Summary
De reverse genetics systeem voor de Rift Valley koorts virus MP-12 vaccinstam is een handig hulpmiddel voor het creëren van extra MP-12 mutanten met verhoogde verzwakking en immunogeniciteit. We beschrijven het protocol te genereren en karakteriseren NSS mutante stammen.
Abstract
Rift Valley-koorts virus (RVFV), dat hemorragische koorts, neurologische aandoeningen of blindheid bij mensen, en een hoog percentage abortussen en foetale misvormingen bij herkauwers 1 veroorzaakt, is geclassificeerd als een HHS / USDA overlap te selecteren agent en een risico groep 3 ziekteverwekker. Het behoort tot het geslacht Phlebovirus in de familie Bunyaviridae en is een van de meest virulente leden van deze familie. Verschillende reverse genetics systemen voor de RVFV MP-12 vaccinstam 2,3 evenals wild-type stammen RVFV 4-6, waaronder ZH548 en ZH501, zijn ontwikkeld sinds 2006. De MP-12 stam (dat is een risico groep 2 ziekteverwekker en een niet-select agent) is sterk verzwakt door verschillende mutaties in de M-en L-segmenten, maar nog steeds draagt virulente S-segment RNA 3, die een functionele virulentie codeert factor, NSS. De RMP12-C13type (C13type) dragen 69% in-frame verwijderen van NSS ORF mist alle bekende NSS-functies, terwijl het repliceert als efficient doet als MP-12 in VeroE6 cellen ontbreekt type I IFN. NSS induceert een shut-off van gastheer transcriptie waaronder interferon (IFN)-bèta mRNA 7,8 en bevordert de afbraak van double-stranded RNA-afhankelijke proteïne kinase (PKR) op de post-translationele niveau. 9,10 IFN-beta is transcriptioneel opgereguleerd door interferon regulerende factor 3 (IRF-3), NF-kB en activator proteïne-1 (AP-1), en de binding van IFN-beta aan IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) stimuleert de transcriptie van IFN-alfa genen of andere interferon gestimuleerde genen (ISGs) 11, welke host antivirale activiteiten induceert, terwijl gastheer transcriptie onderdrukking waaronder IFN-beta-gen door NSS voorkomt dat het gen upregulations van die ISGs in reactie op virale replicatie, hoewel IRF-3, NF-kB en activator proteïne-1 (AP-1) kan geactiveerd worden door RVFV7. . Zo NSS is een uitstekend doelwit verder te verzwakken MP-12 en voor het hosten aangeboren immuunrespons te verhogen door het afschaffen van de IFN-beta onderdrukking functie. HierBeschrijven we een protocol voor het genereren van een recombinant MP-12 codering gemuteerde NSS, en geven een voorbeeld van een screening methode om NSS mutanten die niet over de functie om IFN-beta mRNA-synthese onderdrukken identificeren. In aanvulling op haar essentiële rol in de aangeboren immuniteit, type-I IFN is belangrijk voor de rijping van dendritische cellen en de inductie van een adaptieve immuunrespons 12-14. Zo NSS mutanten het induceren van type I IFN worden verder verzwakt, maar tegelijkertijd efficiënter zijn op het stimuleren gastheer immuunreacties dan wild-type MP-12, waardoor ze ideale kandidaten voor vaccinatie benaderingen.
Protocol
1. Herstel van de recombinant MP-12 codering NSS mutatie (s) van plasmide DNA's 2
- Spread baby hamster nier (BHK) / T7-9 cellen 15, die stabiel uitdrukken T7-RNA polymerase, in 6-cm gerechten in Minimum Essential Medium (MEM)-alpha (Invitrogen, Cat # 32561037) met 10% foetaal bovine serum (FBS ), penicilline-streptomycine (Penicilline: 100 U / ml, streptomycine: 100 ug / ml) (Invitrogen, Cat # 15140122), en 600 pg / ml hygromycine B (Cellgro, Cat # 30-240-CR).
* De efficiëntie van virale herstel is hoger in 6 cm schalen dan in 35-mm gerechten. BHK/T7-9 cellen met een lage passage level support hogere tarieven van herstel. U kunt ook andere BHK cellijnen die stabiel uitdrukken T7 RNA polymerase kunnen worden gebruikt 4,5,16,17. - Wanneer de cellen hebben 70-80% confluentie bereikt, vervangt u de kweeksupernatant met verse MEM-alpha met 10% FBS en penicilline-streptomycine (zonder hygromycine B).
* Cellen moeten worden transfected binnen 1 uur na het vervangen van het medium om het verlies van de T7 RNA polymerase uitdrukking te voorkomen. - Voor het herstel van RVFV, een set van plasmiden die coderen voor virale genoom RNA's voor full-length viraal RNA expressie, en een tweede set encoding virale gen open reading frames voor virale eiwit expressie (figuren 1 en 2) zijn verplicht. Bereid een mengsel van de volgende plasmids2 (figuur 2) in een 1,5 ml tube:
- pProT7-S (+) met de mutatie (s) in de NSS-gen (2 mg): Dit plasmide codeert voor het anti-virale-sense (positieve-sense) full-length RVFV MP-12 S-segment geflankeerd door de T7 promotor en het hepatitis delta virus (HDV) ribozyme volgorde.
- pProT7-M (+) (2 mg): Dit plasmide codeert voor het anti-virale-sense (positieve-sense) full-length RVFV MP-12 M-segment geflankeerd door de T7 promoter en de HDV ribozyme volgorde.
- pProT7-L (+) (2 mg): Dit plasmide codeert voor anti-virale-sense (positieve-sense) full-length RVFV MP-12 L-segment flanked door de T7-promotor en de HDV ribozyme volgorde.
- PT7-IRES-vn (2 mg): Dit plasmide codeert voor het RVFV MP-12 N open reading frame (ORF) stroomafwaarts van de T7-promotor en een encephalomycarditis virus (EMCV) interne ribosoom entry site (IRES).
- PT7-IRES-vL (1 mg): Dit plasmide codeert voor het RVFV MP-12 L ORF stroomafwaarts van de T7-promotor en een EMCV IRES.
- pCAGGS-vG (1 mg): Dit plasmide codeert voor RVFV MP-12 M ORF stroomafwaarts van de kip beta-actine-promotor.
* De toevoeging van PT7-IRES-VN, PT7-IRES-VL en pCAGGS-VG is niet essentieel voor het herstel van de MP-12, maar het verhoogt de efficiëntie van rescue 2. Auteurs ervaren een slechte uiting van Gn / Gc door gebruik te maken PT7-IRES plasmide, waarschijnlijk te wijten aan het ontbreken van een lekkende scannen van Augsburg door ribosomen. Daarom hebben we gebouwd pCAGGS-VG voor cap-afhankelijke Gn / Gc expressie.
- Voeg 30 ml van de Transit-LT1 (Mirus, Cat # MIR2300) tot 385 ml van de Opti-MEM (Invitrogen, Cat # 31985070) in een 1,5 ml tube, en vortex kort.
- Na 5 minuten incubatie bij kamertemperatuur, voeg langzaam de Opti-MEM bevattende liposomen om het plasmide mengsel van stap tot 1,3, meng door pipetteren en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Voeg het mengsel van liposoom en plasmiden aan het kweekmedium van de BHK/T7-9 cellen uit stap 1.2 druppelsgewijs (figuur 3).
- Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 ° C in een incubator met 5% CO 2 gedurende 24 uur, en vervang de kweeksupernatant met verse MEM-alpha met 10% FBS en penicilline-streptomycine (zonder hygromycine B).
- Incubeer de cellen bij 37 ° C in een incubator met 5% CO 2 voor 4 extra dagen (incubeer gedurende 5 dagen in totaal), en verzamel de kweeksupernatanten in een 15 ml buis.
* Het cytopathische effect (CPE) waargenomen hier niet noodzakelijk overeen met het resultaat van succesvolle virale herstel, omdat de transfectieinduceert celdood die verschijnt vergelijkbaar is met CPE wordt veroorzaakt door virale RNA replicatie of virale eiwitsynthese. - Centrifugeer de supernatants bij 2200 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
* Het doel van deze stap is om pellet beneden de cellulaire puin van virale voorraad. Een aerosol-tight centrifuge bak is aan te bevelen voor extra veiligheid. - Breng de bovenstaande vloeistoffen in de schroefdop 5 ml cryotubes, en bewaar de passage 0 (P0) virus voorraad bij -80 ° C voor verder gebruik.
2. Versterking van P0 virus
- De P0 monsters bevatten vaak onvoldoende virale titer voor de downstream-experimenten 2. Een amplificatie stap in VeroE6 cellen, die is een kloon van de Afrikaanse groene aap nier (Vero) cellen ontbreekt het IFN-alpha/beta genen 18,19, verhoogt de virale titer tot maximaal niveau. U kunt ook andere cellen ontbreekt het type-I IFN reacties zoals Hec1B cellen 20 of MEF-cellen van IFNAR1-knock-out muizen 21 might worden gebruikt voor deze stap. Verspreid VeroE6 cellen in 10 cm schalen in gewijzigde minimum Dulbecco's essentieel medium (DMEM) (Invitrogen, Cat # 11965092) bevattende 10% FBS, penicilline-streptomycine (Penicilline: 100 U / ml, streptomycine: 100 mg / ml), en incubeer bij 37 ° C in een incubator met 5% CO 2 tot het bereiken van 80% confluentie.
* Recombinant MP-12-stammen-codering mutant NSS vaak niet om efficiënt te repliceren in het type-I IFN-competente cellen. - Meng 300 ml van P0 monsters met 2,7 ml DMEM met 10% FBS en penicilline-streptomycine. Verwijder kweekmedium uit de VeroE6 cellen van stap 2.1 en vervangen door de verdunde P0 monster. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een incubator met 5% CO 2.
- Verwijder de inocula en voeg 10 ml DMEM met 10% FBS en penicilline-streptomycine bij elk gerecht.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 tot 4 dagen tot de CPE van VeroE6 cellen blijkt.
* Verstoring van de monolaag zich voordoet tijdens MP-12 infectie, while recombinant MP-12 ontbreekt NSS, zoals RMP12-C13type (C13type) (Figuur 4), niet verstoort de monolaag, maar een aantal van de dode drijvende cellen blijken 2 tot 3 dagen na infectie. - Oogst de supernatant op 3 tot 4 dpi, zoals beschreven in paragraaf 1.9) en 1,10), en wijzen de monsters als E6P1.
3. Titratie van recombinant MP-12 door plaque assay
- Verspreid VeroE6 cellen in 6-well platen.
* Analyse in duplo per monster is betrouwbaarder dan enkele analyse. - Wanneer VeroE6 cellen zijn gegroeid tot 80% confluentie, bereiden 10-voudige seriële verdunningen van het virus monsters in DMEM met 10% FBS en penicilline-streptomycine up tot 10-6 als volgt:
- 10 ul van E6P1 monster + 990 ml DMEM met 10% FBS en penicilline-streptomycine (10 -2 verdunning)
- 100 pi van 10 -2 monster + 900 ml DMEM met 10% FBS en penicilline-streptomycine (10 -3 verdunning)
- 100ul van 10 -3 monster + 900 ml DMEM met 10% FBS en penicilline-streptomycine (10 -4 verdunning)
- 100 pi van 10 -4 monster + 900 ml DMEM met 10% FBS en penicilline-streptomycine (10-5 verdunning)
- Aspireren medium uit de 6-wells plaat uit stap 3.1 en voeg 400 ul van elke verdunning (uit stap 3.2) in de putten (figuur 3).
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een incubator met 5% CO 2.
- Tijdens de incubatie, bereiden twee 15 ml buizen voor de agar-overlay is als volgt:
Tube A (te houden in 42 ° C water bad): 7 ml van 1,2% edele agar (VWR, Cat # 101170 tot 362) in water
Tube B (te houden in 37 ° C water bad): 7 ml van Modified Eagle Medium (MEM 2x) (Invitrogen, Cat # 11935046) bevattende 10% FBS, penicilline-streptomycine (Penicilline: 100 U / ml, streptomycine: 100 ug / ml), en 10% Tryptose fosfaat bouillon (MP Biomedicals, Cat # 1682149). - Na 1 uur incubatie, verwijder de viraleinocula, en voeg onmiddellijk 2 ml per putje van een 1:1 mengsel van buis A en buis B (vanaf stap 3.5).
* Zorg ervoor dat de overlay direct toe te voegen als opdrogen van de bronnen de dood van niet-geïnfecteerde cellen. - Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 3 dagen in een incubator met 5% CO 2.
- Bereid buis A en buis B weer zoals beschreven in stap 3.5. Bereid ook de 500 pi van 0,33% neutraal rood oplossing (Sigma Aldrich, Cat # N2889-100 ml) per plaat, die ook wordt bewaard bij 37 ° C waterbad.
- Mix buis A, B en tube 500 ml (laatste conc. 0,011%) van neutraal rood oplossing en voeg 2 ml van het mengsel per putje.
* Het bedrag van de neutraal rood oplossing die moet worden toegevoegd verschilt per het lot van de neutraal rood oplossing, en de eerste optimalisatie is vereist. Langdurige opslag van 0,33% neutraal rood oplossing veroorzaakt neerslag. In dergelijke gevallen kan het neerslag volledig worden opgelost door incubatie bij 55 ° C gedurende 10 minuten gevolgd door heftig schudden. Het gebruik van neergeslagen neutrale red oplossing resulteert in zwakke kleuring van cellen, terwijl opnieuw opgelost neutraal rood oplossing vlekken cellen goed. - Incubeer de plaat gedurende 16 uur (of 's nachts) bij 37 ° C in een incubator met 5% CO 2.
- Tel het aantal plaques in de put, die 10 tot 100 plaques per putje bevat. Bereken het aantal plaque vormende eenheden / ml. Bijvoorbeeld, als we zien 28 plaques in de putjes geïnoculeerd met de 10 -5 verdunningen, 28 (# van plaques) x (1 ml/0.4 ml) x 10 5 (verdunning) = 7,0 x 10 6 plaque-vormende eenheden (pfu) / ml (figuur 5).
4. Screening van NSS mutanten zonder de type-I IFN onderdrukking functie
- Spread C57/WT MEF-cellen (InvivoGen, Cat # MEF-c57wt), die een afgescheiden embryonale alkalische fosfatase (SEAP) gen induceerbaar door NF-kB en IRF-3 / 7 (Figuur 6) coderen, in 12-well platen. De cellen worden onderhouden in DMEM met 10% FBS, penicilline-streptomycine (PeniciLLIN: 100 U / ml, streptomycine: 100 ug / ml), blasticidine S (3 mg / ml), en Zeocin (100 ug / ml).
- Wanneer de cellen worden sub-confluerende (80%), de cellen zijn mock-besmet of geïnfecteerd met MP-12 of recombinante MP-12 codering nss mutaties op multipliciteit van infectie (moi) van 3 of 0,1 (zie paragrafen 2 en 3, het bedrag van elk inoculum moet 300 ul worden). Op een uur na de infectie, verwijder de inocula, en voeg 1 ml per putje van DMEM met 10% FBS, penicilline-streptomycine (Penicilline: 100 U / ml, streptomycine: 100 ug / ml) (blasticidine en Zeocin worden niet toegevoegd aan deze tijd).
- Op 14 uur na infectie, het verzamelen van kweeksupernatanten. Voeg 200 ul van hoeveelheden Blue (InvivoGen, Cat # vertegen-QB1) en 50 pi van elk monster (in drievoud) in de putjes van een 96-wells plaat. Seal en de plaat bij 37 ° C incuberen gedurende 1 uur
* Zowel de MP-12 en recombinant MP-12 ontbreekt nss duidelijk te induceren gastheer translationele onderdrukking in IFN-alpha/beta competente cellen met 293 cellen, MRC-5 cellen en muis embryonic fibroblast (MEF)-cellen na 14 uur na infectie bij hoge moi. Aan de andere kant, IFN-beta mRNA of mRNA ISG56 accumuleert in overvloed op 7 tot 8 uur na infectie in type-I IFN competente cellen. Dus kozen we voor 14 uur na infectie van de bovenstaande vloeistoffen te verzamelen om de accumulatie van SEAP veroorzaakt door aangeboren immuunrespons te zien. - Lees de OD-waarden bij 650 nm met behulp van een plaat lezer (figuur 7).
* De resultaten zijn in overeenstemming met de gegevens die zijn verkregen door Northern blot met behulp van een RNA-probe specifiek is voor de muis ISG56 mRNA, waaruit blijkt up-regulatie van ISG56 mRNA in de afwezigheid van NSS expressie (figuur 8).
* Er moet worden opgemerkt dat de SEAP activiteit wordt bepaald door de overvloed van eiwitten die kunnen worden beïnvloed door de gastheer vertaling activiteit. Een relatieve niveau van SEAP misschien niet hoog zijn in vergelijking met het verhoogde niveau van mRNA, omdat SEAP niet kan worden gesynthetiseerd, zelfs in de aanwezigheid van SEAP mRNA als cellulaire vertaling supprEssed. Northern blot is een eenvoudiger test en een meer accurate manier om de hoeveelheid mRNA veroorzaakt door het ontbreken van NSS functies in geïnfecteerde cellen dan de SEAP reporter test te evalueren. Echter, de SEAP reporter systeem is sneller dan de Northern blot en dus handig voor een snelle screening van NSS mutanten potentieel ontbreekt gastheer transcriptie onderdrukking functie.
5. Representatieve resultaten:
De reverse genetics systeem consequent gegenereerd levensvatbaar recombinant MP-12 virussen met titers hoger dan 1 x 10 6 PFU / ml. C13type virus ontbreekt NSS functies gevormd grote troebel plaques, terwijl de MP-12 gevormd heldere plaques van verschillende grootte, twee (figuur 5). Mock-geïnfecteerde C57/WT MEF cellen of die besmet zijn met MP-12 niet het niveau van de SEAP in kweeksupernatant in vergelijking met mock-geïnfecteerde cellen, terwijl de kweeksupernatant van C57/WT MEF cellen die geïnfecteerd zijn met C13type bevatte een verhoogdniveau van SEAP met 14 uur na infectie (HPI) (figuur 7). Deze resultaten zijn consistent met die verkregen door Northern blot met behulp van een RNA-probe specifiek is voor de muis ISG56 mRNA (figuur 8).
Figuur 1. Genome structuur van RVFV
RVFV heeft een tripartiete negatieve-sense of ambisense RNA genoom genaamd S-, M-en L-segment. S-segment codeert N en NSS genen in een ambisense manier. N-mRNA wordt gesynthetiseerd uit virale-sense (negatieve zin) S-segment, terwijl de NSS mRNA wordt gesynthetiseerd uit anti-virale-sense (positieve-sense) S-segment. M-segment codeert voor een M-mRNA en synthetiseert the78kD, NSM, Gn of Gc eiwitten door lekkende scannen van meerdere Augsburg op 5'region van M mRNA, gevolgd door hun co-translationele decollete 22,23. L-segment codeert voor het L-eiwit. Zowel de N-en L-eiwitten zijn essentieel voor virale transcriptie en replicatie, terwijl Gn en Gc zijn de virale envelop-eiwitten. NSS en NSm eiwitten zijn niet-structurele eiwitten, die niet zijn opgenomen in virusdeeltjes.
Figuur 2.. Ontwerp van plasmide DNA voor het herstel van recombinant RVFV MP-12 stam
Het cDNA dat codeert voor full-length anti-virale-sense S-, M-of L-segment zijn cloneddownstream van T7-promoter en stroomopwaarts van het hepatitis delta virus (HDV) ribozym sequenties, aangeduid als pProT7-S (+), pProT7-M (+), of pProT7-L (+), respectievelijk 2. T7 RNA polymerase, uitgedrukt in BHK/T7-9 cellen transcribeert het RNA dat codeert voor full-length S-, M-of L-segment met een precieze genoom 3 'uiteinde. De open reading frame (ORF) van N of L-eiwitten zijn gekloond onder encephalomycarditis virus (EMCV) interne ribosoom entry site (IRES), die worden aangeduid als PT7-IRES-vn of PT7-IRES-VL, respectievelijk de niet-afgetopte toe T7 RNA-transcript erkend te worden door ribosomen in de cap-onafhankelijkdeuk manier. De M is gekloond ORF onder b kip-actine-promotor van pCAGGS plasmide 24, die is aangewezen als pCAGGS-vG, tot de synthese van 78kD, NSM, Gn en Gc eiwitten, die uit verschillende Augsburg gegenereerd door lekkende scannen 23 mogelijk te maken. Zowel de N-en L-eiwitten zijn nodig voor het starten transcriptie of RNA-replicatie, terwijl de PT7-IRES-vn en PT7-IRES-VL zijn niet essentieel voor het herstel van recombinant MP-12 2, waarschijnlijk te wijten aan de vermoedelijke lekkende uitdrukking van Pol- II-driven bedekte RNA-transcripten die coderen voor N-ORF en L-ORF van pProT7-S (+) en pProT7-L (+), respectievelijk.
Figuur 3. Terugwinning van RVFV MP-12 van plasmide DNA
Transfectie van cellen met BHK/T7-9 pProT7-S (+), pProT7-M (+), pProT7-L (+), PT7-IRES-VN, PT7-IRES-VL en pCAGGS-vG plasmiden (Fig.1 ) genereert infectieus recombinant RVFV MP-12 stam in kweeksupernatants. Het supernatant bij 5 dagen na transfectie wordt verzameld, en gepasseerd in de frisse Vero-cellen E6 voor virale versterking. Typisch, kan meer dan 1 x 10 6 pfu / ml van het virus worden hersteld op 3 tot 4 dagen na infectie. De versterkte virus (E6P1 virus) wordt getitreerd met behulp van plaque assay met Vero-cellen E6 en gebruikt voor fenotype-analyse en immunogeniciteit studies.
Figuur 4. S-segment van de MP-12 en RMP12-C13type
De vergelijking van de MP-12 en RMP12-C13type (C13type) S-segmenten. Vergeleken met nss van de MP-12 stam, is de NSS ORF van C13type ingekort met 69%, en is identiek aan dat van nature geïsoleerd kloon 13 stam 2,25.
Figuur 5. Plaque assay voor MP-12 (functionele NSS) en C13type (niet-functionele NSS)
De monolaag van Vero E6 cellen in een 6-wells plaat wordt gebruikt voor plaque assay. Na 3 dagen incubatie met 0,6% agar overlay, de tweede agar overlay met neutraal rood oplossing wordt toegevoegd. Vervolgens worden plaques geteld op dag 4 na infectie. MP-12 vormen heldere plaques van uiteenlopende maten, terwijl C13type vormen grote troebele plaques (of foci). De goed met 10 tot 100 plaques moet worden gebruikt voor het tellen.
Figuur 6. Activatie route van uitgescheiden alkalische fosfatase (SEAP) reportergen in C57/WT MEF cellen
Interferon beta-promotor omvat de bindende sequenties van de AP-1, NF-kB en IRF-3. RVFV replicatie activeert AP-1, NF-kB en IRF-3 7,11. Echter, NSS remmen de afgifte van repressor complex van de IFN-beta promotor, zelfs na de binding van deze transcriptiefactoren, waardoor het onderdrukken van de synthese van IFN-beta mRNA 26. Bovendien NSS sequesters TFIIH p44 subunits8 en eenlso bevordert de afbraak van TFIIH p62-subeenheden 27, dus het induceren van een algemene gastheer transcriptie onderdrukking waaronder IFN-alfa-gen en genen onder de ISRE promotor. C13type of andere NSS mutanten ontbreekt IFN-beta onderdrukking functie te induceren IFN-beta synthese, die op zijn beurt activeert de IFN-alfa promoter en de interferon-gevoelige respons element (ISRE) promotor. IRF-7 is dan transcriptioneel opgereguleerd door IFN-alpha/beta stimulatie en verdere opgereguleerd door IFN-alfa ter ondersteuning van de IRF-3 28,29. In deze test, C57/WT MEF cellen coderen uitgescheiden alkalische fosfatase (SEAP) aan de stroomafwaarts van een kunstmatige bindende sequentie van NF-kB, IRF-3 en IRF-7. Zo, de NSS mutanten ontbreekt IFN-beta onderdrukking functie upregulate SEAP wiens secretie wordt dan gemeten.
Figuur 7. Inductie van SEAP door C13type
C57/WT MEF cellen (InvivoGen) werden mock-Geïnfecteerde of geïnfecteerd met MP-12 of RMP12-C13type (C13type) op moi van drie (linker paneel) of 0,01 (rechter paneel). Kweeksupernatanten (50 ul) op 14 HPI werden gemengd met 200 pi van hoeveelheden Blue (InvivoGen) substraat in 96 wells plaat en de OD-waarden bij 650 nm werden gemeten na 1 uur incubatie bij 37 ° C door een plaat lezer. De relatieve toename van SEAP aan mock-geïnfecteerde cellen worden getoond. De gegevens representeren het gemiddelde + / - standaard deviatie van drie onafhankelijke experimenten. De cultuur supernatant van C13type-geïnfecteerde cellen blijkt te zijn toegenomen SEAP, suggereert het ontbreken van een gastheer transcriptie onderdrukking door NSS.
Figuur 8. Northern blot met DIG-gelabelde RNA-probe
Wild-type muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen werden mock-geïnfecteerd of besmet zijn met MP-12 of RMP12-C13type (C13type) op moi van 3. Totaal RNA werd verzameld op 7 hpi door gebruik te maken TRIzol (Invitrogen), en Noord-bVeel werd uitgevoerd door gebruik te maken digoxigenine-gelabelde RNA probe die specifiek zijn voor de muis endogeen ISG56 mRNA of MP-12 N mRNA / anti-virale-sense S-segment 2,30. Voor het maken van de probes voor muis endogeen ISG56 mRNA of mRNA RVFV N / anti-virale-sense S-segment, de PCR-fragmenten versterkt door de primer set van KpnmISG56F (GGG TGG TAC TCC CGC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG) en HindmISG56 (TAC AAA GCT TAT GGG AGA GAA TGC TGG TGA TGA CCA GG) voor ISG56 mRNA of KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA GCT TGC G) en HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT AAG TGT) voor RVFV N mRNA / anti-virale-sense S-segment werden gedigereerd met Kpn I en Hind III, en geligeerd in pSPT18 plasmide (Roche. Dan RNA probes gelabeld met digoxigenine werden gesynthetiseerd door gebruik te maken DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche, Cat # 1 175 025). Het 28S rRNA niveau van elk monster wordt ook getoond als het laden van controle. wild-type cellen die geïnfecteerd zijn met MEF C13type geïnduceerde ISG56 mRNA-synthese, terwijl die besmet zijn met MP-12 Induceerde geen hij, suggereert het ontbreken van een gastheer transcriptie onderdrukking in C13type-geïnfecteerde cellen. De gegevens worden in overeenstemming met die verkregen door het SEAP assay in figuur 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reverse genetics voor RVFV zijn ontwikkeld door verschillende groepen door gebruik te maken van T7-promotor 2,4,5 of muis 3 of 4 mensen pol-I promotor. In dit manuscript beschrijven we een protocol om recombinant RVFV MP-12-stammen te genereren door gebruik te maken BHK/T7-9 cellen 15 die stabiel uitdrukken T7 RNA-polymerase. De efficiëntie van virale herstel gevarieerd afhankelijk van de conditie van BHK/T7-9 cellen, de hoogte van plasmiden, het aantal getransfecteerde cellen en ga zo maar door. Wij hebben altijd versterken de P0 virus in Vero E6 cellen hoge titer virusvoorraden te krijgen voor experimenten. Type-I IFN-competente cellen, zoals menselijke long diploïde (MRC-5) cellen kunnen worden gebruikt voor virale amplificatie alleen als de NSS-functie een efficiënte virale replicatie wordt ondersteund door het remmen van antivirale activiteiten, waaronder het type-I IFN of PKR.
Een plaque assay is een zeer bruikbare methode voor het titreren van MP-12 en de NSS mutanten. Als algemene voorzorgsmaatregel voor deplaque assay, moeten cellen onmiddellijk te worden toegevoegd met overlay op de juiste temperatuur na het verwijderen van virale inocula. Kristalviolet kleuring is niet geschikt voor het detecteren van virussen C13type plaques, omdat C13type virus niet verstoort de monolaag van Vero-cellen E6 2. Aan de andere kant, kunnen neutrale rode vlekken met succes te detecteren plaques gevormd door C13type virus. De kracht van cellulaire kleuring met neutraal rood wordt bepaald door de relatieve opname van neutrale rode kleurstof in levende cellen. Zo is het waarschijnlijk dat C13type-geïnfecteerde cellen een verminderde metabolische activiteit die leidt tot een verminderde opname van neutrale rode kleurstof in vergelijking met die van niet-geïnfecteerde cellen, en welke vormen een zwakke kleuring focus. De benodigde hoeveelheid neutrale rood varieert met het lot van de neutraal rood oplossing. Langdurige opslag van neutraal rood oplossing genereert vaak neerslaat. Dit kan worden voorkomen door warmte-oplossen van de neutraal rood oplossing bij 55 ° C gedurende 10 min, maar hetinvloed op de kleuring van cellen.
Het is belangrijk om virussen te gebruiken met accurate virale titer in experimenten. De titer in een viral voorraad zou kunnen worden verminderd door de media met een pH van minder dan 6,5 31 die wordt aangegeven door gele kleur van fenol rood in de virale voorraad, langdurige opslag, herhaalde vries-dooi cycli en ga zo maar door. Zo is het belangrijk om verse virale voorraad te gebruiken voor vaccinatie van dieren of opnieuw titreren de voorraad vlak voor experiment.
RVFV coderen twee gekenmerkt niet-structurele eiwitten; NSS en NSM. De RVFV ontbreekt NSS is aanzienlijk verzwakt bij dieren 25,32, terwijl de RVFV ontbreekt NSm is nog steeds zeer virulent bij ratten 33. Zo NSS speelt een belangrijke rol als virulentie factor in de pathogenese. NSS is een multifunctioneel eiwit dat 1) onderdrukking van de gastheer algemene transcriptie 8, 2 induceert) onderdrukking van IFN-beta mRNA-synthese 26 en 3) degradatie van dsRNA-dependent proteïne kinase (PKR) 9,10. De ouderlijke MP-12 stam zou verder kunnen worden verzwakt door de invoering van truncatie of mutaties in de NSS. Aan de andere kant is het ook belangrijk om de immunogeniciteit van een dergelijke mutant MP-12. Type-I IFN speelt een rol bij de rijping van dendritische cellen, die belangrijk is voor de differentiatie van T-cellen en B-cellen 12-14. Verschillende NSS mutanten ontbreekt IFN-beta onderdrukking functie, die geheel of gedeeltelijk NSS in stand te houden, zijn nuttig om de impact van de NSS-gemedieerde IFN-beta onderdrukking functie te analyseren op de immunogeniciteit en de veiligheid van het vaccin kandidaten. Het is bekend dat cellen die besmet zijn met RVFV gew ZH548 stam te activeren NF-kB, IRF-3, en AP-1 (Figuur 6), terwijl de IFN-beta mRNA-synthese wordt onderdrukt door NSS op transcriptionele niveau 7. Zo, MP-12, die volledig functionele NSS 3 drukt, remt de synthese van NF-kB/IRF-3/7-inducible SEAP reportergen mRNA op transcriptional niveau, terwijl recombinant MP-12 ontbreekt nss functies, zoals C13type kon bewegen van de SEAP mRNA-synthese (Figuur 7). Om goed te begrijpen het resultaat van de immunogeniciteit van dergelijke mutanten, moet de fenotypes verder worden gekarakteriseerd in celcultuur systeem. Bijvoorbeeld, moet de virale replicatie kinetiek worden getest in type-I IFN competente cellen, zoals menselijke long diploïde MRC-5 cellen of muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen. De PKR degradatie functie kan worden getest door Western blot met antilichamen die specifiek zijn voor mens of muis PKR. IFN-beta mRNA inductie door NSS mutatie moet worden bevestigd door Northern blot met digoxigenine-gelabelde RNA probe die specifiek zijn voor mens of muis IFN-beta mRNA. Host algemene transcriptie onderdrukking kan worden getest door het analyseren van de opname van een analoge uridine in wording mRNA. Uiteindelijk moet de immunogeniciteit en de veiligheid van de kandidaat-MP-12 nss mutanten worden getest bij muizen. Typisch, 1 x 10 5 PFU van de candidate vaccin verdund in PBS wordt subcutaan en sera verzameld van de retro-orbitale sinus op dag 30 (of 42) en dag 180 worden getest op de aanwezigheid van neutraliserende antistoffen door plaque reductie neutraliseren test (PRNT 80) en de totale IgG tegen RVFV N en Gn / Gc door IgG ELISA gecoat met gezuiverde recombinante virale eiwitten. De werkzaamheid van kandidaat-vaccins kunnen worden getest door uitdagend muizen op 42 dagen na immunisatie met wild-type ZH501 (bv, ip, 1 x 10 3 pfu) op dier bioveiligheidsniveau (BSL) 4 faciliteit of verbeterde BSL3 +-faciliteit in de VS Het omgekeerde genetica aanpak is een krachtig hulpmiddel voor het ontwerpen en het genereren van een veilig en immunogeen levend-verzwakt RVFV vaccins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Grant Nummer 5 U54 AI057156-07 door de Western Regional Center of Excellence (WRCE), een R01 AI08764301-A1 van Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, en een interne financiering van Sealy Center for Vaccine Development aan de Universiteit van Texas Medical Branch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR international | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma-Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | Invitrogen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | Invitrogen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | Invitrogen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
