र 2E 2E''में बढ़े) tubules और आँखों के मध्य बिंदु पर तैनात शरीर रंग में एम्बर अगर सफेद जीन (लाल आँखों का रंग के लिए आवश्यक) के लिए जंगली प्रकार . आँखों का रंग इस स्तर पर कमी है जब सफेद उत्परिवर्ती जीन मिनी सफेद है कि एकीकृत संवाददाता transgene वेक्टर (छवि 2E) का हिस्सा है phenotype द्वारा बचाया है .
  • सफेद (छवि 2 एफ ') के द्वारा बचाया .
  • ~ 80 hAPF: विंग ग्रे युक्तियाँ; Malpighian पेट के मध्य (चित्र 2 जी और 2 जी में बढ़े में बॉक्सिंग क्षेत्र ") के लिए पूर्वकाल के बीच स्थित tubules, पेट क्षेत्रों और पेट tergites पर bristles के बीच सिलवटों दिखाई (छवि 2 जी रहे हैं और "2G), और बचाया आँखों का रंग चमकदार लाल (छवि 2 जी ') है.
  • ~ 90 hAPF: पंख काले अन्धेरा; Malpighian tubules और पीले शरीर tergites की कमाना द्वारा obscured, वक्ष (तीर) और पेट bristles परिपक्व और अंधेरे (2H छवि) कर रहे हैं, और हरी जातविष्ठा पेट के पृष्ठीय पीछे टिप (प्रकट होता है चित्र 2H.'').

नोट:

  1. ला मेंते चरणों कायापलट के नमूनों की सेक्स जननांग (चित्र 2I. और 2J में arrowheads) आकारिकी या पुरुष पैरों के पहले सेट पर अंधेरे सेक्स कंघी की उपस्थिति द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.
  2. मचान में आगे सटीक अतिरिक्त रूपात्मक मार्कर के रूप में 17 पहले से वर्णित के विचार के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

डी. puparium से नमूना हटायें चरण:

  1. प्रयोगशाला टेप का प्रयोग एक विच्छेदन बोर्ड चिपचिपा सतह का सामना करना पड़ ऊपर के साथ टेप पैकिंग का एक टुकड़ा का पालन करें.
  2. एक पेंट ब्रश गीले और pupariated नमूनों को नमी लागू. एक पेंट ब्रश का प्रयोग, Kimwipe के लिए नमूनों को हस्तांतरण.
  3. पैकिंग टेप करने के लिए संदंश या एक तूलिका, हस्तांतरण नमूनों का प्रयोग और पृष्ठीय ऊपर का सामना करना पड़ सतह (puparium की घुमावदार पक्ष) के साथ पालन.
  4. नमूनों ~ 15 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें. ड्राई puparium बहुत उन है कि नम हैं तुलना करने के लिए खुला आसान कर रहे हैं. इस बिंदु पर नमूनों coarsely रूपात्मक द्वारा मंचन किया जा सकता है हैpuparium के माध्यम से दिखाई मार्करों.
  5. संदंश का प्रयोग, उत्तरोत्तर पूर्वकाल operculum puparium शुरुआत खोलने और पीछे के अंत की दिशा में आगे बढ़ना. यदि एक अधिक ठीक पैमाने विच्छेदन के लिए एक विशिष्ट ऊतकों को अलग करने की जरूरत है इस पीबीएस समाधान के साथ एक घड़ी गिलास में किया जा सकता है है. अन्यथा, एक खुर्दबीन स्लाइड पर चिपचिपा HC700 हेलोकार्बन तेल (सिग्मा Aldrich) की एक बूंद के लिए pupae हस्तांतरण.
  6. किसी स्लाइड पर नमूनों बैठाना, stereomicroscope का उपयोग कर, और ऊपर वर्णित (2a अनुभाग) एक नमूना चरण मापदंड निर्धारित किया जा सकता है का उपयोग कर ..

3. एक पूरी माउंट नमूने में Confocal रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति की सूक्ष्म मूल्यांकन

  1. पूरे माउंट नमूनों के लिए, या तो 4X या 10X उद्देश्यों का उपयोग करें. पारा दीपक जोखिम से प्रेरित प्रतिदीप्ति का उपयोग, या वैकल्पिक रूप से उजले क्षेत्र में देखने के द्वारा, ऑप्टिकल क्षेत्र में स्थिति नमूना खुर्दबीन मंच समायोजित तो ध्यान में नमूना लाने.
  2. Confocal microsco का उपयोगपे सॉफ्टवेयर, EGFP के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (या एक उपयुक्त तरंग दैर्ध्य जब एक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर) समायोजित.
  3. एक नमूना photobleaching रोकने के लिए, 5-10% की एक लेज़र तीव्रता के साथ शुरू करते हैं. यदि संकेत underwhelming है, तो तीव्रता में वृद्धि के रूप में की जरूरत है.
  4. आदेश में confocal छवियों के लिए संकेत शोर अनुपात करने के लिए सुधार करने के लिए, सॉफ्टवेयर सेटिंग्स सक्षम है कि को दोहराने के स्कैन से औसत पिक्सेल माप, जैसे Kalman औसत या लाइन और ढेर औसत हमारे अनुभव में तीन स्कैन के लिए Kalman औसत छवि संग्रह के लिए समय बहुत लंबे समय बनाने के बिना शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार.
  5. CRE गतिविधि के मात्रात्मक तुलना के लिए यह आवश्यक है कि एक नमूना के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता कई पिक्सल संतृप्त नहीं है. Z अनुभाग जहां प्रतिदीप्ति सबसे तीव्र प्रतीत होता है का प्रयोग, सेटिंग्स समायोजित है कि इतना कुछ पिक्सल संतृप्त कर रहे हैं. यह एक संतृप्ति चेतावनी लुकअप तालिका के लिए स्विचन और चैनल वोल्टेज, लाभ का समायोजन करके किया जा सकता है, और ऑफसेटसेटिंग्स जहां कुछ पिक्सल संतृप्त कर रहे हैं. अन्त में, आदेश में एक नमूना से पर्याप्त संकेत इकट्ठा करने के लिए यह अक्सर confocal एपर्चर समायोजित करने के लिए आवश्यक है.
  6. एक बार इष्टतम सेटिंग्स निर्धारित कर रहे हैं, z - स्कैन चलाते हैं.
  7. जब स्कैन पूरा हो गया है एक प्रक्षेपण छवि ढेर में बदलने और टैग्ड छवि फ़ाइल स्वरूप या "झगड़ा" में इस छवि को बचाने.

नोट:

  1. यह सभी को दोहराने के नमूनों और रिपोर्टर transgene लाइनों है कि CRE गतिविधियों का एक मात्रात्मक तुलना में शामिल किया जाएगा के लिए एक ही confocal सेटिंग्स का उपयोग करना आवश्यक है.

4. सीआईएस नियामक तत्व गतिविधि को बढ़ाता

जबकि कुछ confocal अधिग्रहण सॉफ्टवेयर प्रक्षेपण छवियों के आगे प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है, हम स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि जम्मू सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करें confocal छवियों 18 मूल्यांकन पसंद करते हैं. छवि का प्रयोग जम्मू 18 दर्ज GFP अभिव्यक्ति पैटर्नएक निर्दिष्ट क्षेत्र के भीतर पिक्सेल मूल्य आँकड़े के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है. हालांकि छवियों ग्रे स्केल में होने की जरूरत नहीं हम ऐसा करने के लिए पसंद करते हैं.

  1. छवि जम्मू कार्यक्रम के साथ शुरू कर दिया है, एक TIFF छवि को खोलने के लिए मूल्यांकन किया जाना है.
  2. मुक्तहस्त चयन करें बटन पर क्लिक करें और नमूना जहां quantitation वांछित है के क्षेत्र रूपरेखा, चित्रा 3 में धराशायी पीले सीमा के भीतर क्षेत्र उदाहरण के लिए. (देखें नीचे एक एक क्षेत्र quantitate के चयन के बारे में ध्यान दें.)
  3. एक पिक्सेल मूल्य आंकड़ा प्राप्त करने के लिए, टैब विश्लेषण पर क्लिक करें और तब उपाय का चयन करें. एक परिणाम बॉक्स क्षेत्र दिखा दिखाई देगा, और मतलब है, न्यूनतम और अधिकतम पिक्सेल मूल्य स्कोर. मतलब पिक्सेल मूल्य स्कोर के रिकार्ड को दोहराने के नमूनों के लिए पिक्सेल मूल्य आँकड़े उत्पन्न दोहराने (नोट: ख को दोहराने के संख्या के बारे में देखें).
  4. डैश्ड लाल बॉर्डर के भीतर उदाहरण के लिए क्षेत्र चित्रा 3 में, हम एक नियंत्रण क्षेत्र है जहां CRE सक्रिय नहीं है से एक दूसरे मतलब पिक्सेल मूल्य इकट्ठा करने की सलाह देते हैं. यह उत्तरार्द्ध वैलमाप से पृष्ठभूमि के प्रभाव को दूर करने के लिए एक समायोजित मतलब पिक्सेल मूल्य मिल ue पूर्व मूल्य से subtracted किया जा सकता है है. हमारे अनुभव में इस को दोहराने के नमूनों (नोट ग नियंत्रण क्षेत्र के लिए आकार चयन के बारे में देखें) के बीच भिन्नता को कम कर देता है.
  5. एक CRE और मतलब की मानक त्रुटि के लिए औसत नियामक गतिविधि की गणना को दोहराने के नमूनों से समायोजित मतलब पिक्सेल मूल्यों का उपयोग करें. यह नियामक गतिविधि मान और त्रुटि की माप अन्य रिपोर्टर transgenes जहां CRE अनुक्रम अलग है (उदाहरण चित्रा 3 के लिए) की तुलना में किया जा सकता है.

नोट:

  1. छवि जम्मू उपयोगकर्ता के लिए अनुमति देता है एक परिभाषित आकार और क्षेत्र से एक मतलब पिक्सेल मूल्य स्कोर निर्धारित किया जाएगा का चयन करें. हालांकि, नमूना आकार के रूप में अक्सर बदलता हम मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग प्रत्येक नमूना के लिए मूल्यांकन किया जाना क्षेत्र को निर्दिष्ट करने के लिए पसंद करते हैं.
  2. मतलब नियमित की एक बेहतर आकलन में प्रतिकृति की एक बड़ी संख्या (एन) का परिणामCRE के लिए एक दिया latory गतिविधि. हमें लगता है कि 4 और 8 के बीच एक एन आम तौर पर पर्याप्त है.
  3. हमारे अनुभव में नियंत्रण चयनित क्षेत्र के आकार थोड़ा नियंत्रण क्षेत्र के लिए मापा मतलब पिक्सेल मूल्य पर प्रभावित किया है. सामान्य में, हम एक क्षेत्र आकार में ब्याज के क्षेत्र के लिए आनुपातिक का चयन करें.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

एक डी के एक जंगली प्रकार संस्करण मेलानोगास्टर CRE, dimorphic 13 तत्व कहा जाता है, महिला pupae (छवि 3A) के A6 का पेट खंड में एक EGFP संवाददाता अभिव्यक्ति के उच्च स्तर पर ड्राइव. इस तत्व के भीतर एक 13 आधार जोड़ी अनुक्रम DSX प्रतिलेखन कारक के लिए एक बाध्यकारी साइट हो पाया था, और इस क्रम के vivo महत्व में इस CRE के लिए नियामक गतिविधि को बढ़ाता है जब इस बंधनकारी साइट mutated है द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. जंगली प्रकार dimorphic तत्व के लिए 100 साल की नियामक गतिविधि ± 5%, को ध्यान में रखते हुए इस DSX साइट के उत्परिवर्तन reg कम28 से ulatory गतिविधि ± 3%. इसी प्रकार की तुलना intraspecific CRE alleles के लिए या अलग - अलग प्रजातियों से orthologous Cres के बीच नियामक गतिविधियों के किया जा सकता है है. उदाहरण के लिए, महिला खंड A6 में EGFP के स्तर डी. द्वारा संचालित पर विचार 100 के एक नियामक गतिविधि के रूप में मेलानोगास्टर एस गुआंगज़ौ तनाव ± 4%, प्रजातियों के लिए orthologous Cres डी. simulans और डी willistoni क्रमशः विनियामक 75 से बराबर गतिविधियों ± 4% और 0 ± 0% (3B छवि) के अधिकारी पाए गए .

चित्रा 1
चित्रा 1 सफेद बचाव आँख phenotype की तीव्रता का प्रयोग ट्रांसजेनिक लाइनों homozygous बनाने के लिए.. आदेश में मात्रात्मक संवाददाता transgenes का मूल्यांकन करने के लिए यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक नमूना वही रिपोर्टर transgene जीनोटाइप है. (ए) एक attP लैंडिंग साइट अनुक्रम के साथ एक सफेद जीन उत्परिवर्ती आनुवंशिक पृष्ठभूमि साइट के लिए उपयोग किया जाता है pecific transgene एकीकरण. ट्रांसजेनिक व्यक्तियों (बी) hemizygous और एकीकृत वेक्टर के लिए (सी) homozygous आमतौर पर एकीकृत मिनी सफेद जीन की प्रतियों की संख्या से बचाया आँखों का रंग phenotype की तीव्रता द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है. Homozygous लाइनों क्रॉसिंग अंधेरे आँख रंग phenotype के साथ (सी) पुरुष और महिला मक्खियों द्वारा स्थापित किया जा सकता है है.

चित्रा 2
चित्रा 2 रूपात्मक मार्कर का उपयोग करने के लिए ड्रोसोफिला के लिए रूपांतरित चरण का निर्धारण. एक वयस्क फल मक्खी लार्वा से कायापलट के दौरान, नमूना stereotypic morphologies है कि सेक्स और अनुमानित विकास के चरण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक श्रृंखला के माध्यम से संक्रमण. बिहार में नमूने उनके puparium से हटा दिया गया है. ए, ई, एफ जी, और एच पैनल में बॉक्स पैनल के लिए क्रमशः क्षेत्रों में तेजी से बढ़ी "ई", एफ "जी", और एच संकेत मिलता है ".

</ HtmlSrc = "/ files/ftp_upload/3395/3395fig3.jpg" /> "चित्रा 3"
चित्रा 3 सीआईएस नियामक तत्व गतिविधियों के मात्रात्मक तुलना. सभी नमूनों के लिए EGFP-रिपोर्टर जीन एक विशेष dimorphic तत्व द्वारा मध्यस्थता अभिव्यक्ति महिलाओं में puparium गठन के बाद 80 घंटे में मूल्यांकन किया गया था. प्रत्येक छवि के शीर्ष पर संख्या नमूना है कि A6 का पेट क्षेत्र के लिए मतलब पिक्सेल मूल्य (धराशायी पीले सीमा के भीतर क्षेत्र के रूप में ऊपरी बाएँ सबसे छवि के लिए संकेत) शून्य मतलब के रूप में परिकलित किया जाता है के लिए स्तर EGFP अभिव्यक्ति है A4 खंड के लिए पिक्सेल मूल्य (पृष्ठभूमि सुधार, डैश्ड लाल बॉर्डर के भीतर क्षेत्र के रूप में ऊपरी बाएँ सबसे छवि के लिए संकेत). प्रत्येक रिपोर्टर के लिए चार transgene प्रतिकृति के लिए एक मतलब खंड A6 पिक्सेल मूल्य की गणना करने के लिए मूल्यांकन किया गया. नियामक गतिविधि% (ए) जंगली प्रकार के या (बी) गुआंगज़ौ एस तनाव महिला पिक्सेल मूल्य मतलब ± SEM के रूप में की सूचना दी है. (ए) के एक जंगली प्रकार एलील रखने महिलाओं के लिए GFP अभिव्यक्तिDimorphic तत्व और एक उत्परिवर्ती संस्करण जहां DSX प्रतिलेखन कारक के लिए एक एकल बाध्यकारी साइट ablated गया था. इस उत्परिवर्ती बाध्यकारी साइट 28 dimorphic तत्व गतिविधि कम ± जंगली प्रकार के अनुक्रम के 3%. (बी) orthologous दृश्यों के लिए विनियामक गतिविधियों के डी. तुलना करें मेलानोगास्टर (एस केण्टन तनाव) dimorphic तत्व. डी. द्वारा GFP अभिव्यक्ति की मध्यस्थता को ध्यान में रखते मेलानोगास्टर dimorphic तत्व एलील 100% के रूप में, संबंधित प्रजातियों से orthologous दृश्यों डी. simulans और डी willistoni क्रमशः 75 साल की गतिविधियों के अधिकारी ± 4% और 0 ± 0%.

6. सामग्री

सामग्री नाम टाइप कंपनी सूचीपत्र संख्या टिप्पणी
साइट - विशिष्ट transgene एकीकरण सेवा सर्वश्रेष्ठ जीन योजना एच एक लैंडिंग साइट चुनें, transformant लाइनों प्राप्त
हेलोकार्बन तेल अभिकर्मक सिग्मा Aldrich H8898 Confocal इमेजिंग के लिए नमूनों को माउंट करने के लिए खेतों में प्रयुक्त किए गए
# 5 संदंश Dumont उपकरण ललित विज्ञान उपकरण 11252-40 बताया ठीक है और विच्छेदन के लिए टिकाऊ
SZ61 ज़ूम स्टीरियो माइक्रोस्कोप उपकरण ओलिंप अनुकूलन फल के साथ काम करने के लिए उत्कृष्ट प्रकाशिकी मक्खियों
FluoView confocal सूक्ष्मदर्शी उपकरण ओलिंप अनुकूलन उच्च संकल्प confocal छवियों प्रदान करता है

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सीआईएस नियामक तत्वों जीनोमिक प्रोग्राम है कि जीन की अभिव्यक्ति जिससे और 1 विकास की प्रक्रिया पैटर्न निर्दिष्ट सांकेतिक शब्दों में बदलना, और दोनों morphological 2-4 मानव 5,6,19 लक्षण के लिए और प्ररूपी भिन्नता विकास अंतर्निहित परिवर्तन के लिए प्रमुख स्थानों रहे हैं. इस महत्व के बावजूद, Cres के लिए नियामक तर्क खराब समझ रहते हैं. इस समझ की कमी के लिए एक प्रमुख कारण उपयुक्त तरीकों की कमी करने के लिए मात्रात्मक Cres के कार्यात्मक दृश्यों की तुलना करने के लिए किया गया है. हम यहाँ मौजूद एक प्रोटोकॉल है कि डी. मेलानोगास्टर Cres के अध्ययन के लिए एक मात्रात्मक पहलू को जोड़ने के लिए सुधार के लिए transgenesis तरीकों पर capitalizes.

हमारे अनुभव में जब एक CRE नियामक गतिविधि को बढ़ाता है, को दोहराने के नमूनों के बीच भिन्नता समायोजित मतलब पिक्सेल मूल्य का 10% या उससे कम की है वही विकास मंच की जब प्रतिकृति (1) और (2) रिपोर्टर transgene हैउसी जीनोमिक लैंडिंग साइट में. बदलाव की यह राशि चित्रा 3 में प्रस्तुत Cres के लिए निर्धारित किया है कि के साथ संगत है, और स्थितियों जहां एक CRE के आनुवंशिक अलग संस्करण एक 10% से अधिक मूल्य के द्वारा विनियामक गतिविधियों में अलग करने के लिए इस मात्रात्मक पद्धति के उपयोग पर एक सीमा स्थानों. महत्वपूर्ण बात हालांकि, इस सीमा "कम" या "वृद्धि" है कि उन का अध्ययन Cres पहले का उपयोग करने के लिए जब अलग गतिविधि का वर्णन किया था गुणात्मक विवरण पर एक महत्वपूर्ण सुधार है.

जब एक CRE के संस्करण में जाना कर रहे हैं या करने के लिए मात्रात्मक उनके विनियामक गतिविधियों में अलग पाया, इस प्रोटोकॉल निर्धारित जो mutational मतभेद के लिए जिम्मेदार हैं या गतिविधि 12,13 अंतर के लिए योगदान के लिए संभव बनाता है. इन कार्यात्मक प्रासंगिक म्यूटेशन की पहचान करने की क्षमता एक आवश्यक पहला कदम है या transcri के लाभ और हानि के रूप में आणविक तंत्र, निर्धारितption कारक बाध्यकारी साइटों, CRE गतिविधियों को अलग करने के लिए कारण. आगे देख रहे हैं, अन्य ड्रोसोफिला Cres और अन्य मॉडल जीवों के लिए प्रोटोकॉल में इसी तरह के तरीकों के आवेदन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग CRE तर्क का एक बेहतर समझ में उभरने के लिए अनुमति चाहिए. यह एक कार्यात्मक कार्यात्मक तटस्थ म्यूटेशनों के दलदल से प्रासंगिक CRE म्यूटेशनों भेदभाव करने की क्षमता शामिल है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

मेलिस्सा विलियम्स और पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए चार अनाम समीक्षक; युद्ध के लिए अनुसंधान फैलोशिप के लिए Dayton ग्रेजुएट स्कूल विश्वविद्यालय, और विश्वविद्यालय Dayton जीवविज्ञान निकोलस Gompel और इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए उनके योगदान के लिए बेंजामिन Prud'homme: हम धन्यवाद विभाग और TMW के लिए अनुसंधान का समर्थन के लिए अनुसंधान संस्थान (UDRI). इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 11BGIA7280000 के द्वारा TMW समर्थित किया गया.

References

  1. Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , Academic Press. (2006).
  2. Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
  3. Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
  4. Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
  5. Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
  6. Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
  7. Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
  8. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
  9. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
  10. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
  11. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. , United States. (2008).
  12. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
  14. Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
  15. Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
  16. Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , England. (2007).
  17. Drosophila: A laboratory handbook. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).
  18. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  19. Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).

Tags

विकास जीवविज्ञान 58 अंक सीआईएस नियामक तत्व CRE सीआईएस नियामक मॉड्यूल बढ़ाने साइट विशिष्ट एकीकरण संवाददाता transgenes confocal माइक्रोस्कोपी विनियामक तर्क प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों,
के मात्रात्मक तुलना<em> सीआईएस</emट्रांसजेनिक में> नियामक तत्व (CRE) क्रियाएँ<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Rogers, W. A., Williams, T. M.More

Rogers, W. A., Williams, T. M. Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (58), e3395, doi:10.3791/3395 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter