Summary
Det omvända genetik systemet för Rift Valley-feber-virus MP-12 vaccinstam är ett användbart verktyg för att skapa ytterligare MP-12 mutanter med ökad dämpning och immunogenicitet. Vi beskriver protokollet att generera och karaktärisera NSS muterade stammar.
Abstract
Rift Valley-feber-virus (RVFV), som orsakar hemorragisk feber, neurologiska störningar eller blindhet hos människor, och en hög grad abort och fosterskador hos idisslare 1, har klassificerats som en HHS / USDA överlappning välja agent och en riskgrupp 3 patogen. Det tillhör släktet Phlebovirus i familjen Bunyaviridae och är en av de mest virulenta medlemmar av denna familj. Flera omvänd genetik system för RVFV MP-12 vaccinstammen 2,3 samt vildtyp RVFV stammar 4-6, inklusive ZH548 och ZH501, har utvecklats sedan 2006. MP-12-stam (som är en riskgrupp 2 patogen och en icke-select agent) är mycket försvagade av flera mutationer i sitt M-och L-segment, men ändå bär virulenta S etapper RNA 3, som kodar en funktionell virulens faktor, NSS. Den rMP12-C13type (C13type) transporterar 69% i-frame radering av NSS ORF saknar alla kända NSS funktioner, medan den replikerar som efficma liksom MP-12 i VeroE6 celler som saknar typ I IFN. NSS inducerar en avstängning av värd transkription inklusive interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 och främjar nedbrytningen av dubbelsträngat RNA-beroende proteinkinas (PKR) på posttranslationella nivå. 9,10 IFN-beta är transkriptionellt uppregleras av interferon reglerande faktor 3 (IRF-3), NF-kB och aktivator protein-1 (AP-1), och bindningen av IFN-beta för att IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) stimulerar transkription av IFN-alfa gener eller andra interferon stimuleras gener (ISGs) 11, som inducerar värd antivirala aktiviteter, medan värd transkription förtryck inklusive IFN-beta genen av NSS förhindrar genen upregulations av dessa ISGs svar på virusreplikationen även IRF-3, NF-kB och aktivator protein-1 (AP-1) kan aktiveras genom RVFV7. . Således är NSS ett utmärkt mål för att ytterligare dämpa MP-12, och öka värd medfödda immunförsvaret genom att avskaffa IFN-beta undertryckande funktion. HärBeskriver vi ett protokoll för att skapa en rekombinant MP-12 kodning muterat NSS, och ger ett exempel på en screening metod för att identifiera NSS mutanter som saknar funktion för att undertrycka IFN-beta mRNA-syntes. Förutom sin viktiga roll i medfödd immunitet, är typ I IFN viktiga för mognaden av dendritiska celler och induktion av ett adaptivt immunsvar 12-14. Således NSS mutanter framkalla typ I-IFN är ytterligare dämpas, men samtidigt är mer effektiva på att stimulera värd immunsvar än vildtyp MP-12, vilket gör dem idealiska kandidater för vaccination metoder.
Protocol
1. Återvinning av rekombinant MP-12-kodning NSS mutation (er) från plasmid DNA 2
- Sprid barn hamstern njure (BHK) / T7-9 celler 15 som stabilt uttrycka T7 RNA-polymeras, till 6-cm rätter i Minimum Essential Medium (MEM)-alfa (Invitrogen, Cat # 32.561.037) med 10% fetalt bovint serum (FBS ), penicillin-streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, streptomycin: 100 mikrogram / ml) (Invitrogen, Cat # 15.140.122) och 600 mikrogram / ml hygromycin B (Cellgro, Cat # 30-240-CR).
* Effektiviteten av virus återhämtning är högre i 6-cm rätter än i 35-mm rätter. BHK/T7-9 celler med låg nivå då stödet högre återhämtning. Alternativt andra BHK cellinjer som stabilt uttrycka T7 RNA-polymeras kan användas 4,5,16,17. - När celler har nått 70-80% confluency, byt ut supernatant med färska MEM-alfa som innehåller 10% FBS och penicillin-streptomycin (som inte innehåller hygromycin B).
* Celler bör transfected inom 1 timme efter byte mediet för att undvika förlust av T7 RNA-polymeras uttryck. - För återvinning av RVFV, en uppsättning av plasmider kodning virus genomiska RNA för full längd viralt RNA uttryck, och en andra uppsättning kodning gener öppen läsning ramar för viral proteinuttryck (figur 1 och 2) är obligatoriska. Förbered en blandning av följande plasmids2 (Figur 2) i ett 1,5 ml rör:
- pProT7-S (+) med mutation (er) i NSS-genen (2 mg): Detta plasmiden kodar antivirala-känsla (positiv-sense) fullängds RVFV MP-12 S-segmentet flankerad av T7 promotorn och hepatit delta virus (HDV) ribozyme sekvens.
- pProT7-M (+) (2 mg): Detta plasmiden kodar antivirala-känsla (positiv-sense) fullängds RVFV MP-12 M-segmentet flankerad av T7 promotorn och HDV ribozyme sekvensen.
- pProT7-L (+) (2 mg): Denna plasmiden kodar antivirala-känsla (positiv-sense) fullängds RVFV MP-12 L-segmentet flanked från T7 promotorn och HDV ribozyme sekvensen.
- pT7-IRES-VN (2 mg): Detta plasmiden kodar RVFV MP-12 N öppet läsram (ORF) nedströms från T7 promotorn och en Encephalomyocarditis virus (EMCV) interna ribosomen inträde plats (IRES).
- pT7-IRES-VL (1 mg): Detta plasmiden kodar RVFV MP-12 L ORF nedströms från T7 promotorn och en EMCV IRES.
- pCAGGS-VG (1 mg): Denna plasmiden kodar RVFV MP-12 M ORF nedströms kyckling beta-aktin promotor.
* Tillägget av pT7-IRES-VN, pT7-IRES-VL och pCAGGS-VG är inte nödvändigt för återvinning av MP-12, men det effektiviserar räddnings 2. Författarna upplevde dåliga uttryck för GN / GC med hjälp pT7-IRES plasmid, förmodligen på grund av bristen på läckande skanning av AUGs av ribosomer. Därför byggde vi pCAGGS-VG för Cap-beroende GN / GC uttryck.
- Tillsätt 30 ml Transit-LT1 (Mirus, Cat # MIR2300) till 385 ml Opti-MEM (Invitrogen, Cat # 31985070) i en 1,5 ml tub, och vortexa kort.
- Efter 5 minuter inkubation vid rumstemperatur, långsamt lägga till Opti-MEM innehåller liposomer till plasmiden blandningen från steg 1,3 till, blanda försiktigt genom att pipettera och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt blandningen av liposomer och plasmider till kulturen medium BHK/T7-9 celler från steg 1,2 droppe för droppe (Figur 3).
- Inkubera transfekterade cellerna vid 37 ° C i en inkubator med 5% CO 2 för 24 h och ersätta supernatant med färska MEM-alfa som innehåller 10% FBS och penicillin-streptomycin (som inte innehåller hygromycin B).
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en inkubator med 5% CO 2 för ytterligare 4 dagar (inkubera i 5 dagar totalt), och samla kulturen supernatanterna i en 15 ml tub.
* Den cytopatisk effekt (CPE) som observerats här speglar inte nödvändigtvis resultatet av ett framgångsrikt virus återhämtning, eftersom transfektioninducerar celldöd som verkar likt CPE orsakad av virus-RNA replikeras eller viral proteinsyntes. - Centrifugera supernatanterna vid 2200 xg vid 4 ° C i 5 min.
* Syftet med detta steg är att pellets ner cellulära skräp från virus lager. En aerosol-tät centrifugering hink rekommenderas för ökad säkerhet. - Överför supernatanterna till skruvkork 5 ml cryotubes och lagra passagen 0 (P0)-virus lager vid -80 ° C för vidare användning.
2. Förstärkning av P0 virus
- Den P0 prover innehåller ofta otillräckligt viralt titer för nedströms experiment 2. En förstärkning steg i VeroE6 celler, som är en klon av afrikanska gröna (Vero) apa njure celler som saknar IFN-alpha/beta gener 18,19, ökar virus titer upp till maximal nivå. Alternativt andra celler som saknar typ I IFN svar som Hec1B celler 20 eller MEF celler från IFNAR1-knockoutmöss 21 mighT användas för detta steg. Sprid VeroE6 celler i 10-cm rätter i Dulbecco ändrade minst viktigt medium (DMEM) (Invitrogen, Cat # 11.965.092) med 10% FBS, penicillin-streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, streptomycin: 100 mg / ml) och inkubera vid 37 ° C i en inkubator med 5% CO 2 tills de når 80% confluency.
* Rekombinant MP-12 stammar kodning mutant NSS misslyckas ofta med att replikera effektivt i typ I IFN-behörig celler. - Blanda 300 ml P0 prover med 2,7 ml DMEM med 10% FBS och penicillin-streptomycin. Ta bort odlingsmedium från VeroE6 celler från steg 2,1 och ersätt med det utspädda P0 provet. Inkubera vid 37 ° C under 1 timme i en kuvös med 5% CO 2.
- Ta bort inokulat och tillsätt 10 ml av DMEM med 10% FBS och penicillin-streptomycin till varje maträtt.
- Inkubera vid 37 ° C i 3 till 4 dagar tills CPE av VeroE6 celler blir uppenbart.
* Störningar av monolager inträffar under MP-12 infektion, while rekombinant MP-12 som saknar NSS, som rMP12-C13type (C13type) (Figur 4), inte stör den cellslager, men ett antal döda flytande celler, tycks 2 till 3 dagar efter infektion. - Harvest supernatanten vid 3 till 4 dpi, vilket beskrivs i avsnitt 1,9) och 1,10), samt utse de prover som E6P1.
3. Titrering av rekombinant MP-12 av plack analys
- Sprid VeroE6 celler till 6-bra plattor.
* Duplicera analys per prov är mer tillförlitliga än enstaka analys. - När VeroE6 celler har ökat till 80% confluency, förbereda 10-faldig spädningar av virus prover i DMEM med 10% FBS och penicillin-streptomycin upp till 10-6 enligt följande:
- 10 ìl av E6P1 prov + 990 ml DMEM med 10% FBS och penicillin-streptomycin (10 -2 utspädning)
- 100 ìl av 10 -2 prov + 900 ml DMEM med 10% FBS och penicillin-streptomycin (10 -3 utspädning)
- 100ìl av 10 -3 prov + 900 ml DMEM med 10% FBS och penicillin-streptomycin (10 -4 utspädning)
- 100 ìl av 10 -4 prov + 900 ml DMEM med 10% FBS och penicillin-streptomycin (10-5 utspädning)
- Sug medium från den 6-brunnar från steg 3,1 och tillsätt 400 l för varje utspädning (från steg 3,2) i brunnar (Figur 3).
- Inkubera vid 37 ° C under 1 timme i en kuvös med 5% CO 2.
- Under inkubationen, förbereda två 15 ml rör för agar-overlay enligt följande:
Tube A (hålla i 42 ° C vattenbad): 7 ml 1,2% ädla agar (VWR, Cat # 101.170-362) i vatten
Rör B (hålla i 37 ° C vattenbad): 7 ml Modified Eagle Medium (MEM 2x) (Invitrogen, Cat # 11.935.046) med 10% FBS, penicillin-streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, streptomycin: 100 mikrogram / ml) och 10% Tryptos fosfat buljong (MP biomedicals, Cat # 1.682.149). - Efter 1 h inkubering, ta bort virusinokulat, och omedelbart tillsätt 2 ml per brunn i en 1:1 blandning av slang A och slang B (från steg 3,5).
* Var noga med att lägga överlägget omgående som uttorkning av brunnar orsakar död oinfekterade celler. - Inkubera plattorna vid 37 ° C under 3 dagar i en kuvös med 5% CO 2.
- Förbered slang A och slang B igen enligt beskrivningen i steg 3,5. Förbered också 500 ìl 0,33% neutral röd lösning (Sigma Aldrich, Cat # N2889-100 ml) per platta som också hålls vid 37 ° C vattenbad.
- Blanda rör A, rör B och 500 ml (slutlig konc. 0,011%) av neutral röd lösning och tillsätt 2 ml av blandningen per brunn.
* Den mängd neutralt rött-lösning som ska läggas varierar från mycket neutral röd lösning, och initiala optimering krävs. Långsiktig förvaring av 0,33% neutral röd lösning orsakar nederbörd. I sådana fall kan fällningen helt upplösas genom inkubation vid 55 ° C i 10 min följt av kraftig omskakning. Användningen av utfällda neutrala rED-lösning resulterar i en svag färgning av celler, samtidigt som löses upp på nytt neutral röda lösning fläckar celler bra. - Inkubera plattan i 16 timmar (eller över natten) vid 37 ° C i en inkubator med 5% CO 2.
- Räkna antalet plack i brunnen, som innehåller 10 till 100 plattor per brunn. Beräkna antalet plack bildas enheter / ml. Till exempel, om vi ser 28 plack i brunnarna inokulerat med 10 -5 spädningar, 28 (# av plack) x (1 ml/0.4 ml) x 10 5 (utspädning) = 7,0 x 10 6 plack bildas enheter (PFU) / ml (figur 5).
4. Screening av NSS mutanter som saknar den typ I-IFN undertryckande funktion
- Sprid C57/WT MEF celler (InvivoGen, Cat # MEF-c57wt), som kodar för ett utsöndras embryonala alkaliskt fosfatas (SEAP) gen inducerbara av NF-kB och IRF-3 / 7 (Figur 6), till 12-bra plattor. Cellerna hålls i DMEM med 10% FBS, penicillin-streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, streptomycin: 100 mikrogram / ml), Blasticidin S (3 mg / ml) och Zeocin (100 mikrogram / ml).
- När celler blir sub-konfluenta (80%), celler är mock-smittade eller infekterade med MP-12 eller rekombinant MP-12 kodning mutationer NSS på mångfald infektion (moi) i 3 eller 0,1 (se avsnitt 2 och 3, mängden varje inokulatet bör vara 300 l). På 1 h efter infektion, ta bort inokulat, och tillsätt 1 ml per brunn av DMEM med 10% FBS, penicillin-streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, streptomycin: 100 mikrogram / ml) (är Blasticidin och Zeocin inte lagt till vid denna tid).
- Vid 14 timmar efter infektion, samla kulturen supernatanterna. Tillsätt 200 ìl av kvanti-Blå (InvivoGen, Cat # repre-qb1) och 50 l av varje prov (i tre exemplar) i brunnarna på en 96-brunnar. Seal och Inkubera plattan vid 37 ° C under 1 h.
* Både MP-12 och rekombinant MP-12 som saknar NSS få klart värd translationell dämpningen i IFN-alpha/beta behöriga celler inklusive 293 celler, MRC-5 celler och mus embryonic fibroblast (MEF) celler efter 14 timmar efter infektion med hög moi. Å andra sidan, ackumulerar IFN-beta mRNA eller ISG56 mRNA rikligt vid 7 till 8 timmar efter infektion i typ I-IFN behöriga celler. Därför valde vi 14 timmar efter infektion för att samla in supernatanterna att se ansamling av SEAP orsakas av medfödda immunförsvaret. - Läs OD-värdena vid 650 nm med en tallrik läsare (Figur 7).
* Resultaten överensstämmer med de uppgifter som erhållits av Northern blot hjälp av en RNA sond som är specifik för mus ISG56 mRNA, som visar uppreglering av ISG56 mRNA i avsaknad av NSS uttryck (Figur 8).
* Det bör noteras att SEAP verkan bestäms genom det överflöd av proteiner som skulle kunna påverkas av värd översättning aktivitet. En relativ nivå av SEAP kanske inte vara hög jämfört med den ökade mRNA eftersom SEAP inte kan syntetiseras även i närvaro av SEAP mRNA om cellulära översättning supprket medium. Northern blot är en enklare analys och ett mer korrekt sätt att utvärdera hur mycket mRNA som orsakas av bristen på NSS funktioner i infekterade celler än den SEAP reporter analysen. Dock är SEAP reportern systemet snabbare än norra blot och därmed användbara för snabb screening av NSS mutanter potentiellt saknas värd funktion transkription förtryck.
5. Representativa resultat:
Det omvända genetik systemet genererade konsekvent livskraftiga rekombinant MP-12 virus med titrar högre än 1 x 10 6 PFU / ml. C13type virus saknar NSS funktioner bildade stora grumliga fläckar, medan MP-12 bildas tydliga plaketter i olika storlekar 2 (Figur 5). Mock-infekterade C57/WT MEF celler eller de som är infekterade med MP-12 har inte höja SEAP i supernatant jämfört med mock-infekterade celler, medan supernatant av C57/WT MEF celler infekterade med C13type innehöll en ökadnivå SEAP med 14 timmar efter infektion (HPI) (Figur 7). Dessa resultat överensstämmer med de som erhållits med Northern blot hjälp av en RNA sond som är specifik för mus ISG56 mRNA (Figur 8).
Figur 1. Genome struktur RVFV
RVFV har en trepartssammansatt negativ känsla eller ambisense RNA-genom som heter S-, M-och L-segmentet. S-segmentet kodar N och NSS gener i en ambisense sätt. N mRNA syntetiseras från virus-sense (negativ-sense) S-segmentet, medan NSS mRNA syntetiseras från anti-virus-känsla (positiv-sense) S-segmentet. M-segmentet kodar en enda M mRNA och syntetiserar the78kD, NSM, GN eller GC proteiner genom läckande skanning av flera AUGs på 5'region M mRNA, följt av deras co-translationell klyvning 22,23. L-segmentet kodar L protein. Både N och L proteiner är viktiga för viral transkription och replikation, medan GN och GC är den virala kuvertet proteiner. NSS och proteiner NSM är nonstructural proteiner, som inte ingår i viruspartiklar.
Figur 2.. Design av plasmid-DNA för återhämtning av rekombinanta RVFV MP-12 stam
Den cDNA kodning hellång anti-virus-sense S-, M-eller L-segmentet cloneddownstream av T7 promotorn och uppströms av hepatit delta virus (HDV) ribozyme sekvenser, som betecknas som pProT7-S (+), pProT7-M (+) eller pProT7-L (+) respektive 2. T7 RNA-polymeras som uttrycks i BHK/T7-9 celler melodin RNA kodning full längd S-, M-eller L-segmentet med exakt genomet 3 'slut. Den öppna läsram (ORF) av N eller L proteiner är klonade i Encephalomyocarditis virus (EMCV) interna ribosomen inträde plats (IRES), som betecknas som pT7-IRES-VN eller pT7-IRES-VL, respektive att låta icke-begränsade T7 RNA utskrift att bli erkända av ribosomerna i Cap-oberoendebuckla sätt. M ORF är klonade i kyckling b-aktin främjare av pCAGGS plasmid 24, som pekats ut som pCAGGS-VG, så att syntesen av 78kD, NSM, GN och GC proteiner, som genereras från olika AUGs genom läckande skanning 23. Både N och L proteiner behövs för att inleda utskrift eller RNA replikering, medan pT7-IRES-VN och pT7-IRES-VL inte är nödvändiga för återvinning av rekombinanta MP-12 2, antagligen på grund av förmodade läckande uttryck för Pol- II-driven maximerad RNA-transkript kodning N-ORF och L-ORF från pProT7-S (+) och pProT7-L (+), respektive.
Figur 3. Återvinning av RVFV MP-12 från plasmid DNA
Transfektion av BHK/T7-9 celler med pProT7-S (+), pProT7-M (+), pProT7-L (+), pT7-IRES-VN, pT7-IRES-VL och pCAGGS-VG plasmider (Fig.1 ) genererar infektiöst, rekombinant RVFV MP-12 stam i supernatantS. Supernatanten vid 5 dagars inlägg transfektion samlas och passerats till frisk Vero E6 celler för viral förstärkning. Normalt kan mer än 1 x 10 6 PFU / ml virus återvinnas på 3 till 4 dagar efter infektion. Den förstärkta virus (E6P1 virus) titreras med hjälp av plack analys med Vero E6 celler och används för fenotyp analyser och undersökningar immunogenicitet.
Figur 4. S-segmentet av MP-12 och rMP12-C13type
Jämförelsen av MP-12 och rMP12-C13type (C13type) S-segment. Jämfört med nss av MP-12 stam, är NSS ORF av C13type avkortas med 69%, och är identisk med naturligt isolerad klon 13 stam 2,25.
Figur 5. Plack test för MP-12 (funktionell NSS) och C13type (icke-funktionella NSS)
Den monolager av Vero E6 celler i en 6-brunnar används för plack analysen. Efter 3 dagars inkubation med 0,6% agar overlay, den andra agar överlägg som innehåller neutrala röda lösning har tillsatts. Sedan är plack räknas på dag 4 efter infektion. MP-12 är en klar plaketter i olika storlekar, medan C13type bildar stora grumligt plack (eller härdar). Brunnen med 10 till 100 plack bör användas för att räkna.
Figur 6. Aktivering stig utsöndras alkaliska fosfataser (SEAP) reporter genen i C57/WT MEF celler
Interferon-beta promotor ingår bindande sekvenser av AP-1, NF-kB och IRF-3. RVFV replikering aktiverar AP-1, NF-kB och IRF-3 7,11. Men NSS hämma frisättningen av repressor komplex från IFN-beta promotor även efter det att bindning av dessa transkriptionsfaktorer, vilket undertrycka syntesen av IFN-beta mRNA 26. Dessutom NSS binder TFIIH P44 subunits8 och enLSO främjar nedbrytning av TFIIH P62 subenheter 27, och därmed framkalla en allmän dämpning värd transkription däribland IFN-alfa genen och gener under ISRE arrangören. C13type eller andra NSS mutanter som saknar interferon-beta undertryckande funktion framkalla IFN-beta syntes, vilket i sin tur aktiverar IFN-alfa promotor och interferon-känsliga respons element (ISRE) promotor. IRF-7 är då transkriptionellt uppregleras av IFN-alpha/beta stimulans och ytterligare uppregleras av IFN-alfa till stöd för IRF-3 28,29. I denna analys, C57/WT MEF celler koda utsöndras alkaliskt fosfatas (SEAP) på nedströms en konstgjord bindande sekvens av NF-kB, IRF-3 och IRF-7. Således NSS mutanter som saknar IFN-beta undertryckande funktion upregulate SEAP vars sekretion Därefter mäts.
Figur 7. Induktion av SEAP av C13type
C57/WT MEF celler (InvivoGen) var falska-Infekterade eller smittade med MP-12 eller rMP12-C13type (C13type) vid Moi av 3 (till vänster) eller 0,01 (högra panelen). Kultur supernatanterna (50 l) vid 14 HPI var blandade med 200 l av kvanti-Blå (InvivoGen) substrat i 96 brunnar och OD-värdena vid 650 nm mättes efter 1 h inkubation vid 37 ° C med en tallrik läsare. Den relativa ökningar av SEAP att håna-infekterade celler visas. De data som representerar medelvärdet + / - standardavvikelse för tre oberoende försök. Kulturen supernatanten från C13type-infekterade celler visar ökad SEAP, vilket tyder på att det saknas värd transkription undertryckande av NSS.
Figur 8. Northern blot med DIG-märkt RNA sond
Vildtyp möss embryonala fibroblaster (MEF) celler var mock-smittade eller infekterade med MP-12 eller rMP12-C13type (C13type) vid moi 3. Total RNA samlades in vid 7 HPI med Trizol (Invitrogen), och norra Bmassa utfördes med hjälp av digoxigenin-märkt RNA sond som är specifik för musen endogena ISG56 mRNA eller MP-12 N mRNA / anti-virus-känsla S-segmentet 2,30. För att göra sonder för mus endogena ISG56 mRNA eller RVFV N mRNA / anti-virus-känsla S-segmentet, PCR-fragmenten förstärks av primern uppsättning KpnmISG56F (GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG) och HindmISG56 (TAC AAA GCT TAT GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG) för ISG56 mRNA eller KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA Luftfartsverket CTA TCA AGA GCT TGC G) och HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG) för RVFV N mRNA / anti-virus-känsla S-segmentet var kokas med KPN I och Hind III och knyts ihop i pSPT18 plasmid (Roche. Sedan RNA prober märkta med digoxigenin var syntetiseras genom att använda DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche, Cat # 1 175 025). Den 28S rRNA för varje prov visas även som lastning kontroll., vildtyp MEF celler infekterade med C13type inducerad ISG56 mRNA-syntes, medan de som är infekterade med MP-12 Inducerade inte det, vilket tyder på att det saknas värden transkriptionen dämpningen i C13type-infekterade celler. Uppgifterna stämmer överens med de som erhålls genom SEAP analysen i Figur 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omvänd genetik system för RVFV har utvecklats av flera grupper genom att använda T7 promotorn 2,4,5 eller mus 3 eller mänsklig 4 Pol-I promotor. I detta manuskript, beskriver vi ett protokoll för att generera rekombinant RVFV MP-12 stammar genom att använda BHK/T7-9 celler 15 som stabilt uttrycka T7 RNA-polymeras. Effektiviteten av viral återhämtning varierat beroende på skick BHK/T7-9 celler, mängden plasmider, antalet transfekterade celler och så vidare. Vi förstärker alltid P0 viruset i Vero E6 celler för att få hög lager titer virus för experiment. Typ-I IFN-behörig celler som mänskliga lunga diploida (MRC-5) celler kan användas för viral förstärkning endast när NSS-funktionen stöds en effektiv virusreplikation genom att hämma antivirala aktiviteter inklusive typ I-IFN eller PKR.
En minnestavla-analysen är en ganska bra metod för titrering MP-12 och NSS mutanter. Som en generell försiktighetsåtgärd förplack assay bör cellerna omedelbart läggas till med overlay vid lämplig temperatur efter avlägsnande av virus inokulat. Kristallviolett färgning är inte lämplig för att upptäcka C13type virus plack, eftersom C13type viruset inte störa monolager av Vero E6 celler 2. Å andra sidan kan neutrala röda fläckar upptäcka framgångsrikt plack bildas av C13type virus. Styrkan i cellulär färgning med neutrala röda bestäms av den relativa införlivandet av neutrala röd färg till levande celler. Således är det troligt att C13type-infekterade celler har en minskad metabolisk aktivitet vilket leder till minskad införlivandet av neutral röd färg jämfört med de oinfekterade celler, och som utgör en svag färgning fokus. Den mängd neutralt rött varierar från mycket neutral röd lösning. Långsiktig lagring av neutrala röda lösning genererar ofta utfällningar. Detta kan undvikas genom värme-upplösning av neutralt rött-lösning vid 55 ° C i 10 min, men detpåverkar färgning av celler.
Det är viktigt att använda virus med exakt virus titer i experiment. Den titer i en viral lager kan minskas genom media med pH under 6,5 31 vilket indikeras av gulaktig färg av fenolrött i det virala lager, långtidslagring, upprepade frys-tö cykler och så vidare. Därför är det viktigt att använda färska virala lager för djur-vaccination eller titrera lager igen strax före experiment.
RVFV koda två kännetecknas nonstructural proteiner, NSS och NSM. Den RVFV saknas NSS är betydligt försvagat hos djur 25,32, medan RVFV saknas NSM är fortfarande mycket virulent hos råttor 33. Således spelar NSS en viktig roll som virulensfaktorn i patogenesen. NSS är en multifunktionell protein som inducerar 1) förtryck av värd allmänna transkription 8, 2) förtryck av IFN-beta mRNA-syntes 26 och 3) nedbrytning av dsRNA-dependent proteinkinas (PKR) 9,10. Föräldrarnas MP-12 stam kunde vara längre dämpas genom att införa trunkering eller mutationer i NSS. Å andra sidan är det också viktigt att behålla immunogenicitet av dessa muterade MP-12. Typ I IFN spelar en roll för mognaden av dendritiska celler, vilket är viktigt för differentieringar av T-celler och B 12-14. Olika nss mutanter som saknar interferon-beta undertryckande funktion som behåller fullständig eller partiell NSS funktioner är användbara för att analysera effekterna av NSS-medierad IFN-beta undertryckande funktion på immunogenicitet och säkerhet av vaccin kandidater. Det är känt att celler infekterade med RVFV WT ZH548 stam aktiverar NF-kB, IRF-3, och AP-1 (Figur 6), medan IFN-beta mRNA-syntes hämmas av NSS på transkriptionell nivå 7. Därmed hämmar MP-12, som uttrycker fullt funktionell NSS 3, syntesen av NF-kB/IRF-3/7-inducible SEAP reporter gen mRNA vid transcriptional, medan rekombinant MP-12 som saknar NSS funktioner såsom C13type kunde få SEAP mRNA-syntes (Figur 7). För att korrekt förstå resultatet av immunogenicitet av dessa mutanter bör fenotyper dessutom karakteriseras i cellkultur systemet. Till exempel bör virusreplikation kinetik testas i typ I-IFN behörig celler som mänskliga lung diploida MRC-5 celler eller mus embryonala fibroblaster (MEF) celler. PKR nedbrytningen Funktionen kan testas med Western blot med antikroppar som är specifika för människor eller mus PKR. IFN-beta mRNA induktion av NSS mutation skall bekräftas av Northern blot med digoxigenin-märkt RNA sond som är specifik för humant eller mus IFN-beta mRNA. Värd allmänna transkription dämpning kan testas genom att analysera införlivandet av en uridin analog till gryende mRNA. Så småningom bör immunogenicitet och säkerhet kandidat MP-12 NSS mutanter testas på möss. Typiskt, 1 x 10 5 PFU av candidaTe vaccin som spätts i PBS ges subkutant och serum samlats in från retro-orbital sinus vid dag 30 (eller 42) och dag 180 testas för förekomst av neutraliserande antikroppar av plack minskade neutralisera test (PRNT 80) och total IgG mot RVFV N och GN / GC med IgG ELISA belagda med renat rekombinanta, virala proteiner. Effekten av vaccin kandidater kan testas genom att utmana möss i 42 dagar efter immunisering med vildtyp ZH501 (t.ex., ip, 1 x 10 3 PFU) på djur biosäkerhetsnivå (BSL) 4 anläggning eller förbättrade BSL3 + anläggning i USA Det omvända genetik tillvägagångssätt är ett kraftfullt verktyg för att designa och skapa en säker och immunogena levande försvagade RVFV vacciner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av licensnummer 5 U54 AI057156-07 via Western Regional Center of Excellence (WRCE), 1 R01 AI08764301-A1 från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar, och en intern finansiering från Sealy Centrum för utvecklingen av vaccin vid University of Texas Medical Branch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR international | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma-Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | Invitrogen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | Invitrogen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | Invitrogen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
