Summary
Le système de génétique inverse pour le virus de la fièvre vallée du Rift MP-12 souche vaccinale est un outil utile pour créer des supplémentaires MP-12 mutants avec une atténuation accrue et l'immunogénicité. Nous décrivons le protocole de générer et caractériser NSs souches mutantes.
Abstract
Virus de la fièvre vallée du Rift (FVR), qui provoque une fièvre hémorragique, des troubles neurologiques ou de cécité chez les humains, et un taux élevé d'avortement et de malformations fœtales chez les ruminants 1, a été classé comme un HHS / USDA chevauchent agent de sélection et un groupe de risque 3 pathogène. Il appartient au genre Phlebovirus de la famille des Bunyaviridae et est l'un des membres les plus virulents de cette famille. Plusieurs systèmes de génétique inverse pour la souche RVFV MP-12 2,3 vaccins ainsi que des souches de type sauvage RVFV 4-6, y compris les ZH548 ZH501 et ont été développés depuis 2006. Le MP-12 souche (qui est un groupe de risque 2 et un agent pathogène non-sélection) est fortement atténué par plusieurs mutations dans son M-et L-segments, mais porte toujours virulentes S-segment d'ARN 3, qui code une virulence fonctionnelle facteur, NSS. Le rMP12-C13type (C13type) transportant 69% dans le châssis-suppression de NSS ORF manque toutes les fonctions connues NSs, tandis qu'il réplique que efficient tout comme MP-12 dans des cellules dépourvues VeroE6 type I IFN. NSs induit un arrêt de la transcription de l'hôte dont l'interféron (IFN)-bêta ARNm 7,8 et favorise la dégradation de la double-brin protéine kinase dépendante de l'ARN (PKR) au niveau post-traductionnelles. 9,10 IFN-bêta est transcriptionnellement régulés par interferon regulatory factor 3 (IRF-3), NF-kB et la protéine activatrice-1 (AP-1), et la liaison de l'IFN-bêta à IFN-alpha/beta récepteur (IFNAR) stimule la transcription de l'IFN-alpha gènes ou d'autres gènes d'interféron stimulée (ISGS) 11, ce qui induit des activités d'accueil antiviraux, alors que la suppression de la transcription d'hôte incluant l'IFN-bêta du gène par le NSS empêche le gène de ceux upregulations ISGS en réponse à la réplication virale, bien que l'IRF-3, NF-kB et l'activateur protein-1 (AP-1) peut être activé par RVFV7. . Ainsi, NSS est une excellente cible pour atténuer encore MP-12, et d'améliorer la réponse immunitaire innée de l'hôte en abolissant la fonction de suppression de l'IFN-bêta. Voici, Nous décrivons un protocole pour générer un SSN-12 recombinante MP encodage muté, et fournir un exemple d'une méthode de dépistage pour identifier les mutants NSs manque la fonction pour supprimer synthèse de l'ARNm de l'IFN-bêta. En plus de son rôle essentiel dans l'immunité innée, l'IFN de type I est important pour la maturation des cellules dendritiques et l'induction d'une réponse immunitaire adaptative 12-14. Ainsi, les mutants NSs induisant l'IFN de type I sont plus atténuées, mais en même temps, sont plus efficaces pour stimuler des réponses immunitaires que l'hôte de type sauvage MP-12, qui fait des candidats idéaux pour des approches de vaccination.
Protocol
1. Récupération des MP-12 recombinante mutation NSs encodage (s) à partir du plasmide ADN 2
- Fais de rein de hamster bébé (BHK) / T7-9 cellules 15, qui expriment de façon stable la T7 RNA polymérase, en 6 cm de plats dans un milieu essentiel minimum (MEM)-alpha (Invitrogen, Cat # 32561037) contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS ), de pénicilline-streptomycine (pénicilline: 100 U / ml, streptomycine: 100 pg / ml) (Invitrogen, Cat # 15140122), et 600 pg / ml d'hygromycine B (Cellgro, Cat n ° 30-240-CR).
* L'efficacité de la récupération virale est plus élevée en 6 cm de plats que dans les plats de 35 mm. BHK/T7-9 cellules avec un niveau faible passage le soutien des taux élevés de récupération. Alternativement, d'autres lignées cellulaires BHK qui expriment de façon stable T7 RNA polymérase pourrait être utilisé 4,5,16,17. - Lorsque les cellules ont atteint 70-80% de confluence, de remplacer le surnageant de culture avec des produits frais MEM-alpha contenant 10% de FBS et de pénicilline-streptomycine (ne contenant pas hygromycine B).
Cellules * doivent être transfected 1 heure après remplacement du milieu pour éviter la perte d'expression de T7 RNA polymérase. - Pour la récupération des RVFV, un ensemble de plasmides codant pour les ARN viraux génomiques pleine longueur expression de l'ARN viral, et une deuxième série d'encodage virale cadres ouverts de lecture du gène d'expression de protéines virales (figures 1 et 2) sont requis. Préparer un mélange de l'plasmids2 suivantes (figure 2) dans un tube de 1,5 ml:
- pProT7-S (+) avec mutation (s) dans le gène NSS (2 mg): Ce plasmide codant l'anti-viral-sens (sens positif) pleine longueur RVFV MP-12 S-segment flanqué par le promoteur T7 et l'hépatite delta virus (HDV) séquence de ribozyme.
- pProT7-M (+) (2 mg): Ce plasmide codant l'anti-viral-sens (sens positif) pleine longueur RVFV MP-12 M-segment flanqué du promoteur T7 et la séquence HDV ribozyme.
- pProT7-L (+) (2 mg): Ce plasmide code anti-viral-sens (sens positif) pleine longueur RVFV MP-12 L-segment de flanked par le promoteur T7 et la séquence HDV ribozyme.
- pT7-IRES-VN (2 mg): Ce plasmide codant le cadre RVFV MP-12 N lecture ouvert (ORF) en aval du promoteur T7 et un virus encéphalomyocardite (EMCV) site d'entrée interne des ribosomes (IRES).
- pT7-IRES-VL (1 mg): Ce plasmide codant l'RVFV MP-12 L ORF en aval du promoteur T7 et un IRES EMCV.
- pCAGGS-VG (1 mg): Ce plasmide code RVFV MP-12 m en aval de l'ORF bêta-actine de poulet promoteur.
* L'ajout de pT7-IRES-VN, pT7-IRES-VL et pCAGGS-VG n'est pas essentiel pour la récupération des MP-12, mais il améliore l'efficacité des secours 2. Auteurs expérimentés mauvaise expression de Gn / GC en utilisant pT7-IRES plasmide, probablement en raison de l'absence de fuite de numérisation des AUG par les ribosomes. Par conséquent, nous avons construit pCAGGS-VG pour cap-dépendante Gn / Gc expression.
- Ajouter 30 ml de-Transit LT1 (Mirus, Cat # MIR2300) à 385 ml d'Opti-MEM (Invitrogen, Cat # 31985070) dans un tube de 1,5 ml, et brièvement au vortex.
- Après 5 minutes d'incubation à température ambiante, ajouter lentement l'Opti-MEM contenant des liposomes au mélange plasmide de l'étape de 1,3 à, mélanger doucement par pipetage et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter le mélange de liposomes et de plasmides au milieu de culture de l'BHK/T7-9 cellules de l'étape 1.2 goutte à goutte (figure 3).
- Incuber les cellules transfectées à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO 2 pendant 24 h, et de remplacer le surnageant de culture avec des produits frais MEM-alpha contenant 10% de FBS et de pénicilline-streptomycine (ne contenant pas hygromycine B).
- Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO 2 pendant 4 jours supplémentaires (incuber pendant 5 jours au total), et de recueillir les surnageants de culture dans un tube de 15 ml.
* L'effet cytopathogène (ECP) observé ici ne reflètent pas nécessairement le résultat de la récupération virale réussie, parce que la transfectioninduit la mort cellulaire qui apparaît semblable à CPE causé par la réplication virale ou ARN synthèse des protéines virales. - Centrifuger les surnageants à 2200 xg à 4 ° C pendant 5 min.
* Le but de cette étape est de granulés bas les débris cellulaires du stock viral. Un seau de centrifugeuse étanche aux aérosols est recommandé pour une sécurité accrue. - Transférer les surnageants dans bouchon à vis 5 cryotubes ml, et de stocker le passage 0 (P0) stock de virus à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
2. L'amplification du virus de P0
- Le P0 échantillons contiennent souvent insuffisante titre viral pour des expériences aval 2. Une étape d'amplification dans VeroE6 cellules, qui est un clone de vert africain de rein de singe (Vero) des cellules dépourvues des gènes IFN-alpha/beta 18,19, titre viral augmente jusqu'au niveau maximum. Alternativement, d'autres cellules manquent de type I IFN réponses telles que les cellules Hec1B 20 ou cellules MEF de souris déficientes en protéine IFNAR1-21 might être utilisés pour cette étape. Fais VeroE6 cellules dans 10 cm de plats dans Dulbecco milieu modifié essentiel minimum (DMEM) (Invitrogen, Cat # 11965092) contenant 10% de FBS, pénicilline-streptomycine (pénicilline: 100 U / ml, streptomycine: 100 mg / ml), et incuber à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO 2 jusqu'à ce qu'ils atteignent 80% de confluence.
* Recombinant MP-12 souches mutantes encodage NSs omettent souvent de se répliquer efficacement dans de type I IFN-cellules compétentes. - Mélanger 300 ml de P0 échantillons avec 2,7 ml de DMEM avec 10% de FBS et de pénicilline-streptomycine. Enlever un milieu de culture de la VeroE6 cellules de 2,1 étape et la remplacer par la dilution de l'échantillon P0. Incuber à 37 ° C pendant 1 h dans une étuve avec 5% de CO 2.
- Retirez les inoculums et ajouter 10 ml de DMEM avec 10% de FBS et de pénicilline-streptomycine à chaque plat.
- Incuber à 37 ° C pendant 3 à 4 jours jusqu'à ce que des CPE VeroE6 cellules devient apparent.
Perturbation de la monocouche * survient au cours MP-12 infection, while recombinantes MP-12 NSs manquent, comme rMP12-C13type (C13type) (figure 4), ne perturbe pas la monocouche, mais un certain nombre de cellules mortes flottantes apparaissent 2 à 3 jours après l'infection. - Récolte du surnageant de 3 à 4 ppp, comme décrit dans les sections 1.9) et 1.10), et désigner les échantillons que E6P1.
3. Le titrage de recombinaison MP-12 par dosage de plaque
- Fais VeroE6 cellules dans des plaques 6 puits.
* Dupliquer l'analyse par échantillon est plus fiable que l'analyse seule. - Lorsque les cellules se sont développées au VeroE6 80% de confluence, préparer 10 dilutions successives d'échantillons de virus dans le DMEM avec 10% de FBS et de pénicilline-streptomycine jusqu'à 10-6 comme suit:
- 10 pl de E6P1 échantillon + 990 ml de DMEM avec 10% de FBS et de pénicilline-streptomycine (10 -2 dilution)
- 100 pi d'échantillon + 10 -2 900 ml de DMEM avec 10% de FBS et de pénicilline-streptomycine (dilution 10 -3)
- 100ul d'un échantillon de 10 -3 + 900 ml de DMEM avec 10% de FBS et de pénicilline-streptomycine (dilution 10 -4)
- 100 pi d'un échantillon de 10 -4 + 900 ml de DMEM avec 10% de FBS et de pénicilline-streptomycine (10-5 dilution)
- Aspirer moyenne de la plaque de 6 puits de l'étape 3.1 et ajouter 400 ul de chaque dilution (de l'étape 3.2) dans les puits (figure 3).
- Incuber à 37 ° C pendant 1 h dans une étuve avec 5% de CO 2.
- Durant l'incubation, préparer deux tubes de 15 ml pour l'agar-overlay comme suit:
Le tube A (garder à 42 ° C l'eau de bain): 7 ml d'agar noble de 1,2% (VWR, Cat # 101170-362) dans l'eau
Le tube B (garder à 37 ° C bain d'eau): 7 ml d'Modified Eagle Médium (MEM 2x) (Invitrogen, Cat # 11935046) contenant 10% de FBS, pénicilline-streptomycine (pénicilline: 100 U / ml, streptomycine: 100 pg / ml), et 10% de bouillon tryptose phosphate (MP Biomédical, Cat # 1682149). - Après 1 heure d'incubation, enlever le virusinoculums, et ajouter immédiatement 2 ml par puits d'un mélange 1:1 du tube A et B du tube (de l'étape 3.5).
* Prenez soin d'ajouter la superposition immédiatement comme l'assèchement des puits provoque la mort de cellules non infectées. - Incuber les plaques à 37 ° C pendant 3 jours dans un incubateur avec 5% de CO 2.
- Préparer le tube A et B du tube à nouveau comme décrit dans l'étape 3.5. Préparez aussi 500 pi de 0,33% de rouge solution neutre (Sigma Aldrich, Cat # N2889-100 ml) par plaque, qui est également maintenu à 37 ° C l'eau de bain.
- Tube Mix A, B et tube de 500 ml (concentration finale. 0,011%) de solution de rouge neutre et ajouter 2 ml de mélange par puits.
* La quantité de solution de rouge neutre à ajouter varie selon le lot de solution de rouge neutre, et l'optimisation initiale est nécessaire. Stockage à long terme de 0,33% de solution de rouge neutre provoque la précipitation. Dans de tels cas, le précipité peut être complètement dissous par incubation à 55 ° C pendant 10 min suivi par une agitation vigoureuse. L'utilisation de r neutres précipitérésultats solution ED dans une faible coloration des cellules, tandis que re-dissous les taches de rouge neutre solution cellules bien. - Incuber la plaque pendant 16 h (ou une nuit) à 37 ° C dans un incubateur avec 5% de CO 2.
- Comptez le nombre de plaques dans le puits qui contient de 10 à 100 plaques par puits. Calculer le nombre de plaques formant unités / ml. Par exemple, si l'on observe 28 plaques dans le puits inoculés avec les dilutions -5 10, 28 (# de plaques) x (1 ml/0.4 ml) x 10 5 (dilution) = 7,0 x 10 6 unités formatrices de plages (UFP) / ml (figures 5).
4. Dépistage de mutants NSs manque la fonction de suppression de type I IFN
- Fais C57/WT cellules MEF (InvivoGen, Cat # MEF-c57wt), qui codent pour une phosphatase alcaline sécrétée embryonnaire (SEAP) inductible des gènes par NF-kB et IRF-3 / 7 (figure 6), en plaques de 12 puits. Les cellules sont maintenues dans du DMEM avec 10% de FBS, pénicilline-streptomycine (Penicillin: 100 U / ml, streptomycine: 100 pg / ml), blasticidine S (3 mg / ml), et zéocine (100 pg / ml).
- Lorsque les cellules deviennent des sous-confluentes (80%), les cellules sont infectées maquette ou infectés par le MP-12 ou MP-12 recombinante mutations NSs encodage à une multiplicité d'infection (MOI) de 3 ou 0,1 (voir les sections 2 et 3, la quantité de chaque inoculum doit être de 300 pl). Au 1 h après l'infection, retirer le inoculums, et ajouter 1 ml par puits de DMEM avec 10% de FBS, pénicilline-streptomycine (pénicilline: 100 U / ml, streptomycine: 100 pg / ml) (blasticidine et Zéocine ne sont pas ajoutées à ce temps).
- A 14 heures après l'infection, de recueillir les surnageants de culture. Ajouter 200 pi d'Quanti-Bleu (InvivoGen, Cat # rep-QB1) et 50 ul de chaque échantillon (en trois exemplaires) aux puits d'une plaque de 96 puits. Seal et incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 h.
* Les deux MP-12 et MP-12 recombinante NSs manquent clairement induire la suppression d'hôte translationnelle dans les cellules IFN-alpha/beta compétentes, y compris les cellules 293, cellules MRC-5 et de la souris EMBRYONIC fibroblastes (MEF), les cellules après 14 heures après l'infection à MOI élevé. D'autre part, l'IFN-bêta ARNm ou ISG56 ARNm s'accumulent abondamment de 7 à 8 heures après l'infection de type-I IFN cellules compétentes. Ainsi, nous avons choisi 14 heures après l'infection pour recueillir les surnageants de voir l'accumulation de SEAP induite par les réponses immunitaires innées. - Lire les valeurs de DO à 650 nm en utilisant un lecteur de plaque (figure 7).
* Les résultats sont cohérents avec les données obtenues par Northern blot en utilisant une sonde d'ARN spécifique à la souris ISG56 ARNm, ce qui montre une régulation positive de l'ARNm dans ISG56 l'absence d'expression NSS (figure 8).
* Il est à noter que l'activité SEAP est déterminée par l'abondance des protéines qui pourraient être affectés par l'activité de traduction hôte. Un niveau relatif de SEAP pourrait ne pas être élevé par rapport à l'augmentation du niveau d'ARNm de SEAP, car ne peuvent pas être synthétisés, même en présence de l'ARNm de SEAP si la traduction cellulaire est supprEssed. Northern blot est un test plus simple et d'une manière plus précise d'évaluer la quantité d'ARNm induite par le manque de fonctions NSs dans les cellules infectées que le dosage de reporter de SEAP. Cependant, le système rapporteur SEAP est plus rapide que Northern blot et par conséquent utile pour le dépistage rapide de mutants potentiellement NSs manquent fonction de suppression de l'hôte de la transcription.
5. Les résultats représentatifs:
Le système de génétique inverse systématiquement généré recombinants viables MP-12 virus avec des titres plus élevés que 1 x 10 6 pfu / ml. Le virus C13type manque fonctions NSs formaient des plaques trouble grandes, tandis que MP-12 formaient des plaques claires de différentes tailles 2 (figure 5). Mock cellules infectées par le MEF C57/WT ou ceux infectés par le MP-12 n'a pas augmenté le niveau de SEAP dans le surnageant de culture par rapport à la maquette de cellules infectées, tandis que le surnageant de culture de cellules infectées par le MEF C57/WT C13type contenait une augmentationniveau de SEAP par 14 heures après l'infection (hpi) (figure 7). Ces résultats sont cohérents avec ceux obtenus par Northern blot en utilisant une sonde d'ARN spécifique à la souris ISG56 ARNm (figure 8).
La structure du génome Figure 1. RVFV des
RVFV a un accord tripartite de sens négatif ou ambisens génome à ARN appelé S-M-et L-segment. S-segment de code gènes N et NSS de manière ambisens. ARNm N est synthétisée à partir de virus-sens (sens négatif) S-segment, tandis que l'ARNm de NSS est synthétisé à partir anti-viral-sens (sens positif) S-segment. M-segment de code pour un ARNm M simple et synthétise the78kD, NSM, Gn ou des protéines Gc en scannant qui fuient des AUG plusieurs région 5 'des ARNm M, suivis par leurs co-traductionnelle clivage 22,23. L-segment de code pour la protéine L. Les deux protéines N et L sont essentiels pour la transcription et la réplication virale, tandis que Gn et Gc sont les protéines de l'enveloppe virale. NSs et des protéines NSM sont protéines non structurales qui ne sont pas incorporées dans les particules virales.
Figure 2.. Conception d'ADN plasmidique pour la récupération de recombinaison RVFV MP-12 souche
L'ADNc codant pleine longueur anti-viral-sens S, M, ou L-segment sont cloneddownstream du promoteur T7 et en amont du virus de l'hépatite delta (VHD) séquences ribozyme, désigné comme pProT7-S (+), pProT7-M (+), ou pProT7-L (+), respectivement 2. T7 RNA polymérase exprimée dans les cellules BHK/T7-9 transcrit les ARN codant pleine longueur S, M, ou L-segment avec précision le génome extrémité 3 '. Le cadre de lecture ouvert (ORF) de N ou de protéines L sont clonés dans le virus de l'encéphalomyocardite (EMCV) site d'entrée interne des ribosomes (IRES), qui sont désignés comme pT7-IRES-VN ou pT7-IRES-VL, respectivement, pour permettre à la non plafonnés T7 ARN transcrit à être reconnu par les ribosomes à Cap-indépendancemanière Dent. L'ORF M est cloné sous la b-actine de poulet promoteur du plasmide pCAGGS 24, qui est désigné comme pCAGGS-VG, pour permettre la synthèse de 78kD, NSM, Gn et Gc protéines, qui sont générées à partir AUG différents en scannant fuit 23. Les deux protéines N et L sont nécessaires pour initier la transcription ou la réplication de l'ARN, alors que le pT7-IRES-VN et pT7-IRES-VL sont pas essentielles pour la récupération de 2 recombinante MP-12, probablement due à l'expression présumable fuite de Pol- II axée plafonné ARN transcrits codant pour la N-FRO et L-ORF de pProT7-S (+) et pProT7-L (+), respectivement.
Figure 3. Récupération de RVFV MP-12 à partir de l'ADN plasmidique
La transfection de cellules avec BHK/T7-9 pProT7-S (+), pProT7-M (+), pProT7-L (+), pT7-IRES-VN, pT7-IRES-VL et pCAGGS-VG plasmides (Fig.1 ) génère recombinant infectieux RVFV MP-12 souche dans le surnageant de cultures. Le surnageant à 5 jours après la transfection, sont recueillies, et repiquées dans de nouveaux cellules Vero E6 pour l'amplification virale. Généralement, plus de 1 x 10 6 pfu / ml de virus peuvent être récupérés à 3 à 4 jours après l'infection. Le virus amplifié (E6P1 virus) est titrée en utilisant essai de plaque avec Vero E6 cellules et utilisé pour l'analyse phénotypique et études d'immunogénicité.
Figure 4. S-segment du MP-12 et rMP12-C13type
La comparaison des MP-12 et rMP12-C13type (C13type) S-segments. Comparé au SNRS de MP-12 souche, l'ORF NSS du C13type est tronqué de 69%, et est identique à celle du clone naturellement isolés 13 souche 2,25.
Figure 5. Essai de plaque pour le MP-12 (NSS fonctionnelle) et C13type (non fonctionnel NSS)
La monocouche de Vero E6 cellules dans une plaque à 6 puits est utilisée pour le dosage de la plaque. Après 3 jours d'incubation avec superposition de gélose à 0,6%, la seconde couche de gélose contenant solution neutre rouge est ajouté. Ensuite, les plaques sont comptées à l'infection 4 jours post. MP-12 forme des plaques claires de tailles variées, tandis que C13type forme des plaques trouble important (ou foyers). Le bien de 10 à 100 plaques doivent être utilisés pour le comptage.
Figure 6. Voie d'activation de la phosphatase alcaline sécrétée (SEAP) gène rapporteur dans des cellules MEF C57/WT
Interféron bêta-promoteur comprend les séquences de liaison d'AP-1, NF-kB et IRF-3. Réplication active RVFV AP-1, NF-kB et IRF-3 7,11. Toutefois, NSS inhiber la libération des complexes répresseur du promoteur IFN-bêta, même après la liaison de ces facteurs de transcription, supprimant ainsi la synthèse de l'IFN-bêta ARNm 26. Par ailleurs, séquestre NSs TFIIH p44 subunits8 et unLSO favorise la dégradation de TFIIH p62 sous-unités 27, induisant ainsi une suppression d'accueil générale de transcription dont l'IFN-alpha du gène et les gènes sous le promoteur ISRE. C13type ou d'autres mutants NSs manquent fonction de suppression de l'IFN-bêta induisent IFN-bêta de synthèse, qui à son tour active le promoteur de l'IFN-alpha et l'interféron-sensibles élément de réponse (ISRE) promoteur. IRF-7 est alors transcriptionnellement régulé à la hausse par la stimulation et la IFN-alpha/beta encore régulés par l'IFN-alpha à l'appui de l'IRF-3 28,29. Dans cet essai, les cellules MEF C57/WT encoder la phosphatase alcaline sécrétée (SEAP) à l'aval d'une séquence artificielle liaison de NF-kB, IRF-3 et IRF-7. Ainsi, les mutants NSs manquent fonction de suppression de l'IFN-bêta réguler positivement SEAP dont la sécrétion est ensuite mesurée.
Figure 7. Induction de SEAP par C13type
C57/WT cellules MEF (InvivoGen) ont été maquetteInfectés ou infectés par le MP-12 ou rMP12-C13type (C13type) à moi de 3 (panneau de gauche) ou 0,01 (panneau de droite). Les surnageants de culture (50 pi) à 14 HPI ont été mélangés avec 200 pi de quanti-Bleu (InvivoGen) substrat en plaque de 96 puits et les valeurs de DO à 650 nm ont été mesurées après 1 heure d'incubation à 37 ° C par un lecteur de plaque. Les augmentations relatives de SEAP pour se moquer de cellules infectées sont affichés. Les données représentent la moyenne + / - écart-type de trois expériences indépendantes. Le surnageant de culture de cellules infectées par C13type montre SEAP augmenté, suggérant l'absence de répression de la transcription d'hôte par le NSS.
Figure 8. Northern blot avec une sonde marquée DIG-RNA
Wild-type de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), les cellules ont été infectées maquette ou infectés par le MP-12 ou rMP12-C13type (C13type) à moi de 3. L'ARN total a été recueilli à 7 HPI en utilisant Trizol (Invitrogen), et du Nord bbeaucoup a été réalisé en utilisant une sonde marquée à la digoxigénine ARN spécifique à la souris endogènes ISG56 ARNm ou MP-12 ARNm N / anti-viraux-sens S-segment de 2,30. Pour faire des sondes pour la souris endogènes ISG56 ARNm ou RVFV N ARNm / anti-viral-sens S-segment, les fragments PCR amplifiés par l'amorce ensemble de KpnmISG56F (GGG TGG TAC TCC CCG ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG ACG) et HindmISG56 (TAC AAA GCT GGG TAT AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG) pour ISG56 ARNm ou KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA GCT TGC G) et HindNR (GGG CAA GCT CTG TTT AGG CTG TCT TGT AAG) pour RVFV ARNm N / anti-viral-sens S-segment ont été digérés avec Kpn I et Hind III, et ligaturé dans pSPT18 plasmide (Roche. Puis sondes ARN marquées à la digoxigénine ont été synthétisés en utilisant l'ARN DIG Labeling Kit (SP6/T7) (Roche, Cat # 1 175 025). Le niveau ARNr 28S de chaque échantillon est également démontré que le contrôle du chargement. cellules MEF de type sauvage infecté par C13type induit la synthèse d'ARNm ISG56, alors que ceux infectés par MP-12 N'a pas l'induire, suggérant l'absence de répression de la transcription d'accueil en C13type cellules infectées. Les données sont cohérentes avec celles obtenues par le dosage SEAP dans la figure 6.
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Discussion
Systèmes de génétique inverse pour les RVFV ont été développés par plusieurs groupes en utilisant le promoteur T7 2,4,5 ou une souris 3 ou 4 humains Pol-i promoteur. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole visant à générer des recombinants RVFV MP-12 souches en utilisant BHK/T7-9 cellules 15 qui expriment de façon stable la T7 RNA polymérase. L'efficacité de la récupération virale varie en fonction de l'état de BHK/T7-9 cellules, le montant des plasmides, le nombre de cellules transfectées et ainsi de suite. Nous avons toujours amplifier le virus P0 à Vero E6 cellules pour obtenir des stocks de virus de haute titrage pour les expériences. Type I IFN-cellules compétentes telles que diploïdes pulmonaires humaines (MRC-5) cellules pourraient être utilisées pour l'amplification virale uniquement lorsque la fonction prise en charge NSs une réplication virale en inhibant l'efficacité des activités antivirales dont l'IFN de type I ou PKR.
Un essai de plaque est une méthode très utile pour le titrage MP-12 et les mutants NSS. À titre de précaution pour ladosage de la plaque, les cellules doivent être immédiatement ajoutée avec superposition à la température appropriée, après l'enlèvement des inoculums viraux. Coloration au cristal violet n'est pas adapté pour détecter le virus de plaques C13type, parce que le virus C13type ne pas perturber la monocouche de cellules Vero E6 2. D'autre part, neutre coloration rouge peut détecter avec succès les plaques formées par le virus C13type. La force de coloration cellulaire avec du rouge neutre est déterminé par l'incorporation relative de colorant rouge neutre dans les cellules vivantes. Ainsi, il est probable que C13type cellules infectées ont une activité métabolique réduite, ce qui conduit à l'incorporation diminué de colorant rouge neutre par rapport à celle des cellules non infectées, et qui forme un accent faible coloration. Le montant requis de rouge neutre varie selon le lot de solution de rouge neutre. Stockage à long terme de solution de rouge neutre génère souvent précipités. Cela pourrait être évité par la chaleur de dissolution d'une solution de rouge neutre à 55 ° C pendant 10 min, mais ilaffecte la coloration des cellules.
Il est important d'utiliser des virus avec titre viral précise dans les expériences. Le titre dans un stock viral pourrait être diminué par des médias avec un pH inférieur à 6,5 31 qui est indiqué par la couleur jaune du rouge de phénol dans le stock viral, stockage à long terme, a répété cycles gel-dégel, etc. Ainsi, il est important d'utiliser fraîche stock viral pour la vaccination des animaux ou titrer le stock de nouveau juste avant l'expérimentation.
RVFV encoder deux caractérisée protéines non structurales; NSs et NSM. Le SNRS RVFV manque est significativement atténuée chez les animaux 25,32, tandis que le NSM RVFV manque est toujours très virulent chez les rats 33. Ainsi, le SNRS joue un rôle majeur en tant que facteur de virulence dans la pathogenèse. NSS est une protéine multifonctionnelle qui induit 1) la suppression de la transcription de l'hôte en général 8, 2) la dégradation de la suppression de synthèse de l'ARNm de l'IFN-beta 26 et 3) d'ARNdb-depprotéine kinase endent (PKR) 9,10. Les parents MP-12 pourrait encore être contrainte atténuée par l'introduction de la troncature ou des mutations dans NSS. D'autre part, il est également important de maintenir l'immunogénicité d'un tel mutant MP-12. IFN de type I joue un rôle pour la maturation des cellules dendritiques, ce qui est important pour les différenciations des cellules T et B 12-14. Divers mutants NSs manquent fonction de suppression de l'IFN-bêta, qui maintiennent les fonctions NSs intégrale ou partielle, sont utiles pour analyser l'impact de la fonction NSS-médiée de suppression de l'IFN-beta sur l'immunogénicité et l'innocuité des vaccins candidats. Il est connu que les cellules infectées par RVFV poids souche ZH548 activer NF-kB, IRF-3 et AP-1 (figure 6), tandis que la synthèse d'ARNm de l'IFN-beta est supprimée par le NSS 7 au niveau transcriptionnel. Ainsi, MP-12, qui exprime pleinement fonctionnel NSS 3, inhibe la synthèse de la SEAP NF-kB/IRF-3/7-inducible ARNm du gène rapporteur au transcriniveau ptionnel, tandis recombinant fonctions MP-12 NSs manquent tels que C13type pourrait induire la synthèse de l'ARNm de SEAP (figure 7). Pour bien comprendre le résultat de l'immunogénicité de ces mutants, les phénotypes devrait en outre être caractérisée dans le système de culture cellulaire. Par exemple, la cinétique de réplication virale devrait être testé dans les cellules de l'IFN de type I compétentes telles que les diploïdes pulmonaires humains cellules MRC-5 ou de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) cellules. La fonction de la dégradation de la PKR peuvent être testés par Western blot avec des anticorps spécifiques à PKR humaine ou de souris. L'induction d'ARNm de l'IFN-beta par mutation NSs devrait être confirmée par Northern blot avec la digoxigénine marqué sonde ARN spécifique à l'homme ou la souris IFN-bêta ARNm. Suppression de la transcription hôte générale peut être testée par l'analyse de l'incorporation d'un analogue de l'uridine en ARNm naissant. Finalement, l'immunogénicité et l'innocuité de mutants MP-12 NSs candidat doit être testé chez la souris. Pfu Typiquement, 1 x 10 5 du candidavaccin contre TE dilué dans du PBS est donnée en sous-cutané et des sérums prélevés à partir du sinus rétro-orbitaire au jour 30 (ou 42) et 180 jours sont testés pour la présence d'anticorps neutralisants par réduction des plages neutraliser essai (PRNT 80) et le total des IgG contre RVFV N et Gn / Gc par ELISA IgG recouvert d'recombinant purifié les protéines virales. L'efficacité des vaccins candidats peuvent être testés par des souris défi de 42 jours après l'immunisation avec le type sauvage ZH501 (par exemple, IP, 1 x 10 3 pfu) à des animaux du niveau de biosécurité (BSL) 4 installations ou améliorés BSL3 installation + dans les Etats-Unis L'inverse approche de la génétique est un outil puissant pour la conception et de générer sûrs et immunogènes vaccins vivants atténués RVFV.
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Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la concession numéro 5 U54 AI057156-07 par le centre régional de l'Ouest d'excellence (WRCE), 1 R01-A1 AI08764301 de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses, et d'un financement interne du Centre de développement des vaccins Sealy à l'Université de Texas Medical Branch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR international | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma-Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | Invitrogen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | Invitrogen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | Invitrogen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
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