Summary
リフトバレー熱ウイルスMP - 12ワクチン株の逆遺伝学的システムは、追加のMP - 12の増加減衰および免疫原性と変異体を作成するための便利なツールです。我々はNSS変異株を生成し、特徴付けるためにプロトコルについて説明します。
Abstract
出血熱、神経疾患やヒトの失明、そして高レートの中絶と反芻動物1の胎児の奇形を引き起こすリフトバレー熱ウイルス（RVFV）は、選択剤とリスクグループ3の病原体を重ねるHHS / USDAとして分類されている。それは、ブニヤウイルス科の属Phlebovirusに属し、このファミリーの中で最も毒性の強いメンバーの一人です。 RVFV MP - 12ワクチン株2,3だけでなく、ZH548とZH501を含む野生型RVFV株4-6、、のためのいくつかのリバースジェネティクスシステムが2006年から開発されている。 MP - 12株は、（リスクグループ2病原体および非選択剤である）のM -およびL -セグメントでいくつかの変異によって高度に弱毒化ですが、それでも機能的な病原性をコード病原性S -セグメントRNA 3を 、運ぶ要因、NSS。それはとしてeffic複製しながらNSS ORFの欠失、フレームの69％を運ぶrMP12 - C13type（C13type）は、すべての既知のNSSの機能を欠いているIENTは、VeroE6細胞におけるMP - 12は、タイプ- I IFNを欠いていません。 NSSは、インターフェロン（IFN）-βmRNAの7,8を含むホストの転写のシャットオフを誘導し、翻訳後レベルでの二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ（PKR）の分解を促進する。9,10 IFN -βの転写であるインターフェロン調節因子3（IRF - 3）、NF - kBからアクチベーター蛋白質1（AP - 1）、およびIFN-alpha/beta受容体へのIFN -βの結合（IFNAR）によって上方制御は、IFN -αの転写を刺激するNSSによるIFN -β遺伝子を含むホストの転写抑制はウイルス複製に応答してそれらのISGsの遺伝子のupregulationsを防ぐ一方で、宿主の抗ウイルス活性を誘導する遺伝子または他のインターフェロン刺激遺伝子（ISGs）11、もののIRF - 3、NF - kBから活性化因子タンパク質- 1（AP - 1）RVFV7によって活性化することができます。 。このように、NSSはさらにMP - 12を減衰させる、およびIFN -β抑制機能を廃止することによって宿主自然免疫応答を高めるために優秀なターゲットです。ここ、我々は組換えMP - 12エンコーディング変異NSSを生成するためのプロトコルを記述し、IFN -βmRNAの合成を抑制する機能を欠いているNSS変異体を同定するためのスクリーニング方法の例を提供しています。自然免疫におけるその重要な役割に加えて、I型IFNは、樹状細胞と適応免疫応答12-14誘導の成熟にとって重要です。従って、I型IFNを誘導するNSSの変異体は、さらに減衰されますが、同時にそれらのワクチン接種のアプローチのための理想的な候補になる野生型MP - 12、より宿主の免疫応答を刺激するより効率的です。
Protocol
1。プラスミドDNAから組換えMP - 12エンコーディングのNSSの変異（S）2の回収
- スプレッドベビーハムスター腎臓（BHK）最小必須培地（MEM）-α（Invitrogen社、カタログ番号32561037）を含む10％ウシ胎児血清（FBS 6 cmのディッシュに安定的に発現するT7 RNAポリメラーゼ/ T7 - 9細胞15、、 ）、ペニシリン - ストレプトマイシン（ペニシリン：100 U / mlと、ストレプトマイシン：100μg/ mlの）（Invitrogen社、カタログ番号15140122）、およびハイグロマイシンB 600μg/ mlの（Cellgro、猫＃30 - 240 - CR）。
*ウイルスの回収効率は35 - mmディッシュに比べて6 cmの皿に高いです。低継代レベルでBHK/T7-9細胞は回復のより高いレートをサポートしています。また、他のBHK細胞株は安定的に発現するT7 RNAポリメラーゼは、4,5,16,17を使用することができること。 - 細胞がコンフルエントに70〜80％に到達したら、10％FBSおよびペニシリン - ストレプトマイシンを（ハイグロマイシンBを含まない）を含むMEM -α新鮮で培養上清を交換してください。
*細胞はtransfecteはずですT7 RNAポリメラーゼの発現の消失を防ぐために培地を交換した後1時間以内にD。 - RVFV、完全長のウイルスRNAの発現のためにウイルスのゲノムRNAをコードするプラスミドのセット、の回復およびウイルスタンパク質の発現（ 図1および図2）のためのウイルス遺伝子のオープンリーディングフレームをコードする第二のセットのために必要とされています。 1.5 mlチューブに以下のplasmids2（ 図2）の混合物を調製する。
- NSSの遺伝子の変異（複数可）（2 mg）を持つpProT7 - S（+）：このプラスミドは、抗ウイルスセンスT7プロモーターが隣接する（プラスセンス）フルレングスRVFV MP - 12 S -セグメントをしてエンコードするデルタ肝炎ウイルス（HDV）リボザイムの配列。
- pProT7 - M（+）（2 mg）を：このプラスミドは、抗ウイルスセンス（プラスセンス）のT7プロモーターとHDVリボザイムの配列に挟まれた、全長RVFV MP - 12 M -セグメントをエンコードします。
- pProT7 - L（+）（2 mg）を：このプラスミドは、抗ウイルスセンス（プラスセンス）フルレングスRVFV MP - 12 L -セグメントFLAをコードT7プロモーターとHDVリボザイムのシーケンスによってnked。
- PT7 - IRES - VN（2 mg）を：このプラスミドは、RVFV MP - 12 Nオープンリーディングフレーム（ORF）のT7プロモーターと脳心筋炎ウイルス（EMCV）内部リボソーム侵入部位（IRES）の下流をコードしている。
- PT7 - IRES - VL（1ミリグラム）：このプラスミドは、T7プロモーターおよびEMCVのIRESのRVFV MP - 12 L ORFの下流をエンコードします。
- pCAGGS - VG（1ミリグラム）：このプラスミドは、ニワトリβ-アクチンプロモーターのRVFV MP - 12 M ORFの下流をエンコードします。
*をpT7 - IRES - VN、PT7 - IRES - VLとpCAGGS - VGの追加により、MP - 12の回収のための必須ではありませんが、それは救助2の効率を高めます。著者らは、プラスミド、おそらく原因リボソームによってAUGsの漏出スキャンの欠如にPT7 - IRESを使用してGN / Gcの悪い表現を経験した。したがって、我々はキャップ依存GN / Gcの発現のためにpCAGGS - VGを構築。
- のOpti - MEM（Invitroge 385 mlにトランジット- LT1（Mirus、カタログ番号MIR2300）30 mlを加え1.5 mlチューブ、および渦短時間のn、猫＃31985070）。
- 室温で5分間のインキュベーション後、徐々に、ピペッティングにより穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートするステップ1.3からプラスミド混合物にリポソームを含むのOpti - MEMを追加。
- ドロップでステップ1.2ドロップ（ 図3）からBHK/T7-9細胞の培養液にリポソームとプラスミドの混合物を追加。
- 37℃でトランスフェクトした細胞をインキュベートする24時間、5％CO 2インキュベーターでC、および10％FBSおよびペニシリン-ストレプトマイシンを（ハイグロマイシンBを含まない）を含むMEM -α新鮮で培養上清を交換してください。
- 37℃で細胞をインキュベートする4個の追加日間5％CO 2（合計5日間インキュベート）を持つインキュベーターでC、および15 mlのチューブに培養上清を集める。
*細胞変性効果（CPE）はトランスフェクションするため、必ずしも成功したウイルスの回復の結果を反映していないここで観察さウイルスRNAの複製やウイルスのタンパク質合成に起因するCPEに似て表示される細胞死を誘導する。 - ℃で5分間4℃で2200 × gで上清を遠心分離します。
*このステップの目的は、ウイルスストックから細胞破片ダウンペレットにすることです。エアロゾルタイトな遠心バケットは、増加の安全のために推奨されます。 - スクリューキャップ5mlのクリオチューブに上清を移し、そして通路を° C、さらに使用するために-80℃で0（P0）のウイルス株を保管してください。
2。 P0ウイルスの増幅
- P0のサンプルは、多くの場合、ダウンストリームの実験2のための不十分なウイルス力価が含まれています。 IFN-alpha/beta遺伝子の18,19を欠いているアフリカミドリザル腎（ベロ）細胞のクローンであるVeroE6細胞の増幅工程では、最大レベルにウイルス力価を増加させる。また、他の細胞がIFNAR1 -ノックアウトマウスからそのようなHec1Bセル20またはMEF細胞のようなI型IFN応答を欠く21 mightはこのステップに使用すること。 10％FBSを含むダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）（Invitrogen社、カタログ番号11965092）の10cmの皿にVeroE6細胞を広げ、ペニシリン - ストレプトマイシン（ペニシリン：100 U / mlと、ストレプトマイシン：100 mg / ml）を、インキュベート37℃インキュベーターで5％CO 2を持つ彼らは80％コンフルエントに達するまで。
変異体NSSをエンコードする*組換えMP - 12株は、多くの場合、タイプ- I IFN -コンピテントセルで効率的に複製に失敗する。 - 10％FBSおよびペニシリン - ストレプトマイシン含有DMEM 2.7 mlをP0試料300mlを混ぜる。ステップ2.1からVeroE6細胞から培養液を取り出して、希釈P0サンプルと交換してください。 ° Cのインキュベーター内で1時間5％CO 2で37℃でインキュベートする。
- 接種を取り外し、各ディッシュに10％FBSおよびペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEM 10 mlを加える。
- 37℃でVeroE6細胞のCPEが明らかになるまで3〜4日間。
単層の*破壊は、ウコン、MP - 12感染中に発生電子などrMP12 - C13type（C13type）（ 図4）などの組換えMP - 12が欠けNSS、、単層を破壊するが、死んだ浮遊細胞の数は2〜3日感染後に表示されません。 - ）3〜4とセクション1.9で説明解像度、）と1.10で上清を回収し、E6P1としてサンプルを指定する。
3。プラークアッセイによる組換えMP - 12の滴定
- 6ウェルプレートにVeroE6細胞を広げる。
サンプルあたりの*重複した分析は、単一の分析よりも信頼性が高くなります。 - 次のようにVeroE6細胞が80％コンフルエントまで成長したら、10-6〜最大10％FBSおよびペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEM中でウイルスのサンプルの10倍段階希釈液を準備します。
- E6P1サンプル10μlの+ 10％FBSおよびペニシリン-ストレプトマイシン含有DMEMの990ミリリットル（10 -2希釈）
- 10 -2試料100μl+ 10％FBSおよびペニシリン-ストレプトマイシン（10 -3希釈）とDMEM 900mlの
- 10010 -3サンプル+ 10％FBSおよびペニシリン-ストレプトマイシン（10 -4希釈）とDMEM 900 mlの液
- 10 -4試料100μl+ 10％FBSおよびペニシリン-ストレプトマイシン含有DMEMの900のml（10-5希釈）
- ステップ3.1から6ウェルプレートから培地を吸引し、ウェル（ 図3）に各希釈液の400μlを（ステップ3.2から）を追加。
- ° Cのインキュベーター内で1時間5％CO 2で37℃でインキュベートする。
- インキュベーション中に、次のように寒天 - オーバーレイのため2本の15 mlチューブを準備します。
チューブ（42に保つ° Cのウォーターバス）：水中の1.2％7mlの高貴な寒天（VWR、カタログ番号101170〜362）
チューブB（37 ° Cの水浴中に保持）：改変イーグル培地7mlの（MEM 2倍）（Invitrogen社、カタログ番号11935046）10％FBSを含む、ペニシリン - ストレプトマイシン（ペニシリン：100 U / mlと、ストレプトマイシン：100μgの/ ml）を、10％トリプトースリン酸塩ブロス（MPのバイオメディカル、カタログ番号1682149）。 - 1時間のインキュベーション後、ウイルスを削除する接種、そしてすぐに2ミリリットルウェルあたりのチューブとチューブB（ステップ3.5から）の1:1混合物を追加。
*非感染細胞の死を引き起こす井戸の枯渇とすぐにオーバーレイを追加するように注意してください。 - 5％CO 2でインキュベーターで3日間、37℃で培養する。
- チューブとチューブのB再びステップ3.5で説明したように準備します。またまた37℃の水浴で保たれているプレートあたり0.33パーセントニュートラルレッド溶液（シグマアルドリッチ、カタログ番号N2889 - 100ML）500μLを準備します。
- ミックスチューブ、チューブBおよびニュートラルレッド溶液500ml（最終濃度。0.011パーセント）とウェルあたり混合液2 mlを加える。
*追加されるニュートラルレッド溶液の量は、ニュートラルレッド溶液の多くが変化し、初期化が必要です。 0.33パーセントニュートラルレッド溶液の長期保管は、降水量が発生します。このような場合には、沈殿を完全に55℃でインキュベートすることにより溶解することができます°激しく振盪続いて10分間。沈殿したニュートラルRの使用よく細胞の弱い染色、再溶解しながらニュートラルレッド溶液の染色細胞におけるEDのソリューションの結果。 - 16のプレートをインキュベート37時間（または一晩）℃、5％CO 2インキュベーターでC。
- ウェルあたり10から100プラークを含むウェル中のプラークの数を数えます。単位/ mlを形成するプラークの数を計算します。例えば、我々は10 -5希釈、28（＃プラークの）×（1 ml/0.4 ml）を× 10 5（希釈）= 7.0 × 10 6プラーク形成単位（pfu）を接種したウェルに28個のプラークを観察する場合/ mlの（ 図5）。
4。タイプ- I IFNの抑制機能を欠いているNSS変異体のスクリーニング
- 12ウェルプレートに、NF - kBからIRF - 3 / 7（ 図6）により分泌される胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子の誘導をエンコードC57/WT MEF細胞を（InvivoGen、カタログ番号MEF - c57wt）、広がった。細胞を10％FBS、ペニシリン - ストレプトマイシン（Peniciを含むDMEM中で維持されるLLIN：100 U / mlと、ストレプトマイシン：100μg/ mlの）、ブラストサイジンS（3 mg / ml）を、及びゼオシン（100μg/ mlの）。
- 細胞が（80％）サブコンフルエントになると、細胞はモック感染またはMP - 12または3または0.1の感染多重度（MOI）（セクション2と3を参照して、金額の少なくとも組換えMP - 12エンコーディングのNSSの変異に感染している各接種材料は）300μlのはずです。 1時間後の感染では、接種を削除、および10％FBSを含むDMEMを各ウェルに1 mlを追加し、ペニシリン - ストレプトマイシン（ペニシリン：100 U / mlと、ストレプトマイシン：100μg/ mlの）（ブラストサイジンとゼオシンは、この時に追加されません。時間）。
- 14時間の感染後では、培養上清を集める。 96ウェルプレートのウェルに定量ブルー200μlの（InvivoGen、カタログ番号REP - QB1）と各サンプル50μlを（3回）を追加します。 37プレートをシールし、インキュベート℃で1時間のためのCを
* MP - 12と組換えの両方MP - 12欠けてNSSは、明らかに293細胞、MRC - 5細胞とマウスembr含むIFN-alpha/betaコンピテントセルでホスト翻訳抑制を誘発する高いMOIで14時間後の感染後yonic線維芽細胞（MEF）細胞。一方、IFN -βmRNAまたはISG56 mRNAは7〜8時間後の感染で大量に蓄積するタイプ- Iは、コンピテント細胞をIFN。従って、我々は、自然免疫応答が誘導されるSEAPの蓄積を確認するために上清を収集するために14時間の感染後に選んだ。 - プレートリーダー（ 図7）を用いて 650nmでのOD値を読み取る。
*結果は、NSSの発現の有無（ 図8）でISG56 mRNAのアップレギュレーションを示すマウスISG56 mRNAは、に特異的なRNAプローブを用いたノーザンブロットによって得られたデータと一致している。
*これは、SEAP活性が宿主の翻訳活性の影響を受ける可能性がある蛋白質が豊富で決定されることに留意すべきである。 SEAPがさえSEAP mRNAの存在下で合成できないため、携帯電話の翻訳がsupprの場合はSEAPの相対的レベルは、mRNAレベルの上昇に比べて高い場合がありますessed。ノーザンブロットは、より直接的アッセイおよびSEAPレポーターアッセイに比べ感染細胞内のNSSの機能の不足によって誘導されるmRNAの量を評価するために、より正確な方法です。しかし、SEAPレポーターシステムは、ノーザンブロットよりも迅速かつ潜在的にホストの転写抑制機能を欠いているNSS変異の迅速なスクリーニングのためのゆえに便利です。
5。代表的な結果：
逆遺伝学的システムは、一貫して1 × 10 6 pfu / mlのより高い力価を持つ実行可能な遺伝子組換えMP - 12のウイルスを生成。 MP - 12はさまざまなサイズ2（図5）の透明なプラークを形成しながら、NSSの機能を欠くC13typeウイルスは、大規模な濁ったプラークを形成した。 C13typeに感染C57/WT MEF細胞の培養上清の増加が含まれている間モック感染C57/WTのMEF細胞またはMP - 12に感染したものは、モック感染細胞と比較して培養上清中のSEAPのレベルを増加させなかった14時間後に感染（HPI）（図7）により、SEAPのレベル。これらの結果は、マウスISG56発現（図8）に特異的なRNAプローブを用いたノーザンブロットにより得られるものと一致している。
RVFVの図1。ゲノム構造
RVFVは三負のセンスまたはambisense RNA S -、名前のゲノムM -、およびL -セグメントを持っています。 S -セグメントはambisenseの方法でNとNSSの遺伝子をコードしている。 NSS mRNAをアンチウイルスセンス（プラスセンス）S -セグメントから合成されている間、NのmRNAは、ウイルス検出（負センス）S -セグメントから合成される。 M -セグメントは、単一のMのmRNAをコードしており、それらの共同翻訳切断22,23に続いてMのmRNAの5'regionでいくつかのAUGs、の漏れの走査によってthe78kD、NSM、GNまたはGCのタンパク質を合成します。 L -セグメントは、L蛋白質をコードしている。 GnとGCがウイルスのエンベロープタンパク質である一方、NおよびL蛋白質の両方が、ウイルスの転写と複製に必須です。。 NSSとNSMのタンパク質は、ウイルス粒子に取り込まれない非構造蛋白質、です。
図2。。組換えRVFV MP - 12株の回復のためのプラスミドDNAの設計
をコードするcDNA全長の抗ウイルスセンスS -、M -、またはL -セグメントはpProT7 - M、T7プロモーターのcloneddownstreamと上流pProT7 - S（+）として指定されたデルタ肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列、のです。 （+）、またはそれぞれpProT7 - L（+）、2。 BHK/T7-9細胞で発現T7 RNAポリメラーゼは、正確なゲノム3'末端をコードするRNAの完全長S、M、またはL -セグメントを転写する。 NまたはLタンパク質のオープンリーディングフレーム（ORF）は、非キャップを可能にするために、それぞれ、PT7 - IRES - VNまたはPT7 - IRES - VLとして指定されている脳心筋炎ウイルス（EMCV）内部リボソーム侵入部位（IRES）、下にクローニングし、キャップ - 独立のリボソームによって認識されるT7 RNA転写物くぼみの方法。 M ORFは78kD、NSM、Gnと漏れやすいスキャン23によって異なるAUGsから生成されるGcのタンパク質の合成を可能にするために、pCAGGS - VGとして指定されているプラスミドpCAGGS 24日のニワトリβ-アクチンプロモーター下に複製されます。 NおよびL蛋白質の両方をpT7 - IRES - VNとをpT7 - IRES - VLは、組換えの回復MP - 12はおそらく2、ポル-のありそうな漏出の発現のために必要でない一方、転写またはRNAの複製を開始するために必要ですII駆動型キャップRNA転写エンコーディングpProT7 - S（+）とpProT7 - L（+）からN - ORFおよびL - ORF、それぞれ。
図3。プラスミドDNAからRVFV MP - 12の回収
pProT7 - S（+）とBHK/T7-9細胞、pProT7 - M（+）、pProT7 - L（+）、PT7 - IRES - VN、PT7 - IRES - VLとpCAGGS - VGプラスミド（図1のトランスフェクション）培養上清中の感染性組換えRVFV MP - 12株を生成するS. 5日間のトランスフェクション後における上清を回収し、ウイルスの増幅のための新鮮なベロE6細胞に継代されています。通常は、ウイルスの以上1 × 10 6 pfu / mlのは3〜4日後に感染症で回収することができます。増幅されたウイルス（E6P1ウイルスが）ベロE6細胞でのプラークアッセイを用いて滴定し、表現型の解析と免疫原性の研究に使用されます。
図4 MP - 12のS -セグメントとrMP12 - C13type
MP - 12とrMP12 - C13type（C13type）S -セグメントの比較。 MP - 12株のNSSに比べて、C13typeのNSS ORFが69％短縮され、自然に分離されたクローン13株の2,25のと同じです。
図5。MP - 12（機能NSS）とC13type（非機能NSS）のためのプラークアッセイ
ベロEの単分子層6ウェルプレートで6個の細胞はプラークアッセイに使用されます。 0.6％寒天オーバーレイで3日間のインキュベーション後、ニュートラルレッド溶液を含む第二の寒天のオーバーレイが追加されます。その後、プラークは4日目、感染後にカウントされます。 MP - 12フォームを様々なサイズの透明なプラーク、C13typeフォームながら、大きな濁ったプラーク（または巣）。 10から100プラークと同様にカウントするために使用する必要があります。
図6。C57/WT MEF細胞における分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）をレポーター遺伝子の活性化経路
インターフェロン-βプロモーターのAP - 1、NF - kBからIRF - 3の結合配列を含む。 RVFVの複製は、AP - 1、NF - kBからIRF - 3 7,11をアクティブにします 。しかし、NSSは、IFN -βmRNAが26の合成が抑制、さらにそれらの転写因子の結合後にIFN -βプロモーターのリプレッサー複合体の放出を抑制する。さらに、NSSの封鎖TFIIH P44 subunits8とLSOは、このようにIFN -α遺伝子とISREプロモーター下にある遺伝子を含む一般的なホストの転写抑制を誘導し、TFIIH P62サブユニット27の分解を促進する。 IFN -β抑制機能を欠いているC13typeまたは他のNSS変異体は、順番にIFN -αのプロモーターとインターフェロン感受性の応答要素（ISRE）プロモーターを活性化するIFN -βの合成を、誘発する。 IRF - 7はその後IFN-alpha/beta刺激による転写アップレギュレートし、IRF - 3の28,29のサポートにおけるIFN -αによりさらにアップレギュレートされる。このアッセイでは、C57/WT MEF細胞ではNF - KB、IRF - 3及びIRF - 7の人工的な結合配列の下流に分泌アルカリホスファターゼ（SEAP）をコードしている。このように、IFN -β抑制機能を欠いているNSS変異体は、その分泌して測定されるSEAPをアップレギュレートする。
図7。C13typeによってSEAPの誘導
C57/WT MEF細胞（InvivoGen）はモックだったMOI 3（左パネル）または0.01（右パネル）の時MP - 12またはrMP12 - C13type（C13type）で、感染または感染。培養上清（50μl）を14でHPIは96ウェルプレートにおける定量ブルー（InvivoGen）基板を200μlと混合し、650nmでのOD値は37℃で1時間インキュベーション後に測定された器材プレートリーダーでC。モック感染細胞へのSEAPの相対的な増加が示されています。 3つの独立した実験の標準偏差 - データは、平均+ /を表す。 C13type感染細胞から培養上清は、NSSによって、ホストの転写抑制の欠如を示唆し、増加SEAPを示しています。
図8。DIG標識RNAプローブを用いたノーザンブロット
野生型マウス胚性線維芽細胞（MEF）細胞は、モック感染またはMOI 3の時MP - 12またはrMP12 - C13type（C13type）に感染していた。トータルRNAは、トリゾール（Invitrogen社）、および北部bを使用して7 HPIで採取された多くは、マウス内在性ISG56 mRNAまたはMP - 12 NのmRNA /抗ウイルスセンスS -セグメント2,30に固有のジゴキシゲニン標識RNAプローブを用いて行った。マウス内在性ISG56 mRNAまたはRVFV NのmRNA /抗ウイルスセンスS -セグメント、KpnmISG56Fのプライマーセットにより増幅されたPCR断片（GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG）とHindmISG56用プローブを作るための（TAC AAA GCT TAT GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG）ISG56 mRNAまたはKpnNF（AGT TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA GCT TGC G）とRVFV用HindNR（GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG）のためのNのmRNA /抗ウイルスセンスS -セグメントは、KPNで消化されたI および Hind III、そして中に連結pSPT18プラスミド（ジゴキシゲニン標識Roche.その後、RNAプローブはDIG RNAラベリングキット（SP6/T7）（Roche社を、使用して合成した各サンプルの猫＃1 175 025）。28S rRNAのレベルは、コントロールをロードすると表示されます。野生型MEF細胞はC13type誘導ISG56 mRNA合成に感染し、それらがMPに感染しながら、-12 C13type感染細胞における宿主の転写抑制の欠如を示唆し、それを誘発しなかった。データは図6のSEAPアッセイで得られたものと一致している。
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Discussion
RVFVのために遺伝学のシステムを逆には、T7プロモーター2,4,5またはマウス3またはヒトの4 POL - Iプロモーターを利用していくつかのグループによって開発されている。この原稿では、我々はBHK/T7-9セル15その安定的に発現するT7 RNAポリメラーゼを用いて組換えRVFV MP - 12株を生成するためのプロトコルについて説明します。 BHK/T7-9細胞の状態によって異なるウイルス回収の効率化、プラスミドの量は、トランスフェクションされた細胞の数など。我々は、常に実験のために高力価のウイルスストックを得るためにベロE6細胞でP0ウイルスを増幅する。そのような人間の肺の二倍体（MRC - 5）細胞などのタイプ- I IFN -コンピテントセルは、NSSは、I型IFNやPKRを含む阻害抗ウイルス活動による効率的なウイルスの複製をサポートして機能する場合にのみ、ウイルス増幅を使用することができる。
プラークアッセイでは、MP - 12とNSS変異体を滴定するための非常に有用な方法です。の一般的な予防策としてプラークアッセイは、細胞はすぐにウイルスの接種材料の除去後に適切な温度でオーバーレイを追加する必要があります。 C13typeウイルスがベロE6細胞2の単層を妨害しないため、クリスタルバイオレット染色は、C13typeウイルスのプラークを検出するには適していません。一方、ニュートラルレッド染色は、正常にC13typeウイルスによって形成されたプラークを検出することができた。ニュートラルレッドで携帯染色の強度は、生細胞へのニュートラルレッド色素の相対的な取り込みにより決定されます。従って、それはC13type感染細胞が非感染細胞のそれに比べてニュートラルレッド色素の取り込みの減少につながるの減少代謝活性を持って、どれが弱い染色フォーカスを形成する可能性があります。ニュートラルレッドの必要量は、ニュートラルレッド溶液の多くによって異なります。ニュートラルレッド溶液の長期保存には多くの場合、沈殿物を生成します。これは、熱溶解55ニュートラルレッド溶液℃で10分間のことによって防止できますが、それを細胞の染色に影響を与えます。
実験では、正確なウイルスの力価でウイルスを使用することが重要です。ウイルスストックの力価は、その上に黄色のウイルスストックのフェノールレッドの色、長期保存、凍結融解の繰り返しとで示されている6.5 31以下のpHを持つメディアが低下する可能性があります。このように、動物のワクチン接種のために新鮮なウイルスストックを使用するか、単に実験の前に再び株式を滴定することが重要です。
NSSとNSM、RVFVは2つの特徴と非構造タンパク質をコードする。 RVFV欠けNSMはまだラットの33の高病原性のときにNSSを欠いているRVFVは、動物25,32で著しく減衰する。このように、NSSは、病因の病原性因子として主要な役割を果たしている。 NSSは）二本鎖RNA - DEPのIFN -βmRNAの合成を26と3の抑制）劣化ホストの一般的な転写8、2の1）の抑制を誘導する多機能タンパク質です。endentプロテインキナーゼ（PKR）9,10。親のMP - 12株は、NSSに切り捨てまたは変異を導入することによってさらに減衰させることができる。一方、そのような変異体MP - 12の免疫原性を維持するためにも重要です。タイプ- Iは、IFNは12月14日 、T細胞とB細胞の分化に重要である樹状細胞の成熟のための役割を果たしている。完全または部分的なNSSの機能を維持するIFN -β抑制機能を欠いている様々なNSSの変異体は、ワクチン候補の免疫原性および安全上のNSS -介したIFN -βの抑制機能に及ぼす影響を分析する上で有用です。 IFN -βmRNAの合成を転写レベル7のNSSによって抑制されている間それは、細胞がRVFV重量ZH548歪みアクティブのNF - kB、IRF - 3、およびAP - 1（ 図6）に感染したことが知られている。従って、完全に機能するNSS 3を表現するMP - 12は、、transcriでNF-kB/IRF-3/7-inducible SEAPレポーター遺伝子のmRNAの合成を阻害する一方ptionalレベルは、そのようなC13typeなどの組換えMP - 12欠けてNSSの機能は、SEAP mRNAの合成を（ 図7）誘導することができます。正しくこのような変異体の免疫原性の結果を理解するために、表現型は、さらに細胞培養系を特徴としてください。例えば、ウイルス複製の動力学は、ヒトの肺の二倍体MRC - 5細胞やマウス胚性線維芽細胞（MEF）細胞などのI型IFNコンピテントセルでテストする必要があります。 PKRの分解機能は、ヒトやマウスのPKRに特異的な抗体でウエスタンブロットすることによって試験することができる。 NSS突然変異によるIFN -βmRNA誘導は、ヒトまたはマウスIFN -βmRNAに特有のジゴキシゲニン標識RNAプローブを用いてノーザンブロットによって確認されるべきである。ホストの一般的な転写抑制は、新生mRNAにウリジンアナログの取り込みを分析することによってテストすることができます。結局、候補MP - 12 NSSの変異体の免疫原性および安全性をマウスでテストする必要があります。カンジダの典型的に、1 × 10 5 pfuのPBSで希釈したTEのワクチンは、30日目（または42）に後眼窩洞から収集し、一日180皮下および血清与えられるプラーク減少中和試験（PRNT 80）とRVFV Nに対する全IgGによる中和抗体の存在について試験されていますおよびIgG ELISAによるGN / Gcは組換えウイルスタンパク質の精製でコーティング。米国における動物バイオセーフティーレベル（BSL）4施設またはBSL3強化+施設で、逆に、ワクチン候補の有効性は、野生型ZH501（IP、1 × 10 3 pfuの例）で42日間で挑戦的なマウスでのポスト予防接種をテストすることができます遺伝学のアプローチは、設計し、安全で免疫原性弱毒RVFVワクチンを生成する強力なツールです。
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Disclosures
我々は、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、グラントの数5エクセレンスの西部地域センター（WRCE）を通じて、U54 AI057156 - 07、アレルギーや国立感染症研究所から1 R01 AI08764301 - A1、および大学のワクチン開発のためのシーリーセンターの内部資金によって賄われていたテキサスメディカルブランチ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR international | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma-Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | Invitrogen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | Invitrogen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | Invitrogen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
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