Summary
A la inversa sistema de genética de la cepa del virus de la fiebre del Valle del Rift MP-12 vacuna es una herramienta útil para la creación de nuevas MP-12 mutantes con mayor atenuación e inmunogenicidad. Se describe el protocolo para la generación y caracterización de cepas mutantes Sociedades Nacionales.
Abstract
Valle del Rift virus de la fiebre (RVFV), que causa la fiebre hemorrágica, trastornos neurológicos o ceguera en los seres humanos, y una alta tasa de aborto y de malformaciones fetales en los rumiantes 1, ha sido clasificado como HHS / USDA se superponen agente de seleccionar un agente patógeno y el nivel 3. Pertenece al género Phlebovirus de la familia Bunyaviridae, y es uno de los miembros más virulenta de esta familia. Varios sistemas de genética inversa para la cepa RVFV MP-12 2,3 vacuna, así como las cepas salvajes RVFV 4-6, incluyendo ZH548 y ZH501, se han desarrollado desde el año 2006. El MP-12 cepa (que es un grupo de riesgo 2 y un agente patógeno no seleccionar) está muy atenuado por varias mutaciones en su M y L-segmentos, pero todavía lleva virulenta S-segmento de ARN 3, que codifica una virulencia funcional factor, NSS. El rMP12-C13type (C13type) la realización de 69% en el marco de la eliminación de Sociedades Nacionales ORF carece de todas las funciones conocidas Sociedades Nacionales, al mismo tiempo que se replica como eficient al igual que el MP-12 en células que carecen de VeroE6 tipo I IFN. Sociedades Nacionales induce una desconexión de la transcripción de host, entre ellos el interferón (IFN) beta-ARNm 7,8 y promueve la degradación de la doble hélice de proteína quinasa dependiente de ARN (PKR) en el nivel post-traduccional 9,10. IFN-beta es transcripcionalmente regulado al alza por el interferón factor regulador 3 (IRF-3), NF-kB y la proteína activadora-1 (AP-1), y la unión de IFN-beta de IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) estimula la transcripción de IFN-alfa genes u otros genes de interferón estimulado (ISGs) 11, lo que induce a las actividades de acogida antiviral, mientras que la supresión de acogida transcripción incluyendo IFN-beta de genes por Sociedades Nacionales evita que el gen de los upregulations ISGs en respuesta a la replicación viral a pesar de la FIC-3, NF-kB y activador proteína-1 (AP-1) puede ser activada por RVFV7. . Por lo tanto, NSS es un excelente objetivo para atenuar aún más MP-12, y para mejorar las respuestas inmunitarias del huésped natural por la abolición de la función de supresión de IFN-beta. Aquí, Se describe un protocolo para la generación de una proteína recombinante MP-12 Sociedades Nacionales de codificación mutado, y proporcionar un ejemplo de un método de cribado para identificar mutantes que carecen de Sociedades Nacionales de la función de reprimir IFN-beta síntesis de ARNm. Además de su papel esencial en la inmunidad innata, el tipo de IFN-I es importante para la maduración de las células dendríticas y la inducción de una respuesta adaptativa inmune 12-14. Por lo tanto, la inducción de mutantes Sociedades Nacionales de tipo I IFN son más atenuados, pero al mismo tiempo son más eficientes para estimular respuestas inmunes del huésped de tipo salvaje MP-12, que los convierte en candidatos ideales para los enfoques de vacunación.
Protocol
1. Recuperación de MP-12 recombinante mutación Sociedades Nacionales de codificación (s) a partir del plásmido ADN 2
- Propagación de riñón de hámster bebé (BHK) / T7-9 celdas 15, que expresan establemente T7 ARN polimerasa, en 6 cm de platos en medio mínimo esencial (MEM)-alfa (Invitrogen, Cat. # 32561037) con 10% de suero fetal bovino (FBS ), penicilina-estreptomicina (penicilina: 100 U / ml, estreptomicina: 100 ug / ml) (Invitrogen, Cat. # 15140122), y 600 mg / ml de higromicina B (Cellgro, Cat # 30-240-CR).
* La eficiencia de la recuperación viral es mayor en los platos de 6 cm que en los platos de 35 mm. BHK/T7-9 células con el paso bajo nivel de apoyo a mayores tasas de recuperación. Por otra parte, otras líneas de células BHK que expresan establemente T7 ARN polimerasa se podría utilizar 4,5,16,17. - Cuando las células han llegado a 70-80% de confluencia, sustituir el sobrenadante del cultivo con agua fresca MEM-alfa que contiene 10% de SFB y la penicilina-estreptomicina (que no contengan higromicina B).
* Las celdas deben ser transfected 1 hora después de sustituir el medio de evitar la pérdida de expresión T7 ARN polimerasa. - Para la recuperación de RVFV, un conjunto de plásmidos que codifican ARN viral genómico de larga duración en la expresión del ARN viral, y un segundo conjunto de codificación del gen viral marcos de lectura abierta de expresión de la proteína viral (Figuras 1 y 2) son obligatorios. Prepare una mezcla de los plasmids2 siguientes (Figura 2) en un tubo de 1,5 ml:
- pProT7-S (+) con la mutación (s) en el gen de Sociedades Nacionales (2 mg): Este plásmido codifica el anti-viral de sentido (sentido positivo) de larga duración RVFV MP-12 S-segmento flanqueado por el promotor T7 y el virus de la hepatitis delta (VHD) ribozima secuencia.
- pProT7-M (+) (2 mg): Este plásmido codifica el anti-viral de sentido (sentido positivo) de larga duración RVFV MP-12 M-segmento flanqueado por el promotor T7 y la secuencia de HDV ribozima.
- pProT7-L (+) (2 mg): Este plásmido codifica anti-viral de sentido (sentido positivo) de larga duración RVFV MP-12 L-segmento flanked por el promotor T7 y la secuencia de HDV ribozima.
- pT7-IRES-VN (2 mg): Este plásmido codifica la RVFV MP-12 N marco de lectura abierta (ORF) aguas abajo del promotor T7 y un virus de la encefalomiocarditis (EMCV) del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
- pT7-IRES-vL (1 mg): Este plásmido codifica la RVFV MP-12 L ORF aguas abajo del promotor T7 y un EMCV IRES.
- pCAGGS-VG (1 mg): Este plásmido codifica RVFV MP-12 M ORF de la beta-actina de pollo promotor.
* La adición de pT7-IRES-VN, pT7-IRES-vL y pCAGGS VG-no es esencial para la recuperación de MP-12, sino que mejora la eficiencia de rescate 2. Los autores experimentados pobre expresión de Gn / Gc mediante el uso de pT7-IRES plásmido, probablemente debido a la falta de fugas de escaneo de AUG por los ribosomas. Por lo tanto, hemos construido pCAGGS-VG de la tapa que dependen Gn / Gc expresión.
- Añadir 30 ml de tránsito-LT1 (Mirus, Cat # MIR2300) a 385 ml de Opti-MEM (Invitrogen, Cat # 31985070) en un tubo de 1,5 ml y agitar brevemente.
- Después de la incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, agregue lentamente el Opti-MEM con liposomas para la mezcla de plásmidos de paso de 1,3 a, mezclar suavemente con la pipeta e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
- Añadir la mezcla de liposomas y plásmidos al medio de cultivo de las células de paso BHK/T7-9 1,2 gota a gota (Figura 3).
- Se incuban las células transfectadas a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO 2 durante 24 horas, y sustituir el sobrenadante del cultivo con agua fresca MEM-alfa que contiene 10% de SFB y la penicilina-estreptomicina (que no contengan higromicina B).
- Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO 2 durante 4 días más (incubar durante 5 días en total), y recoger el sobrenadante de cultivo en un tubo de 15 ml.
* El efecto citopático (ECP) se observa aquí no reflejan necesariamente el resultado de la recuperación viral exitosa, debido a que la transfeccióninduce la muerte celular que se parece a la CPE causada por la replicación viral de ARN o la síntesis de proteínas virales. - Centrifugar los sobrenadantes a 2.200 xg a 4 º C durante 5 min.
* El propósito de este paso es precipitado por los restos celulares del stock viral. Un cubo de centrífuga hermética a los aerosoles, se recomienda para mayor seguridad. - Transferir el sobrenadante en criotubos con tapón de rosca de 5 ml, y almacenar el paso 0 (P0) stock de virus a -80 ° C para su uso posterior.
2. La amplificación del virus de la P0
- El P0 muestras contienen a menudo título viral insuficiente para experimentos posteriores 2. Un paso de amplificación en VeroE6 células, que es un clon de riñón de mono verde africano (células Vero) carecen de los genes IFN-alpha/beta 18,19, aumenta el título viral hasta el nivel máximo. Alternativamente, las células que carecen de otras de tipo I IFN respuestas tales como las células Hec1B 20 o células MEF de los ratones knock-out IFNAR1 21 might ser utilizado para este paso. Propagación VeroE6 células en 10 cm de platos modificados medio mínimo de Dulbecco esencial (DMEM) (Invitrogen, Cat. # 11965092), que contiene 10% de SFB, penicilina-estreptomicina (penicilina: 100 U / ml, estreptomicina: 100 mg / ml), y se incuba a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO 2 hasta alcanzar el 80% de confluencia.
* Recombinante MP-12 cepas mutantes de codificación Sociedades Nacionales no suelen replicarse eficientemente en tipo I IFN-células competentes. - Mezclar 300 ml de P0 muestras con 2,7 ml de DMEM con FBS al 10% y penicilina-estreptomicina. Retire el medio de cultivo de células de 2,1 VeroE6 paso y sustituirlo por el P0 diluye la muestra. Se incuba a 37 ° C durante 1 h en un incubador con 5% de CO 2.
- Eliminar el inóculo y añadir 10 ml de DMEM con FBS al 10% y penicilina-estreptomicina a cada plato.
- Se incuba a 37 ° C durante 3 a 4 días hasta CPE VeroE6 de células se hace evidente.
* La interrupción de la monocapa se produce durante la infección por el MP-12, rodeado poe recombinante MP-12 Sociedades Nacionales que carecen, como rMP12-C13type (C13type) (Figura 4), no interrumpe la monocapa, pero un número de células muertas flotando aparecen de 2 a 3 días después de la infección. - Cosecha el sobrenadante de 3 a 4 dpi, tal como se describe en las secciones 1.9) y 1.10), y designar a las muestras como E6P1.
3. La titulación de recombinantes MP-12 por la placa de ensayo
- Propagación VeroE6 células en placas de 6 pocillos.
* Duplicar el análisis por muestra es más confiable que el análisis individual. - Cuando las células VeroE6 han crecido hasta 80% de confluencia, preparar 10 diluciones seriadas de muestras de virus en DMEM con FBS al 10% y penicilina-estreptomicina hasta 6.10 de la siguiente manera:
- 10 l de E6P1 muestra + 990 ml de DMEM con FBS al 10% y penicilina-estreptomicina (10 -2 dilución)
- 100 l de 10 -2 muestra + 900 ml de DMEM con FBS al 10% y penicilina-estreptomicina (10 dilución -3)
- 100l de muestra de 10 -3 + 900 ml de DMEM con FBS al 10% y penicilina-estreptomicina (10 dilución -4)
- 100 l de muestra de 10 -4 + 900 ml de DMEM con FBS al 10% y penicilina-estreptomicina (5.10 de dilución)
- Aspirar medio de la placa de 6 pocillos en el paso 3.1 y añadir 400 l de cada dilución (del paso 3.2) en los pocillos (Figura 3).
- Se incuba a 37 ° C durante 1 h en un incubador con 5% de CO 2.
- Durante la incubación, preparar dos tubos de 15 ml de agar-superposición de la siguiente manera:
Un tubo (tenga en baño de agua 42 ° C): 7 ml de 1,2% de agar noble (VWR, Cat # 101.170-362) en el agua
Tubo B (mantener a 37 ° C baño de agua): 7 ml de medio de Eagle modificado (MEM 2x) (Invitrogen, Cat. # 11935046), que contiene 10% de SFB, penicilina-estreptomicina (penicilina: 100 U / ml, estreptomicina: 100 mg / ml), y el 10% de fosfato de triptosa caldo (MP Biomedicals, Cat # 1682149). - Después de 1 h de incubación, retire el virusinóculos, e inmediatamente agregue 2 ml por pocillo de una mezcla de 1:1 de un tubo y el tubo B (desde el paso 3.5).
* Tenga cuidado de agregar la superposición de inmediato como el secado de los pozos provoca la muerte de las células no infectadas. - Las placas se incuban a 37 ° C durante 3 días en una incubadora con 5% de CO 2.
- Prepare el tubo A y B del tubo y como se describe en el paso 3.5. Prepare también 500 l de 0,33% neutral solución de color rojo (Sigma Aldrich, Cat. # N2889-100 ml) por cada placa que también se mantiene a 37 ° C baño de agua.
- Mezclar el tubo A, B y tubo de 500 ml (concentrado final. 0,011%) de solución de rojo neutro y agregar 2 ml de la mezcla por pocillo.
* La cantidad de solución de rojo neutro que se añade varía según la cantidad de solución de rojo neutro, y la optimización inicial se requiere. Almacenamiento a largo plazo de la solución neutra de 0,33% de rojo hace que la precipitación. En tales casos, el precipitado puede ser totalmente disuelta por la incubación a 55 ° C durante 10 minutos seguido de una agitación vigorosa. El uso de la r neutral precipitadoed resultados de la solución de tinción débil de las células, mientras que vuelve a disolver las manchas rojas solución neutral y células. - Se incuba la placa durante 16 horas (o durante la noche) a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO 2.
- Cuente el número de placas en el pozo que contiene de 10 a 100 placas por pocillo. Calcular el número de unidades formadoras de placa / ml. Por ejemplo, si nos fijamos en 28 placas en los pozos inoculadas con diluciones del 10 -5, 28 (N º de placas) x (1 ml/0.4 ml) x 10 5 (dilución) = 7,0 x 10 6 unidades formadoras de placa (ufp) / ml (Figura 5).
4. Detección de mutantes que carecen de Sociedades Nacionales de la función de tipo I IFN supresión
- Propagación C57/WT MEF células (Invivogen, Cat # mef-c57wt), que codifican una secreta embrionarias fosfatasa alcalina (SEAP) inducible de genes de NF-kB y la FIC-3 / 7 (Figura 6), en placas de 12 pocillos. Las células se mantuvieron en DMEM con 10% de SFB, penicilina-estreptomicina (PeniciMILD: 100 U / ml, estreptomicina: 100 ug / ml), Blasticidin S (3 mg / ml), y Zeocin (100 ug / ml).
- Cuando las células se vuelven sub-confluentes (80%), las células son modelo de infectados o infectadas con el MP-12 recombinante o MP-12 mutaciones Sociedades Nacionales de codificación a una multiplicidad de infección (MOI) de 3 o 0,1 (ver secciones 2 y 3, la cantidad de cada inóculo debe ser de 300 l). En 1 h post infección, eliminar el inóculo y añadir 1 ml por pocillo de DMEM con 10% de SFB, penicilina-estreptomicina (penicilina: 100 U / ml, estreptomicina: 100 ug / ml) (Blasticidin Zeocin y no se agregan en este tiempo).
- A los 14 h después de la infección, recoger los sobrenadantes del cultivo. Añadir 200 l de Quanti-azul (Invivogen, Cat # re-QB1) y 50 l de cada muestra (por triplicado) en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Sellado e incubar la placa a 37 ° C durante 1 h.
* Tanto el MP-12 y MP-12 recombinante Sociedades Nacionales carecen de claridad inducir la supresión de traslación en las células huésped IFN-alpha/beta competentes, incluidos 293 células, las células MRC-5 y EMBR ratónYonic fibroblastos (MEF), las células después de 14 horas post-infección en alta moi. Por otro lado, el IFN-beta ARNm o mRNA ISG56 acumula abundante de 7 a 8 horas después de la infección en el tipo I IFN células competentes. Por lo tanto, se optó por 14 horas post-infección para recoger los sobrenadantes para ver la acumulación de la SEAP inducida por la respuesta inmune innata. - Lea los valores de DO a 650 nm utilizando un lector de placas (Figura 7).
* Los resultados son consistentes con los datos obtenidos por Northern blot utilizando una sonda de ARN específicas para ratón ISG56 ARNm, lo que demuestra la regulación de ISG56 mRNA en la ausencia de expresión de NSS (Figura 8).
* Cabe señalar que la actividad SEAP está determinada por la abundancia de proteínas que podrían ser afectados por la actividad de acogida de traducción. A nivel relativo de la SEAP no puede ser alto en comparación con el aumento del nivel de ARNm de SEAP, porque no pueden ser sintetizados, incluso en presencia de ARNm de SEAP si la traducción celular es SupprEssen. Northern blot es un ensayo más sencillo y una forma más precisa para evaluar la cantidad de ARNm inducidos por la falta de funciones en las células infectadas Sociedades Nacionales de la SEAP reportero de ensayo. Sin embargo, el sistema reportero SEAP es más rápida que la mancha del Norte y por lo tanto útil para la detección rápida de mutaciones potencialmente Sociedades Nacionales carecen de transcripción anfitrión función de supresión.
5. Los resultados representativos:
El sistema de genética inversa generado consistentemente viable recombinante MP-12 virus con títulos superiores a 1 x 10 6 ufp / ml. C13type virus que carecen de funciones de Sociedades Nacionales forman grandes placas turbias, mientras que MP-12 formó placas claras de diferentes tamaños 2 (Figura 5). Simulacro de las células infectadas por el MEF C57/WT o los infectados por el MP-12 no aumentó el nivel de la SEAP en el sobrenadante del cultivo en comparación con el modelo de las células infectadas, mientras que el sobrenadante de cultivo de células MEF C57/WT infectados con C13type contenía un aumento denivel de la SEAP por 14 horas post-infección (hpi) (Figura 7). Estos resultados son consistentes con los obtenidos por Northern blot utilizando una sonda de ARN específicas para ratón ISG56 ARNm (Figura 8).
Figura 1. Genoma estructura de RVFV
RVFV tiene un tripartito en sentido negativo o ambisense genoma de ARN llamado S, M, L y segmentos. S-segmento codifica genes N y Sociedades Nacionales de manera ambisense. N ARNm se sintetiza a partir viral de sentido (sentido negativo) S-segmento, mientras que Sociedades Nacionales de ARNm se sintetiza a partir anti-viral de sentido (sentido positivo) S-segmento. M-segmento codifica un ARNm M de simple y sintetiza the78kD, Nm, GN o las proteínas Gc por fugas de escaneo de AUGs varios 5'region de ARNm M, seguido por sus compañeros de división de traslación 22,23. L-segmento codifica la proteína L. Ambas proteínas N y L son esenciales para la transcripción y replicación viral, mientras que Gn y Gc son las proteínas de la envoltura viral. Sociedades Nacionales y de las proteínas Nm son las proteínas no estructurales, que no se incorporan a las partículas del virus.
Figura 2.. Diseño del plásmido de ADN para la recuperación de recombinantes RVFV MP-12 cepa
La codificación de cDNA de longitud completa anti-viral de sentido S, M, L o segmentos son cloneddownstream del promotor T7 y aguas arriba de la hepatitis delta virus (HDV) secuencias de ribozima, designada como pProT7-S (+), pProT7-M (+), o pProT7-L (+), respectivamente 2. T7 ARN polimerasa se expresa en las células BHK/T7-9 transcribe la codificación de ARN de larga duración en S, M, L o segmentos con precisión genoma extremo 3 '. El marco de lectura abierta (ORF) de N o L proteínas son clonados en la encefalomiocarditis virus (EMCV) del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), que se designan como pT7-IRES-vN o pT7-VL-IRES, respectivamente, para permitir que el destapado T7 ARN transcrito a ser reconocido por los ribosomas en la tapa de inde-dente manera. La ORF M se clona en el pollo b-actina promotor de pCAGGS plásmido 24, que se designa como pCAGGS-VG, para permitir la síntesis de 78kD, Nm, Gn y Gc proteínas, que son generados a partir de diferentes AUGs por fugas de barrido 23. Ambas proteínas N y L son necesarios para iniciar la transcripción o la replicación del ARN, mientras que el pT7-IRES-vN y pT7-IRES vL-no son esenciales para la recuperación de proteínas recombinantes de 2 MP-12, probablemente debido a la expresión presumible fuga de Pol- II impulsado por un tope codificación de las transcripciones de ARN N-ORF y L-ORF de pProT7-S (+) y pProT7-L (+), respectivamente.
Figura 3. Recuperación de RVFV MP-12 a partir del ADN plásmido
La transfección de células con BHK/T7-9 pProT7-S (+), pProT7-M (+), pProT7-L (+), pT7-IRES-vN, pT7-IRES-vL y pCAGGS-VG plásmidos (Fig. 1 ) genera infecciosas recombinante RVFV MP-12 en el sobrenadante de cultivo de la cepas. El sobrenadante a 5 días después de la transfección se recoge, y se pasaron al fresco las células Vero E6 para la amplificación viral. Por lo general, más de 1 x 10 6 ufp / ml de virus se puede recuperar de 3 a 4 días post infección. El virus de la amplificación (E6P1 virus) se valora mediante el uso de la placa de ensayo con células Vero E6 y se utiliza para el análisis de fenotipo y estudios de inmunogenicidad.
Figura 4. S-segmento de MP-12 y rMP12 C13type-
La comparación de las MP-12 y rMP12-C13type (C13type) S-segmentos. En comparación con Sociedades Nacionales de la cepa MP-12, la ORF Sociedades Nacionales de C13type se trunca en un 69%, y es idéntica a la del natural aislado clon 13 cepa 2,25.
Figura 5. Placa de ensayo para MP-12 (Sociedades Nacionales funcional) y C13type (no funcional NSS)
La monocapa de Vero E6 células en una placa de 6 pocillos se utiliza para la placa de ensayo. Después de 3 días de incubación, con una capa de agar 0,6%, la segunda capa de agar que contiene la solución de rojo neutro, se añade. Luego, las placas se cuentan en días después de la infección 4. MP-12 forma placas clara de tamaños variados, mientras que las formas C13type grandes placas turbias (o focos). El pozo de 10 a 100 placas deben utilizarse para el recuento.
Figura 6. La activación de la vía segregada de la fosfatasa alcalina (SEAP) reportero de genes en células MEF C57/WT
El interferón-beta promotor incluye las secuencias de unión de AP-1, NF-kB y la IRF-3. Replicación activa RVFV AP-1, NF-kB y 7,11 IRF-3. Sin embargo, el NSS inhibir la liberación de complejo represor del promotor de IFN-beta, incluso después de la unión de los factores de transcripción, por lo que suprime la síntesis de ARNm de IFN-beta 26. Por otra parte, NSS secuestra TFIIH P44 subunits8 y unlso promueve la degradación de p62 TFIIH subunidades 27, lo que induce una supresión de acogida transcripción general, incluyendo IFN-alfa de genes y genes bajo el promotor ISRE. Mutantes C13type Sociedades Nacionales u otras que carecen de IFN-beta función de supresión de inducir la síntesis de IFN-beta, que a su vez activa el promotor de IFN-alfa y el promotor de la respuesta del interferón-elemento sensible (NTR). IRF-7 es entonces transcriptionally upregulated por la estimulación IFN-alpha/beta y más regulado al alza por el IFN-alfa en apoyo de la FIC-3 28,29. En este ensayo, las células MEF C57/WT codifica la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) en el río abajo de una secuencia artificial de unión de NF-kB, IRF-3 y IRF-7. Por lo tanto, los mutantes que carecen de Sociedades Nacionales de IFN-beta función de supresión de upregulate SEAP cuya secreción se mide.
Figura 7. La inducción de la SEAP por C13type
C57/WT células MEF (Invivogen) se burlanInfectados o infectados por el MP-12 o rMP12-C13type (C13type) a moi de 3 (panel izquierdo) o 0,01 (panel derecho). Sobrenadantes de cultivo (50 l) a las 14 hpi se mezclaron con 200 l de Quanti-azul (Invivogen) sustrato en placa de 96 pocillos y los valores de DO a 650 nm se midió después de 1 h de incubación a 37 ° C por un lector de placas. Los incrementos relativos de la SEAP para burlarse de las células infectadas se muestran. Los datos representan la media + / - desviación estándar de tres experimentos independientes. El sobrenadante de cultivo de las células infectadas por C13type SEAP muestra un aumento, lo que sugiere la falta de supresión de acogida transcripción de la NSS.
Figura 8. Mancha del Norte con la etiqueta DIG-sonda de ARN
De tipo salvaje fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), las células fueron modelo de infectados o infectadas con el MP-12 o rMP12-C13type (C13type) a moi de 3. El ARN total se recogió a las 7 de hpi usando Trizol (Invitrogen), y b del Nortemucho se llevó a cabo mediante el uso de la sonda marcada con digoxigenina ARN específicos de ratón endógeno ISG56 ARNm o MP-12 mRNA N / anti-viral de sentido S-segmento de 2,30. Para la toma de las sondas para el ratón endógeno ISG56 ARNm o mRNA de RVFV N / anti-viral de sentido S-segmento, los fragmentos de PCR amplificado por el primer conjunto de KpnmISG56F (GGG TAC TGG CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC ACG CAG AAG) y HindmISG56 (TAC AAA GGG GCT TAT AGA GAA TGC TGG TGA TGA CCA GG) para ISG56 ARNm o KpnNF (AGT TGG TAC TAC GGA CAA CTA TCA AGA GCT TGC G) y HindNR (CAA GGG GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG) para RVFV ARNm N / anti-viral de sentido S-segmento se digiere con Kpn I y Hind III, y se ligó en pSPT18 plásmido (Roche. Luego sondas de ARN marcadas con digoxigenina fueron sintetizados utilizando DIG RNA Etiquetado Kit (SP6/T7) (Roche, cat # 1 175 025). El nivel de 28S rRNA de cada muestra se muestra también como control de carga. células de tipo salvaje MEF infectados con C13type la síntesis de ARNm inducida ISG56, mientras que los infectados por el MP-12 No lo induce, lo que sugiere la falta de supresión de acogida de transcripción en las células infectadas por C13type. Los datos son consistentes con los obtenidos por el ensayo de la SEAP en la Figura 6.
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Discussion
Invertir los sistemas de la genética para RVFV han sido desarrollados por varios grupos mediante la utilización de promotor T7 2,4,5 o ratón de 3 o 4 humanos promotor de Pol-i. En este artículo, se describe un protocolo para generar recombinantes RVFV MP-12 cepas mediante el uso de células BHK/T7-9 15 que expresan establemente T7 ARN polimerasa. La eficiencia de la recuperación viral variado dependiendo de la condición de BHK/T7-9 las células, la cantidad de plásmidos, el número de células transfectadas y así sucesivamente. Siempre amplificar el virus P0 en células Vero E6 para obtener las reservas de virus de alto título para los experimentos. Tipo I-IFN-células competentes, tales como diploides de pulmón humano (MRC-5) las células pueden ser utilizados para la amplificación viral sólo cuando las Sociedades Nacionales función de apoyo a una replicación viral eficaz mediante la inhibición de las actividades antivirales, incluyendo el tipo de IFN-I o PKR.
Un ensayo de placa es un método muy útil para titular MP-12 y los mutantes Sociedades Nacionales. Como precaución general para ella placa de ensayo, las células deben ser inmediatamente añadió con superposición a la temperatura adecuada después de la eliminación de inóculo viral. Tinción de cristal violeta no es adecuado para la detección de placas C13type virus, porque el virus C13type no interrumpa la monocapa de células Vero E6 2. Por otro lado, la tinción con rojo neutro con éxito podría detectar placas formadas por el virus de C13type. La fuerza de tinción celular con rojo neutro está determinada por la incorporación relativa de colorante rojo neutro en las células vivas. Por lo tanto, es probable que C13type las células infectadas tienen una actividad metabólica reducida, lo que conduce a la disminución de la incorporación de colorante rojo neutro en comparación con la de las células no infectadas, y que constituye un foco de tinción débil. La cantidad necesaria de rojo neutro varía según la cantidad de solución de rojo neutro. Almacenamiento a largo plazo de la solución de rojo neutro genera a menudo se precipita. Esto podría evitarse por el calor de disolución de la solución de rojo neutro a 55 ° C durante 10 minutos, sin embargo,afecta a la tinción de las células.
Es importante la utilización de virus con el título exacto viral en los experimentos. El título en una acción viral podría ser disminuido por los medios con un pH inferior a 6,5 31 que se indica por el color amarillento de rojo fenol en la acción viral, el almacenamiento a largo plazo, los ciclos repetidos de congelación-descongelación y así sucesivamente. Por lo tanto, es importante la utilización de nuevas acciones virales para la vacunación de los animales o se valora la acción de nuevo justo antes del experimento.
RVFV codifican dos proteínas no estructurales caracterizados, NSS y Nm. Las Sociedades Nacionales RVFV falta es significativamente atenuada en animales 25,32, mientras que el Nm RVFV falta es aún muy virulenta en las ratas 33. Por lo tanto, Sociedades Nacionales desempeñan un papel importante como factor de virulencia en la patogénesis. NSS es una proteína multifuncional que induce 1) supresión de la transcripción de acogida general N º 8, 2) la degradación de la supresión de la síntesis de ARNm de IFN-beta 26 y 3) de dsRNA-dependent proteína quinasa (PKR) 9,10. Los padres MP-12 cepa podría estar más atenuada mediante la introducción de truncamiento o mutaciones en el NSS. Por otro lado, también es importante para mantener la inmunogenicidad de estos mutantes MP-12. IFN de tipo I tiene un papel para la maduración de células dendríticas, que es importante para la diferenciación de las células T y células B 12/14. Varios mutantes que carecen de Sociedades Nacionales de IFN-beta función de supresión, que mantienen las funciones de Sociedades Nacionales, total o parcial, son útiles para analizar el impacto de la función de supresión de NSS-mediada por el IFN-beta en la inmunogenicidad y la seguridad de las vacunas candidatas. Se sabe que las células infectadas con la cepa RVFV peso ZH548 activan NF-kB, la FIC-3 y AP-1 (Figura 6), mientras que el IFN-beta síntesis de ARNm se suprime por la Sociedades Nacionales a nivel transcripcional 7. Por lo tanto, MP-12, que expresa completamente funcional Sociedades Nacionales 3, inhibe la síntesis de ARNm NF-kB/IRF-3/7-inducible SEAP gen reportero en transcripcional nivel, mientras que recombinante MP-12 que carecen de funciones de Sociedades Nacionales como C13type podría inducir la síntesis de ARNm de SEAP (Figura 7). Para entender correctamente el resultado de la inmunogenicidad de estos mutantes, los fenotipos que se caracteriza además en el sistema de cultivo celular. Por ejemplo, la cinética de replicación viral debe ser probado en las células tipo I IFN competentes, tales como diploides de pulmón humano MRC-5 o las células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) a las células. La función de la degradación de PKR puede ser probada por Western blot con anticuerpos específicos para PKR humanos o de ratón. IFN-beta de inducción de ARNm por la mutación Sociedades Nacionales deben ser confirmados por transferencia de Northern con digoxigenina-etiquetados ARN sonda específica para la salud humana o el ratón IFN-beta ARNm. La supresión de acogida transcripción general puede comprobarse analizando la incorporación de un análogo de uridina en ARNm naciente. Finalmente, la inmunogenicidad y seguridad de los candidatos mutantes Sociedades Nacionales MP-12 debe ser probado en ratones. Por lo general, 1 x 10 5 ufp de la candidate la vacuna diluida en PBS se administra por vía subcutánea y sueros obtenidos a partir del seno retro-orbital el día 30 (o 42) y de 180 días son prueba de la presencia de anticuerpos neutralizantes por la prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT 80) e IgG total contra RVFV N y GN / Gc por ELISA IgG recubiertos con recombinante proteínas virales. La eficacia de las vacunas candidatas pueden ser probados por los ratones un reto a los 42 días después de la inmunización con la de tipo salvaje ZH501 (por ejemplo, ip, 1 x 10 3 UFP) en el Nivel de Bioseguridad (BSL) 4 instalación o mejora BSL3 instalación + en los EE.UU. En el reverso enfoque de la genética es una herramienta poderosa para diseñar y generar seguridad e inmunogenicidad vacunas vivas atenuadas RVFV.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Subvención Número 5 U54 AI057156-07 a través del Centro Regional del Oeste de Excelencia (WRCE), 1 R01-A1 AI08764301 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, y un financiamiento interno del Centro Sealy para el Desarrollo de Vacunas de la Universidad de Texas Medical Branch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR international | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma-Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | Invitrogen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | Invitrogen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | Invitrogen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
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