Summary
裂谷热病毒的MP - 12疫苗株反向遗传学系统是一个有用的工具，用于创建附加的MP - 12突变体具有更高的衰减性和免疫原性。我们描述了协议的产生和表征NSS突变株。
Abstract
裂谷热病毒（RVFV），从而导致出血热，神经系统疾病，或在人类中的盲目性，以及高利率流产和反刍动物的胎儿畸形1，已被列为作为HHS /美国农业部重叠选择代理和风险组3病原体。它属于在家庭Bunyaviridae属Phlebovirus，是这个家庭的最致命的成员之一。自2006年以来已开发的RVFV MP - 12疫苗株2,3以及野生型RVFV 4-6株，包括ZH548和ZH501，几个反向遗传学系统。 MP - 12株（这是一个危险群2病原体和非选择代理）是由几个突变，其M -和L段高度减毒，但仍带有剧毒分部的S - 3，其编码的RNA功能的毒力因素，NSS。 rMP12 C13type（C13type）进行帧删除NSS的ORF 69％缺乏所有已知的NSS功能，而它复制为efficient作为MP - 12在VeroE6细胞缺乏I型干扰素。 NSS包括干扰素（IFN）-βmRNA的7,8诱导的转录主机关闭，并促进在翻译后水平降解双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR）9,10 IFN -β转录干扰素调节因子3（IRF - 3），NF - kB和激活蛋白-1（AP - 1），IFN -β结合IFN-alpha/beta受体（IFNAR）上调刺激IFN -α的转录虽然IRF - 3，NF - kB和激活的基因或其他干扰素刺激基因（ISGs）11，诱导宿主的抗病毒活性，而主机包括NSS IFN -β基因的转录抑制阻止病毒复制的基因upregulations这些ISGs蛋白1（AP - 1），可以通过RVFV7激活。 。因此，NSS是一个很好的的目标，以进一步削弱MP - 12，并取消IFN -β的抑制功能，以提高主机的先天免疫反应。这里，我们描述了产生重组MP - 12的编码突变NSS的协议，并提供一种检查方法，找出缺乏的功能，抑制IFN -βmRNA的合成NSS突变体的一个例子。除了 其在先天免疫系统的重要作用，I型干扰素是重要的树突状细胞诱导适应性免疫反应 12-14的成熟。因此，NSS突变体诱导I型干扰素的进一步减弱，但在同一时间在刺激宿主的免疫反应更有效率比野生型MP - 12，这使得它们接种疫苗的方法理想人选。
Protocol
1。 2质粒DNA的重组的MP - 12编码NSS突变（S）的回收
- 传播幼仓鼠肾（BHK）/ T7 - 15 9细胞，稳定表达T7 RNA聚合酶，到6厘米的菜最起码的基本介质中（MEM）-α（Invitrogen公司，CAT＃32561037），含10％胎牛血清（ FBS ），青霉素，链霉素（青霉素100 U /毫升，链霉素100微克/毫升）（Invitrogen公司，CAT＃15140122），和600微克/ ml的潮霉素B（Cellgro，猫＃30 - 240 - CR）。
*病毒回收效率在6厘米的菜高出35 mm培养皿中。 BHK/T7-9细胞，通过水平低的支持率较高的恢复。另外，其他的BHK细胞株稳定表达T7 RNA聚合酶可以使用4,5,16,17。 - 当细胞达到70％-80％汇合，更换培养上清用新鲜的含10％胎牛血清和青霉素，链霉素（不含有潮霉素B）的MEM -α。
*细胞应该是transfected内1小时后更换介质，以避免损失的T7 RNA聚合酶表达。 - 对于RVFV，编码病毒基因组RNA的全长的病毒RNA表达质粒，恢复和病毒基因的开放阅读框，编码病毒蛋白表达（ 图1和2）第二组是必需的。准备在1.5毫升管以下plasmids2（ 图2）的混合物：
- pProT7 - S与NSS基因突变（2毫克）（S）（+）：这种质粒编码的抗病毒感（正面意义）全长RVFV MP - 12的S段两侧由T7启动子和丁型肝炎病毒（HDV）核酶序列。
- pProT7 - M（+）（2毫克）：这种质粒编码的抗病毒感（积极意义）全长RVFV MP - 12米段两侧由T7启动子和HDV核酶序列。
- pProT7 - L（+）（2毫克）：这种质粒编码的抗病毒感（积极的意义上）全长RVFV MP - 12 L型段FLAnked由T7启动子和HDV核酶序列。
- PT7 - IRES - VN（2毫克）：这种质粒编码的RVFV MP - 12 N打开阅读框（ORF），T7启动子和脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES）的下游。
- PT7 - IRES - VL（1毫克）：这种质粒编码的RVFV MP - 12大号的ORF下游的T7启动子和EMCV IRES的。
- pCAGGS - VG（1毫克）：这种质粒编码RVFV MP - 12的M ORF的鸡β-肌动蛋白启动子的下游。
PT7 - IRES - VN，PT7 - IRES - VL和pCAGGS - VG此外没有恢复MP - 12所必需的，但它增强了救援效率2。作者通过PT7 - IRES质粒，可能是由于缺乏核糖体AUGs漏水扫描经历GN / GC不善表达。因此，我们构建了第依赖GN / GC表达pCAGGS - VG。
- 添加30毫升过境LT1（Mirus，CAT＃MIR2300）385毫升OPTI - MEM（InvitrogeN，CAT＃31985070）在1.5 ml管，涡简要。
- 在室温下5分钟孵化后，慢慢加入OPTI - MEM包含从步骤1.3脂质体的质粒混合，混合轻轻吹打，并培育在室温为15分钟。
- 步骤1.2一滴一滴地（ 图3）BHK/T7-9细胞的培养基中添加脂质体和质粒混合物。
- 在孵化器孵育转染细胞在37 ° C，5％CO 2 24小时，并更换培养上清新鲜MEM -α含10％胎牛血清和青霉素，链霉素（不含有潮霉素B ）。
- 细胞在37 °的孵化器中的C与5％CO 2为4天（共5天孵化），并收集到15毫升管培养上清液。
*这里观察细胞病变效应（CPE），并不一定反映病毒成功复苏的结果，因为转诱导细胞死亡，出现类似病毒RNA复制或病毒蛋白的合成引起的CPE。 - 在4 ° C 5分钟，在2200 XG离心的上清液。
*这一步的目的是沉淀下来的细胞碎片病毒股票。气溶胶紧离心桶建议以提高安全性。 - 转移到螺丝帽的5毫升cryotubes的上清液，存储通道0（P0），于-80 ° C为进一步利用病毒的股票。
2。扩增病毒的P0
- 在P0样品往往含有病毒滴度不足2下游实验。在VeroE6细胞扩增步骤，这是一个克隆的非洲绿猴肾细胞（VERO）缺乏IFN-alpha/beta基因18,19，增加病毒滴度最高水平。另外，其他细胞缺乏IFNAR1敲除小鼠21 migh如20 Hec1B细胞或MEF细胞类型，我干扰素反应T是用于这一步。蔓延到贝科的修改最低必不可少的培养基（DMEM）（Invitrogen公司，CAT＃11965092）10厘米含10％胎牛血清菜VeroE6细胞，青霉素，链霉素（青霉素：100单位/毫升，链霉素：100毫克/毫升），和孵化在37 ° C孵化器与5％的CO 2，直到他们达到80％汇合。
*重组MP - 12菌株编码突变NSS往往不能有效的I型干扰素主管细胞复制。 - 2.7毫升10％胎牛血清和青霉素链霉素的DMEM混合300毫升的P0样本。删除步骤2.1 VeroE6细胞培养基和稀释P0样品更换。在37 ° C的一个孵化1小时，5％CO2孵育。
- 取出接种10毫升的DMEM添加10％胎牛血清和青霉素链霉素每道菜。
- 在37 ° C孵育3〜4天，直到VeroE6细胞CPE明显。
*单层中断期间发生的MP - 12感染，whilË重组MP - 12缺乏NSS如rMP12 C13type（C13type）（ 图4），不破坏单 层，但浮动细胞死亡人数出现在感染后2至3天。 - 收获上清，在3至4 DPI节1.9）和1.10所述），并指定为E6P1样品。
3。滴定斑块检测重组MP - 12
- VeroE6细胞扩散到6孔板。
*每个样品的重复分析比单个分析更可靠。 - 当VeroE6细胞生长至80％汇合，准备与10％FBS和10-6青霉素链霉素的DMEM 10倍系列稀释的病毒样本如下：
- 10μL的样品E6P1 + 990毫升，用10％胎牛血清和青霉素链霉素的DMEM（10-2稀释）
- 10 -2样品100μL+ 900毫升的DMEM与10％胎牛血清和青霉素，链霉素（10 -3稀释）
- 100μL的10 -3样品+ 900毫升的DMEM与10％胎牛血清和青霉素，链霉素（10 -4稀释）
- 10-4样本100μL+ 900毫升与10％胎牛血清和青霉素链霉素的DMEM（10-5稀释）
- 吸步骤3.1 6孔板中并添加每个稀释液（步骤3.2），400入井（ 图3） 。
- 在37 ° C的一个孵化1小时，5％CO2孵育。
- 在潜伏期，准备如下的琼脂覆盖两个15毫升管：
管（保持在42℃水浴）：7毫升1.2％的崇高琼脂水（VWR，猫＃101170-362）
管B（保持在37℃水浴）：7毫升改良Eagle培养基（MEM 2X）（Invitrogen公司，CAT＃11935046），含10％胎牛血清，青霉素，链霉素（青霉素100 U /毫升，链霉素100微克/毫升），和10％Tryptose磷酸盐肉汤（MP生物医学，CAT＃1682149）。 - 孵育1 h后，删除病毒接种，并立即加入2毫升，每口井的管和管B（步骤3.5）1:1混合。
*小心添加覆盖，立即干燥井导致未受感染的细胞死亡。 - 板块与5％的CO 2孵育3天的孵化器在37 ° C。
- 准备管和管B再次在步骤3.5中所述。还准备500微升0.33％中性红的解决方案，每盘这也是保持在37℃水浴（西格玛Aldrich公司，CAT＃N2889 - 100ML）。
- 混合管，管B和中性红溶液500毫升（终浓度为0.011％），加2毫升每口井的混合物。
*要添加的中性红溶液的量的变化很多中性红溶液，是必需的初步优化。 0.33％中性红溶液长期储存会导致沉淀。在这种情况下，可完全溶解沉淀，孵育在55 ° C为10分钟剧烈摇晃。使用沉淀中性ř弱阳性细胞ED解决方案的结果，而重新溶解中性红溶液污渍细胞以及。 - 板孵育16小时（或过夜）37 ° C的一个孵化器5％的CO 2。
- 统计斑块的数量，以及其中包含的10％到100％以及斑块。计算斑块的形成单位/ ml。例如，如果我们观察接种10-5稀释，28（＃斑块）×（1 ml/0.4毫升）× 10 5（稀释）= 7.0 × 10 6斑形成单位（PFU）的井28斑块/毫升（ 图5）。
4。 NSS突变体的筛选缺乏I型干扰素抑制功能
- 传播C57/WT MEF细胞（InvivoGen，CAT＃MEF - c57wt），编码一种分泌胚胎碱性磷酸酶（SEAP）基因诱导的NF - kB和IRF - 3 / 7（ 图6），到12孔板。 DMEM培养细胞均保持在10％胎牛血清，青霉素，链霉素（Penicillin：100单位/毫升，链霉素100微克/毫升），稻瘟素S（3毫克/毫升），和Zeocin（100微克/毫升）。
- 当细胞成为融合（80％），细胞模拟感染或感染与MP - 12或重组MP - 12编码的多重感染（MOI）3或0.1（见第2和第3，金额NSS突变每接种300μL）。在感染后1小时，取出接种，并添加1毫升含10％胎牛血清，青霉素，链霉素（青霉素100 U /毫升，链霉素100微克/毫升）每口井的DMEM（稻瘟素和Zeocin不添加在这个时间）。
- 在感染后14小时，收集培养上清。添加200μL定量蓝（InvivoGen，猫＃REP - QB1），每个样品50μL（一式三份），一个96孔板井。密封板在37 ° C孵育1小时
* MP - 12和重组的MP - 12缺乏NSS清楚地诱导主机包括293细胞，MRC - 5细胞和鼠标embr IFN-alpha/beta胜任细胞的翻译抑制yonic成纤维细胞（MEF）的14个小时后，在高MOI感染后的细胞。另一方面，IFN -βmRNA或ISG56 mRNA的大量积累在7至8小时后感染的类型，我干扰素胜任细胞。因此，我们选择了感染14小时后收集上清，看到的先天免疫反应诱导SEAP的积累。 - 阅读使用酶标仪（ 图7）在650 nm处的OD值。
*北使用特定的鼠标ISG56基因ISG56 NSS表达的情况下（ 图 8）的mRNA的上调，这表明RNA探针的杂交获得的数据相一致的结果。
应该指出，SEAP的活动是由丰富的蛋白质可以通过主机翻译活动的影响。的mRNA水平的提高相比，一个SEAP的相对水平可能不高，因为SEAP不能SEAP基因的存在，即使在合成细胞翻译suppressed。 Northern杂交是一种更直接的检测和更准确地评估在感染的细胞比SEAP报告基因检测NSS功能的缺乏引起的mRNA量。然而，SEAP报告系统比Northern杂交更迅速，因此NSS可能缺乏主机转录抑制功能的突变体的快速筛选有用。
5。代表性的成果：
反向遗传学系统不断生成可行的重组MP - 12病毒滴度大于1 × 10 6 PFU / ml的高。 C13type病毒缺乏NSS的功能形成了大量的混浊斑，而MP - 12明确斑块形成各种大小的2（图5）。模拟感染C57/WT MEF细胞或MP - 12的感染者并没有增加SEAP的水平相比，模拟病毒感染的细胞培养上清，而与C13type C57/WT MEF的感染细胞的培养上清中增加SEAP的水平，14小时后感染（HPI）（图7）。这些结果与北使用特定的鼠标ISG56 mRNA表达（图8）RNA探针的杂交获得的一致。
图1。RVFV的基因组结构
RVFV有三方负感或ambisense RNA基因组命名为S，M -和L -段。分部的S - N和NSS基因编码ambisense方式。从病毒感（负义）段的S - ñ mRNA的合成，而mRNA是合成抗病毒感（积极意义）分部的S - NSS。分部的M -编码一个M mRNA和合成5'region他们合作翻译裂解22,23 M的mRNA的几个AUGs漏水扫描the78kD，NSM，GN或GC蛋白。分部L - L蛋白编码。 N和L蛋白是病毒的转录和复制所必需的，而Gn和GC病毒包膜蛋白。 NSS和NSM蛋白非结构蛋白，这是不纳入到病毒颗粒。
图2。质粒DNA重组RVFV MP - 12菌株的恢复设计
全长cDNA的反病毒检测的S，M或L段cloneddownstream T7启动子和丁型肝炎病毒（HDV）上游核酶序列，指定为pProT7 - S（+），pProT7 - M （+）或pProT7 - L（+）分别为2。 BHK/T7-9细胞中表达T7 RNA聚合酶转录的RNA编码全长S，M，或精确的基因组3'末端L型部分。 N或L蛋白的开放阅读框（ORF）克隆脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES），这是PT7 - IRES - VN或PT7 - IRES - VL，分别指定，允许不封顶T7 RNA转录在限额，独立的核糖体被认可凹痕的方式。的M的ORF克隆下鸡β-肌动蛋白pCAGGS质粒24，这是pCAGGS - VG指定的推动者，让78kD的合成，NSM，Gn和GC蛋白，这是从不同AUGs产生漏水扫描23。 N和L蛋白启动转录或RNA的复制，而PT7 - IRES - VN和PT7 - IRES - VL没有必要重组的MP - 12 2的恢复，可能是由于presumable的渗漏表达POL二，驱动皑皑的RNA转录编码的N - ORF和L - ORF的pProT7 - S（+）和pProT7 - L（+），分别。
图3 RVFV MP - 12质粒DNA的回收 。
pProT7 - S（+），pProT7 - M（+）pProT7 - L（+），PT7 - IRES - VN，PT7 - IRES - VL和pCAGGS - VG质粒（图BHK/T7-9细胞转染）生成传染性重组RVFV MP - 12培养上清中的应变第在5天的后转上清收集，到新鲜VERO E6细胞病毒扩增传代。通常情况下，超过1 × 10 6 PFU / ml的病毒在感染后3〜4天可以恢复。扩增的病毒（E6P1病毒）滴定使用Vero E6细胞斑块检测和表型分析和免疫原性研究。
图4段的S - MP - 12和rMP12 - C13type
MP - 12的比较和rMP12 C13type（C13type）的S -段。 C13type NSS的ORF与MP - 12菌株NSS相比，被截断了69％，是相同的自然隔离克隆13 株 2,25 。
图5牌匾MP - 12（功能NSS）和C13type（非功能NSS）检测。
单层的Vero Ë6细胞在6孔板是用于检测斑块。经过3天用0.6％的琼脂覆盖，第二琼脂覆盖含有中性红溶液孵化的是。然后，感染后第4天计算斑块。 MP - 12的形式明确不同大小的斑块，而C13type形式大混浊斑块（或灶）。以及10至100斑块应用于计数。
图6的分泌型碱性磷酸酶（SEAP）记者在C57/WT MEF细胞的基因激活途径
干扰素-β启动子包括AP - 1，NF - kB和IRF - 3的结合序列。 RVFV复制激活AP - 1，NF - kB和IRF - 3 7,11。然而，抑制IFN -β启动NSS释放阻遏复杂，即使在这些转录因子的结合，从而抑制IFN -βmRNA的26的合成。此外，NSS隔绝TFIIH P44 subunits8和LSO促进TFIIH P62亚基27的降解，从而诱导普通主机的转录抑制，包括IFN -α基因和基因ISRE子下。 IFN -β的抑制功能的C13type或其他缺乏NSS突变体诱导IFN -β的合成，这反过来又激活IFN -α启动子和干扰素敏感反应元件（ISRE）发起人。 IRF - 7，然后IFN-alpha/beta刺激和支持IRF - 3 28,29的进一步上调IFN -α转录上调。在这个实验中，C57/WT MEF细胞分泌碱性磷酸酶（SEAP）编码在一个人工NF - kB的，IRF - 3和IRF - 7的结合序列下游。因此，NSS突变体，缺乏IFN -β的抑制功能上调SEAP的分泌，然后测量。
图7由C13type SEAP的感应。
C57/WT MEF细胞（InvivoGen）分别模拟感染或感染与MP - 12或rMP12 C13type（C13type）3（左侧面板）或0.01（右图）MOI。培养上清14 HPI（50μL）与200μL定量蓝（InvivoGen）在96孔板和650 nm处的OD值基板混合后测定1 h后在37 °彗星由酶标仪。 SEAP的模拟病毒感染的细胞相对增加。这些数据代表的平均+ / - 3次独立实验的标准偏差。从C13type感染的细胞培养上清显示SEAP的增加，表明主机转录抑制NSS缺乏。
与高辛标记的RNA探针Northern杂交图8。
野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的模拟感染或感染与MP - 12或rMP12 C13type（C13type）MOI 3。总RNA用Trizol（Invitrogen公司），和北b 7 HPI大量使用地高辛标记的RNA探针的具体小鼠内源性ISG56 mRNA或MP - 12 N基因/抗病毒检测的S 段 2,30 。为了使小鼠内源性ISG56 mRNA或RVFV ñ基因/抗病毒检测的S段的探针，引物的PCR扩增片段KpnmISG56F（GGG TGG TAC总部大楼台泥法案TTC AGA海合会TTC GCA AAG CAG）和HindmISG56 （TAC AAA级GCT达GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA文建会GG）为ISG56 mRNA或KpnNF（AGT TGG TAC猫GGA民航局注册税务师TCA AGA GCT TGC摹）和HindNR RVFV（GGG民航局GCT TTT AGG CTG CTG的大老山隧道的TGT AAG） ñ基因/抗病毒检测的S段消化用 KpnⅠ 和 HindⅢ，结扎成pSPT18质粒（Roche.然后RNA与地高辛标记的探针合成，使用辛RNA标记试剂盒（SP6/T7）（罗氏猫＃1 175 025），每个样品的28S rRNA的水平也显示装载控制。野生型MEF的C13type诱导ISG56 mRNA合成受感染的细胞，而那些与MP感染-12没有诱导，暗示缺乏主机在C13type感染细胞的转录抑制。图6 SEAP检测所获得的数据是一致。
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Discussion
为RVFV反向遗传学系统已经开发了几个小组利用T7启动子2,4,5或鼠标3人4 POL -我子。在这个手稿中，我们描述了一个协议， 使用15个稳定表达T7 RNA聚合酶BHK/T7-9细胞产生重组RVFV MP - 12菌株。不同的病毒回收效率取决于BHK/T7-9细胞的条件，质粒量，转染细胞和数量等。我们总是放大的P0病毒在Vero E6细胞，获得高滴度实验的病毒储存。 I型干扰素主管的细胞，如人肺二倍体细胞（MRC - 5）可用于病毒扩增，只有当NSS功能支持高效的病毒复制，抑制抗病毒药物的活动，包括I型干扰素或巴基斯坦卢比。
牌匾检测是一个非常有用的方法，滴定MP - 12和NSS突变体。作为一般的预防措施斑块检测，细胞应立即添加与清除病毒接种后在适当的温度叠加。结晶紫染色法不适合检测C13type病毒斑，因为C13type病毒不会破坏单 层的Vero E6细胞2。另一方面，中性红染色可以成功地检测C13type病毒形成斑块。细胞与中性红染色的强度是由相对纳入到活细胞中性红染料。因此，它很可能C13type感染的细胞有代谢活动减少，从而导致未受感染的细胞相比，降低中性红染料掺入，从而形成了弱阳性重点。中性红的所需金额，因大量的中性红溶液。中性红溶液长期储存，往往会产生沉淀。热溶解中性红溶液，在55 ° C为10分钟，但是，它是可以预防的影响细胞的染色。
重要的是要使用精确的实验中的病毒滴度的病毒。在一个病毒的股票滴度，可降低pH值低于6.5 31表示这是由酚红黄色病毒的股票，长期贮存，反复冻融等媒体。因此，重要的是，使用动物疫苗接种的新鲜病毒的股票或再次滴定实验前的股票。
RVFV编码两个非结构蛋白的特点; NSS和NSM。 RVFV缺乏NSS是动物25,32显著减弱，而RVFV缺乏NSM依然是高度致命大鼠33。因此，NSS作为致病因子在发病机制中起着主要作用。 NSS是一种多功能蛋白诱导1）抑制主机一般转录8，2），抑制IFN -βmRNA的合成26日和3）的dsRNA - DEP的降解endent蛋白激酶（PKR）9,10。父母的MP - 12菌株可以通过引入新高中截断或突变进一步衰减。另一方面，同样重要的是保持这种突变MP - 12的免疫原性。 I型干扰素为树突状细胞，这是重要的T细胞和B细胞12-14的分化的成熟起到了作用。的各种NSS突变体，缺乏IFN -β的抑制功能，保持全部或部分NSS功能，是有用的候选疫苗的免疫原性和安全分析的NSS -介导的IFN -β的抑制功能的影响。据悉RVFV WT ZH548应变激活NF - kB的IRF - 3，和AP - 1（ 图6），受感染的细胞，而抑制IFN -βmRNA的合成是在转录水平上的 NSS 7。因此，MP - 12，这表示功能齐全的NSS 3，抑制transcri NF-kB/IRF-3/7-inducible SEAP报告基因的mRNA合成ptional水平，而重组MP - 12的缺乏，如C13type NSS功能可诱导SEAP的mRNA的合成（ 图7） 。要正确理解这种突变体的免疫原性的结果，应进一步为特征的表型细胞培养体系。例如，病毒复制动力学测试中的I型干扰素人肺二倍体的MRC - 5细胞或小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的细胞，如主管细胞。 PKR的降解功能，可以测试与人类或鼠标巴基斯坦卢比特异性抗体免疫印迹。 NSS突变的mRNA诱导IFN -β应与地高辛标记的RNA探针特定人或小鼠IFN -βmRNA的Northern杂交证实。主机一般转录抑制可以通过分析新生的mRNA纳入一个尿苷模拟测试。最后，候选人的MP - 12 NSS突变体的免疫原性和安全应在小鼠试验。通常情况下，1 × 10 5 PFU的念珠菌TE在PBS稀释的疫苗皮下注射，从眼窝窦在第30天（或42）和180天收集的血清中和抗体存在斑块减少中和试验（PRNT 80）和总IgG对RVFV ñ测试涂用纯化的重组病毒蛋白抗体酶联免疫吸附和GN / GC。候选疫苗的功效，可在42天后免疫测试具有挑战性的小鼠与野生型ZH501动物生物安全水平（BSL）4设施或加强BSL3 +设施（如：IP，1 x 10 3 PFU）在美国反向遗传学方法是一个功能强大的工具来设计和生成安全和免疫原性的减毒活RVFV疫苗。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由赠款5号U54通过西方优秀的区域中心（WRCE）AI057156 - 07，R01从国家过敏和传染病研究所AI08764301 - A1，西利疫苗开发中心，在大学内部资金德克萨斯州医学科。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR international | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma-Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | Invitrogen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | Invitrogen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | Invitrogen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
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