Summary
Rift Vadisi ateşi virüs MP-12 aşı suşu için ters genetik sistemi ek MP-12 mutantlar artan zayıflama ve immünojenite oluşturmak için yararlı bir araçtır. Biz NSS mutant suşlar oluşturmak ve karakterize etmek için protokol açıklar.
Abstract
Hemorajik ateş, nörolojik bozukluklar veya insanlarda körlüğe ve yüksek oranda kürtaj ve geviş getiren hayvanların 1 fetal malformasyon neden Rift Vadisi ateşi virüsü (RVFV), bir HHS / USDA seçin ajan ve 3 patojen bir risk grubu örtüşüyor olarak sınıflandırılmıştır. Bu, aile Bunyaviridae cinsi Phlebovirus ait ve bu ailenin en şiddetli üyelerinden biridir . 2006 yılından bu yana RVFV MP-12 aşı suşu 2,3 ZH548 ve ZH501 dahil olmak üzere yabani tip RVFV suşları 4-6, yanı sıra pek çok ters genetik sistemler geliştirilmiştir . MP-12 suşu (risk grubunda 2 patojen ve non-select ajan olan) birkaç kendi mutasyonlar M ve L-segmentleri oldukça zayıflatılmış, ancak hala fonksiyonel bir virülans kodlar öldürücü G-segment RNA 3 taşır faktörü, NSS. Effic çoğaltır rMP12 C13type (C13type) NSS ORF silme-kare% 69 taşıma, bilinen tüm NSS fonksiyonları yoksunient VeroE6 hücrelerinde MP-12 tip I IFN eksik yok. NSS, interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 dahil olmak üzere, ev sahibi transkripsiyon kapatma indükler ve post-translasyon seviyesinde çift sarmallı RNA-bağımlı protein kinaz (PKR) bozulması teşvik 9,10 IFN-beta transkripsiyonel IFN-alfa interferon düzenleyici faktör 3 (IRF-3), NF-kB ve aktivatör protein-1 (AP-1), IFN-beta ve IFN-alpha/beta reseptör bağlayıcı (IFNAR) upregüle transkripsiyonu uyarır NSS IFN-beta gen dahil olmak üzere ana transkripsiyon bastırma viral replikasyon yanıt, bu ISGs gen upregulations engeller ise, ev sahibi antiviral aktivite gösteren genler veya diğer interferon uyarılan genlerin (ISGs) 11, rağmen IRF-3, NF-kB ve aktivatör protein-1 (AP-1) RVFV7 tarafından aktif hale getirilebilir. . Böylece, NSS, daha da azaltmak için MP-12 ve IFN-beta bastırma fonksiyonu kaldırılarak, doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını barındıran geliştirmek için mükemmel bir hedef. Burada, Rekombinant bir MP-12 kodlaması mutasyona uğramış NSS üretmek için bir protokol tanımlayan ve IFN-beta mRNA sentezini bastırmak için fonksiyonu olmayan NSS mutantlar tanımlamak için bir tarama yöntemi bir örnek oluşturmaktadır. Doğuştan gelen bağışıklık önemli rol ek olarak, tip I IFN, dendritik hücreler ve adaptif immün yanıt 12-14 indüksiyon olgunlaşması için çok önemlidir . Böylece, NSS mutantlar tip I IFN inducing daha da zayıflatılmış, ama aynı zamanda onları aşılama yaklaşımlar için ideal bir aday yapar yabani tip MP-12, daha teşvik edici bir konak bağışıklık yanıtlarını daha verimlidir.
Protocol
1. Plazmid DNA'lar 2 rekombinant MP-12 kodlama NSS mutasyon (lar) Kurtarma
- Spread bebek bir hamster böbrek (BHK) / T7-9 hücreler 15, stabil bir şekilde ifade T7 RNA polimeraz, 6 cm kaplarına Minimum Essential Medium (MEM)-alfa (Invitrogen, Kedi # 32.561.037% 10 fetal sığır serumu (FBS içeren) ), Penisilin-Streptomisin (Penisilin: 100 U / ml, Streptomisin: 100 mg / ml) (Invitrogen, Kedi # 15.140.122) ve 600 mcg / ml hygromycin B (Cellgro, Cat # 30-240-CR).
* Viral iyileşme verimliliği 6 cm yemekler, 35 mm yemekleri daha yüksektir. BHK/T7-9 hücreleri düşük geçiş düzeyi ile daha yüksek iyileşme oranları destekler. Alternatif olarak, diğer BHK hücre hatları stabil bir şekilde ifade T7 RNA polimeraz 4,5,16,17 kullanılan olabilir ki. - Hücrelerin% 70-80 confluency ulaşmış, taze MEM-alfa% 10 FBS ve Penisilin-Streptomisin (hygromycin B içeren) içeren kültür süpernatant yerine
* Hücreler transfecte olmalıdırd T7 RNA polimeraz ifade kaybını önlemek için orta değiştirdikten sonra 1 saat içinde. - RVFV, tam uzunlukta viral RNA ifade için viral genomik RNA'lar kodlayan plazmid bir dizi kurtarma ve ikinci bir viral protein ekspresyonu (Şekil 1 ve 2) için viral gen açık okuma çerçeveleri kodlaması için gereklidir. 1.5 ml tüp aşağıdaki plasmids2 (Şekil 2) oluşan bir karışım hazırlayın:
- (2 mg) NSS gen mutasyon (lar) ile pProT7-S (+): Bu plazmid-viral, anti-sense (pozitif anlamda) kodlar tam uzunlukta RVFV MP-12, G-segment ve T7 organizatörü tarafından çevrili Hepatit delta virüsü (HDV) ribozim dizisi.
- pProT7-M (+) (2 mg): Bu plazmid-viral, anti-sense (pozitif anlamda) tam uzunlukta RVFV MP-12 M-segment T7 organizatörü ve HDV ribozim dizisi ile çevrili kodlar
- pProT7-L (+) (2 mg): Bu plazmid anti-viral anlamda kodlar (pozitif anlamda) tam uzunlukta RVFV MP-12 L-segment flaT7 organizatörü ve HDV ribozim dizisi nked.
- pT7-IRES-vN (2 mg): Bu plazmid RVFV MP-12 N açık okuma çerçevesi (ORF) T7 organizatörü ve bir encephalomyocarditis virüsü (EMCV) iç ribozom giriş yeri (IRES) alt-kodlar.
- pT7-IRES-VL (1 mg): Bu plazmid kodlar RVFV MP-12 L ORF T7 organizatörü ve EMCV IRES mansabında.
- pCAGGS-VG (1 mg): Bu plazmid tavuk beta-aktin organizatörü RVFV MP-12 M ORF downstream kodlar.
* Ayrıca pT7-IRES-vN, pT7 IRES-VL ve pCAGGS-VG, MP-12 kurtarma için gerekli değildir, ancak kurtarma 2 verimliliği arttırır . Yazarlar plazmid, muhtemelen ribozomlar tarafından AUGs sızdıran tarama eksikliği nedeniyle pT7-IRES kullanarak Gn / Gc, yoksul ifade yaşadı. Bu nedenle, kap-bağımlı Gn / Gc ifade pCAGGS-VG inşa edilmiş.
- 385 ml Opti-MEM (Invitroge transit LT1 30 ml (Mirus, Kedi # MIR2300) eklen, Kedi # 1.5 ml tüp 31.985.070) ve vorteks kısaca.
- Oda sıcaklığında 5 dakika inkübasyondan sonra, yavaş yavaş, pipetleme tarafından yavaşça karıştırın ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe lipozomlar adım 1.3 plazmid karışımı içeren Opti-MEM ekleyin.
- Adım 1.2 damla damla (Şekil 3) BHK/T7-9 hücrelerinin kültür ortamı, lipozom ve plazmid karışımı ekleyin .
- 24 saat süreyle% 5 CO 2 ile bir inkübatör 37 transfekte hücreler ° C inkübe ve kültür süpernatant yerine taze MEM-alfa% 10 FBS ve Penisilin-Streptomisin (hygromycin B içeren) içeren.
- 37 ° hücreleri inkübe ° C bir kuluçka için% 5 CO 2 ek 4 gün (toplam 5 gün boyunca inkübe), ve 15 ml'lik bir tüp içine kültür süpernatantlar toplamak .
* Burada gözlenen sitopatik etki (CPE) mutlaka başarılı viral iyileşme sonucu yansıtmamaktadır çünkü transfeksiyonviral RNA çoğaltma veya viral protein sentezi neden CPE benzer görünür hücre ölümüne neden olur. - 4 ° C 'de 5 dakika boyunca 2200 xg süpernatantlar santrifüjleyin.
* Bu adımın amacı, viral stok hücresel enkaz aşağı pelet. Bir aerosol sıkı santrifüj kova artan güvenlik için önerilir. - Vidalı kapaklı 5 ml cryotubes süpernatantlar transferi ve geçit daha sonra kullanmak için -80 ° C 'da 0 (P0) virüs stok saklamak.
2. P0 virüs amplifikasyonu
- P0 örnekleri genellikle mansap deneyler 2 için yetersiz viral titresi içerir. IFN-alpha/beta genleri eksik 18,19 Afrika yeşil maymun böbrek (Vero) hücreleri bir klonu VeroE6 hücrelerinde amplifikasyon adım, maksimum düzeyde viral titresi kadar artar. Alternatif olarak, diğer hücreler 21 migh IFNAR1-knockout farelerde tip I IFN Hec1B hücreleri 20 veya MEF hücreleri gibi tepkiler eksikBu adım için kullanılabilir. % 10 FBS içeren Dulbecco'nun değiştirilmiş asgari temel orta (DMEM) (Invitrogen, Cat # 11.965.092) 10 cm yemekleri içine VeroE6 hücrelerinin yayılmasını, Penisilin-Streptomisin (Penisilin: 100 U / ml, Streptomisin: 100 mg / ml), ve inkübe 37 ° C'de bir inkübatör,% 5 CO 2 ile% 80 confluency ulaşana kadar.
Mutant NSS kodlama * Rekombinant MP-12 suşları genellikle tip I IFN-yetkili hücreleri etkin bir şekilde çoğaltmak için başarısız olur. - P0 örnekleri% 10 FBS ve Penisilin-Streptomisin DMEM 2.7 ml ile 300 ml karıştırın. Adım 2.1 'den VeroE6 hücrelerin kültür ortamı çıkarın ve sulandırılmış P0 örneği ile değiştirin. % 5 CO 2 ile 37 ° C bir kuluçka 1 saat inkübe edin.
- Inocula çıkarın ve her çanak% 10 FBS ve Penisilin-Streptomisin DMEM 10 ml ekleyin.
- 37 ° ° C'de 3 ila 4 gün VeroE6 hücrelerin CPE belirgin hale gelinceye kadar.
* Tek tabakalı bir bozulma MP-12 enfeksiyonu, whil sırasında oluşurrMP12 C13type (C13type) (Şekil 4) gibi e rekombinant MP-12 eksik NSS, tek tabaka bozmayacak, ama ölü yüzen hücreleri sayısı 2 ya da 3 gün sonra enfeksiyon görünür. - 3 ila 4 dpi bölümlerde 1.9) ve 1.10 'da açıklandığı gibi süpernatant) Hasat, ve örnekleri E6P1 olarak tayin.
3. Plak yöntemi ile rekombinant MP-12 Titrasyon
- 6-kuyucuğu içine VeroE6 hücrelerinin yayılmasını.
* Yinelenen analizi örnek başına, tek bir analiz daha güvenilir. - Aşağıdaki gibi VeroE6 hücreleri confluency% 80 büyüdü, 10-6 kadar% 10 FBS ve Penisilin-Streptomisin DMEM virüs örneklerinin 10 kat seri dilüsyonları hazırlamak:
- E6P1 örnek 10 ul +% 10 FBS ve Penisilin-Streptomisin ile DMEM 990 ml (10 -2 dilüsyon)
- 100 ul 10 -2 örnek +% 10 FBS ve Penisilin-Streptomisin (10 -3 seyreltme) ile 900 ml DMEM
- 10010 -3 örnek +% 10 FBS ve Penisilin-Streptomisin (10 -4 dilüsyon) ile DMEM 900 ml, ul
- 10 -4 örnek 100 ul +% 10 FBS ve Penisilin-Streptomisin ile DMEM 900 ml (10-5 dilüsyon)
- Adım 3.1 'den 6 plaka orta aspire ve kuyular (Şekil 3) her seyreltme 400 ul (3.2 adım) ekleyin.
- % 5 CO 2 ile 37 ° C bir kuluçka 1 saat inkübe edin.
- İnkübasyon sırasında, aşağıdaki gibi agar-bindirme için iki adet 15 ml tüpler hazırlamak:
Tüp A (42 ° C su banyosunda tutmak): su,% 1.2 asil agar 7 ml (VWR, Cat # 101.170-362)
Tüp B (37 ° C su banyosunda tutmak): Modifiye Kartal Orta 7 ml (MEM 2x) (Invitrogen, Kedi # 11.935.046)% 10 FBS içeren, Penisilin-Streptomisin (Penisilin: 100 U / ml, Streptomisin: 100 mikrogram / ml), ve% 10 Tryptose fosfat suyu (MP Biomedicals, Kedi # 1.682.149). - 1 saat inkübasyondan sonra, viral kaldırmakinocula ve hemen her iyi bir tüp ve tüp B (Adım 3.5) 1:1 karışım 2 ml ekleyin.
* Bulaşmamış hücrelerinin ölümüne neden olur kuyuların kuruması olarak hemen bindirmesi eklemek için özen gösterin. - % 5 CO 2 ile 3 günlük bir kuluçka plakalar için 37 ° C'de inkübe edin.
- Hazırlayın tüp tüp B ve tekrar adım 3.5 'te açıklandığı gibi. Aynı zamanda da 37 ° C su banyosunda tutulur plaka başına% 0.33 nötral kırmızı solüsyonu (Sigma Aldrich, Cat # N2889-100ml) 500 ul hazırlayın.
- Mix tüp A, tüp B ve nötral kırmızısı çözeltisi ve 500 ml (son kons% 0.011) ve de ortalama karışımı 2 ml ekleyin.
* Eklenecek nötr kırmızı çözüm miktarı çok nötr kırmızı çözüm göre değişir ve ilk optimizasyonu gereklidir. % 0.33 nötral kırmızı çözüm Uzun süreli depolama yağış neden olur. Bu gibi durumlarda, 55 inkübasyon çökelti tamamen çözülebilir ° C de 10 dakika iyice sallanarak. Çöktürülmüş nötr rhücreleri zayıf boyanma ed çözüm sonuçları ise yeniden çözünmüş nötr kırmızı çözüm lekeleri hücreleri. - 16 plaka inkübe az 37 saat (veya gece) ° C ile bir inkübatör% 5 CO 2.
- Plakların sayısını ortalama 10 ila 100 plaklar içeren iyi. Ünite / ml oluşturan plak sayısını hesaplayın. Örneğin, 10 -5 dilüsyonları, 28 (plaklar) x (1 ml/0.4 ml) x 10 5 (seyreltme) = 7.0 x 10 6 plak oluşturan birim (pfu) inoküle kuyularda 28 plaklar dikkate alırsanız / ml (Şekil 5).
4. NSS mutantlar Tarama tip I IFN bastırma fonksiyonu eksik
- 12 kuyucuğu içine NF-kB ve IRF-3 / 7 (Şekil 6) tarafından salgılanan embriyonik alkalen fosfataz (SEAP) gen indüklenebilir kodlamak Spread C57/WT MEF hücreleri (InvivoGen, Kedi # MEF-c57wt). Hücrelerinin% 10 FBS, Penisilin-Streptomisin (Penici DMEM tutulurllin: 100 U / ml, Streptomisin: 100 mcg / ml), Blasticidin S (3 mg / ml) ve Zeocin (100 mcg / ml).
- Hücrelerin alt konfluent (% 80) hale geldiğinde, hücreler sahte enfekte veya MP-12 ya da 3 veya 0,1 enfeksiyon çokluğu (moi) (bkz. bölüm 2 ve 3, miktarı rekombinant MP-12 kodlama NSS mutasyonlar ile enfekte Her inokulum) 300 ul olmalıdır. 1 saat yazılan enfeksiyon, inocula kaldırmak ve% 10 FBS, Penisilin-Streptomisin (Penisilin: 100 U / ml, Streptomisin: 100 mcg / ml) 1 ml başına iyi DMEM ekleyin (Blasticidin ve Zeocin eklenmez zaman).
- 14 saat yazılan enfeksiyon, kültür süpernatantlar toplamak. Quanti-Mavi 200 ul (InvivoGen, Cat # rep-qb1) ve 96-plaka kuyu için her numunenin 50 ul (üç nüsha) ekleyin. Mühür ve plaka 37 ° C'de 1 saat inkübe
* MP-12 ve rekombinant MP-12 eksikliği NSS açıkça IFN-alpha/beta 293 hücreler, MRC-5 hücre ve fare embr dahil olmak üzere yetkili hücrelerinde konak translasyonel bastırma nedenyüksek moi 14 saat sonrası enfeksiyon sonrası yonic fibroblast (MEF) hücreleri. Öte yandan, IFN-beta mRNA veya ISG56 mRNA 7 az 8 saat enfeksiyonu bol miktarda biriken tipi yetkili hücreleri IFN. Böylece, doğal immün yanıtın neden SEAP birikimi görmek için süpernatantlar toplamak için 14 saat enfeksiyonu seçti. - Bir plaka okuyucu kullanarak (Şekil 7) 650 nm'de OD değerleri okuyun.
* Sonuçları Northern blot NSS ifade yokluğu (Şekil 8) ISG56 mRNA düzenleme gösterir fare ISG56 mRNA, özel bir RNA prob kullanılarak elde edilen veriler ile tutarlı.
* SEAP aktivite, ev sahibi çeviri etkinliği etkilenebilir proteinlerin bolluk tarafından belirlenir dikkat edilmelidir. SEAP SEAP mRNA'nın varlığında bile sentez olamaz çünkü hücresel çeviri suppr ise SEAP göreceli bir düzeyde artan mRNA düzeyi ile karşılaştırıldığında yüksek olmayabilirsinyallerin tanınmasında. Northern blot daha basit bir tahlil ve SEAP reporter assay daha enfekte hücrelerde NSS fonksiyonları eksikliği neden mRNA miktarını değerlendirmek için daha doğru bir şekilde. Ancak, SEAP muhabiri sistemi Northern blot daha hızlı ve dolayısıyla potansiyel ev sahibi transkripsiyon bastırma fonksiyonu eksik NSS mutantlar hızlı tarama için yararlı.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Ters genetik sistemi 1 x 10 6 pfu / ml 'den yüksek titreleri ile sürekli canlı rekombinant MP-12 virüsler oluşturulur . MP-12 çeşitli büyüklüklerde 2 (Şekil 5), açık plaklar oluşturdular NSS fonksiyonları eksik C13type virüs, büyük bulanık plaklar oluşturdular . C13type ile enfekte C57/WT MEF hücrelerinin kültür süpernatant bir artış içerdiği C57/WT MEF Mock-enfekte hücreleri veya MP-12 ile enfekte olanlar, mock-enfekte olmuş hücreler ile karşılaştırıldığında kültür süpernatant SEAP seviyesi artmadı14 saat sonrası enfeksiyon (HPI) (Şekil 7) SEAP düzeyi. Bu sonuçlar, Northern blot fare ISG56 mRNA (Şekil 8) için özel bir RNA prob kullanılarak elde edilen tutarlı.
Şekil 1 RVFV Genom yapısı
RVFV üçlü bir negatif anlamda ya da ambisense RNA genomu adlı S, M ve L-segment. S-segment N ve NSS genlerin bir ambisense şekilde kodlar. Anti-viral-sense (pozitif anlamda) S-segment NSS mRNA sentezlenir N mRNA, viral-sense (negatif anlamda) S-segment sentezlenir. M-segment tek bir M mRNA kodlar ve co-translasyonel bölünme 22,23 M mRNA 5'region AUGs sızdıran tarama the78kD, NSM, Gn ve Gc proteinler sentezler. L-segment L proteini kodlar. Gn ve Gc viral zarf proteinleri ise her ikisi de K ve L proteinler, viral transkripsiyon ve replikasyon için gerekli. NSS ve NSM proteinler yapısal olmayan proteinler, virüs parçacıkları içine dahil değildir.
Şekil 2. Rekombinant RVFV MP-12 suşu kurtarma için plazmid DNA Tasarım
CDNA kodlama tam uzunlukta anti-viral-sense S, M, L-segment pProT7-S (+) olarak belirlenmiş ribozim dizileri, pProT7-M cloneddownstream T7 organizatörü ve yukarı hepatit delta virüsü (HDV) (+), veya pProT7-L (+), 2. BHK/T7-9 hücrelerinde ifade T7 RNA polimeraz, RNA kodlama transkripsiyonun tam uzunlukta S, hassas genom 3 'sonuna M veya L-segment. N veya L proteinler açık okuma çerçevesi (ORF), kapağını açıp izin encephalomyocarditis virüsü (EMCV) sırasıyla pT7-IRES-vN veya pT7-IRES-VL olarak belirlenmiş iç ribozom giriş yeri (IRES), altında klonlanmış T7 RNA transkript kap-bağımsız ribozomlar tarafından tanınması içingöçük şekilde. M ORF sızdıran tarama 23 farklı AUGs üretilir 78kD sentezi, NSM, Gn ve Gc proteinlerinin izin pCAGGS-VG olarak belirlenmiş plazmid pCAGGS 24, tavuk b-aktin organizatörü altında klonlanmış. PT7-IRES-vN ve pT7 IRES-VL tahminen sızdıran ifadesi nedeniyle muhtemelen rekombinant MP-12 2 kurtarma için gerekli değil ise her ikisi de K ve L proteinler, transkripsiyonu ya da RNA çoğaltma başlatılması için gerekli olan Pol- II-tahrik sırasıyla pProT7-S (+) ve pProT7-L (+) kapaklı RNA transkript kodlama N-ORF ve L-ORF.
Şekil 3 plazmid DNA MP-12 RVFV Kurtarma
BHK/T7-9 pProT7-S (+) hücreleri, pProT7-M (+), pProT7-L (+), pT7 IRES-vN, pT7 IRES-VL ve pCAGGS-VG plazmid (Şekil 1, Transfeksiyon ) kültür süpernatant enfeksiyöz, rekombinant RVFV MP-12 suşu üretirs 5 günlük yazılan transfeksiyon süpernatant toplanan ve viral amplifikasyonu için taze Vero E6 hücrelerin içine geçişli. Tipik olarak, en fazla 1 x 10 6 pfu / ml virüsü 3 - 4 gün sonrası enfeksiyon telafi edilebilir. Güçlendirilmiş bir virüs (E6P1 virüs) Vero E6 hücreleri ile plak tahlil kullanarak titre ve fenotip analizi ve immünojenite çalışmaları için kullanılır.
Şekil 4 MP-12, G-segment ve rMP12 C13type
MP-12 karşılaştırması ve rMP12-C13type (C13type) S-segmentleri. MP-12 suşu NSS karşılaştırıldığında, C13type NSS ORF% 69 kesildi ve doğal izole klon 13 suşu 2,25 aynıdır.
Şekil 5 Plak MP-12 (fonksiyonel NSS) ve C13type (non-fonksiyonel NSS) için tahlil
Vero E monolayer6 plaka 6 hücreli plak testi için kullanılır. % 0.6 agar kaplaması, nötr kırmızı çözeltisi içeren ikinci bir agar kaplaması ile 3 gün inkübasyon eklenir sonra. Daha sonra, plaklar, günde 4 yazılan enfeksiyon sayılır. MP-12 formları çeşitli boyutları net plaklar ise C13type formları büyük bulanık plaklar (odaklar). 10 ile 100 plaklar ile iyi sayımı için kullanılmalıdır.
Şekil 6 salgılanan alkalen fosfataz (SEAP) C57/WT MEF hücrelerinde muhabiri gen aktivasyonu yolağı
İnterferon beta organizatörü AP-1, NF-kB ve IRF-3 bağlayıcı dizileri içerir. RVFV çoğaltma, AP-1, NF-kB ve IRF-3 7,11 harekete geçirir . Ancak, NSS, dolayısıyla IFN-beta mRNA 26 sentezini baskılayarak, hatta bu transkripsiyon faktörleri bağlayıcı sonra IFN-beta organizatörü repressör kompleksi salınımını engellerler . Ayrıca, NSS sequesters TFIIH P44 subunits8 veLSO böylece IFN-alfa gen ve ISRE organizatörü altında genler de dahil olmak üzere genel bir konak transkripsiyon bastırma inducing, TFIIH P62 alt birimden 27 bozulması teşvik etmektedir. IFN-beta bastırma fonksiyonu eksik veya diğer C13type NSS mutantlar da IFN-beta, IFN-alfa organizatörü ve interferon duyarlı tepki elemanı (ISRE) organizatörü aktive sentezi, neden olur. IRF-7 IFN-alpha/beta uyarılması ve IRF-3 28,29 destek IFN-alfa ile daha da upregüle sonra transkripsiyonel upregüle. Bu testte, C57/WT MEF hücreleri NF-kB, IRF-3 ve IRF-7 yapay bir bağlayıcı sırası downstream salgılanan alkalen fosfataz (SEAP) kodlayın. Bu nedenle, IFN-beta bastırma fonksiyonu eksik NSS mutantlar salgılanması sonra ölçülür SEAP upregüle.
Şekil 7 C13type tarafından SEAP İndüksiyon
C57/WT MEF hücreleri (InvivoGen) alay edildiEnfekte veya MP-12 veya rMP12-moi 3 (sol panel) veya 0.01 (sağ panel) C13type (C13type) ile enfekte. Quanti-Mavi (InvivoGen) 96 plaka ve 650 nm'de OD değerleri substrat ul 200 14 HPI Kültür süpernatantlar (50 ul) ile karışık, az 1 saat inkübasyon 37 ° C plaka okuyucu tarafından sonra ölçüldü. Mock-enfekte hücreleri SEAP göreceli artış göstermiştir. Üç bağımsız deneyler standart sapma veri ortalama + / temsil etmektedir. C13type enfekte hücreler kültür süpernatant NSS konak transkripsiyon bastırma eksikliği düşündüren, artan SEAP gösterir.
Şekil 8 DIG etiketli RNA prob ile Northern blot
Wild-tip fare embriyonik fibroblast (MEF) hücreleri mock-enfekte veya MP-12 veya rMP12-moi 3 C13type (C13type) ile enfekte edildi. Total RNA Trizol (Invitrogen) ve Kuzey b kullanarak HPI 7 toplandıçok fare endojen ISG56 mRNA veya MP-12 N mRNA / anti-viral-sense G-segmentinde 2,30 özgü digoxigenin etiketli RNA prob kullanılarak yapıldı. Fare ISG56 mRNA'nın endojen veya RVFV K mRNA / anti-viral-sense S-segment için problar yapmak için, astar tarafından amplifiye PCR parçaları KpnmISG56F (GGG TGG TAC CGC TTK ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG) ve HindmISG56 (TAC AAA GCT TAT GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG) ISG56 mRNA veya KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA GCT TGC G) ve RVFV için HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG) N mRNA / anti-viral-sense S-segment KPN ile sindirilir ve Hind III ve içine bağlandı pSPT18 plazmid (digoxigenin ile etiketlenmiş Roche. Sonra RNA probları DIG RNA Etiketleme Kiti (SP6/T7) (Roche tarafından sentezlenir. Cat # 1 175 025) Ayrıca her numunenin 28S rRNA seviyesi kontrolü yükleme gibi gösterilir. C13type indüklenen ISG56 mRNA sentezi ile enfekte Wild-tip MEF hücreleri, bu ise MP ile enfekte-12 C13type enfekte olan hücreleri ana transkripsiyon bastırma eksikliği düşündüren, onu ikna etmedi. Şekil 6 SEAP yöntemi ile elde edilen verilerin tutarlı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RVFV için genetik sistemleri Ters T7 organizatörü 2,4,5 veya 3 fare veya insan 4 pol-I organizatörü kullanılarak çeşitli gruplar tarafından geliştirilmiştir. Bu yazıda, rekombinant RVFV MP-12 suşları, 15 stabil bir şekilde ifade T7 RNA polimeraz BHK/T7-9 hücreleri kullanarak oluşturmak için bir protokol açıklar. BHK/T7-9 hücrelerin durumuna göre farklılıklar viral geri kazanım verimliliği, plazmid miktarı, transfekte hücreleri ve benzeri numarası. Biz her zaman, deneyler için yüksek titresi virüs stoklarını elde etmek için Vero E6 hücreleri P0 virüs yükseltmek. NSS tip I IFN veya PKR de dahil olmak üzere inhibe antiviral faaliyetleri etkin bir viral replikasyon desteği sağlama fonksiyonu, insan akciğer diploid (MRC-5) hücreler olarak Tip-I IFN-yetkili hücrelerin viral amplifikasyonu için kullanılan olabilir.
Plak testi MP-12 ve NSS mutantlar titre için oldukça yararlı bir yöntem. Için genel bir önlem olarakplak tahlil hücreler hemen viral inocula çıkarılmasından sonra uygun sıcaklıkta kaplama ile ilave edilmelidir. Kristal viyole boyama, C13type virüs Vero E6 hücreler 2 tek tabaka bozabilir çünkü C13type virüs plaklar tespit etmek için uygun değildir. Diğer taraftan, nötr kırmızı boyama başarıyla C13type virüs tarafından oluşan plaklar tespit olabilir. Nötr kırmızı hücre boyama gücü göreli olarak katılması, canlı hücrelerin içine nötr kırmızı boya ile belirlenir. Bu nedenle, büyük olasılıkla C13type enfekte olan hücreleri enfekte olmamış hücrelerdeki göre nötr kırmızı boya azalma dahil yol açan metabolik aktivite azalması ve zayıf bir boyanma odağı oluşturur. Neutral red gerekli miktarda nötral kırmızı çözüm çok değişir. Nötr kırmızı çözüm Uzun süreli depolama genellikle çökeltiler oluşturur. Ancak, bu ısı erime 55 nötral kırmızı çözüm ° C de 10 dakika ile önlenebilirhücre boyama etkiler.
Deneylerde doğru viral titreye sahip virüsleri kullanmak önemlidir. Viral bir stok titresi vb viral stok sarımsı fenol kırmızı renkli, uzun süreli depolama, tekrarlanan donma-çözülme döngüsünden ve belirtilir pH 6.5 31 altında olan medya tarafından azalma olabilir. Böylece, taze hayvan aşılaması için viral stoğu kullanmak veya sadece deneyden önce tekrar stok titre önemlidir.
NSS ve NSM; RVFV karakterize iki yapısal olmayan proteinleri kodlamak. RVFV eksik NSM hala son derece öldürücü sıçanlarda 33 iken RVFV eksik NSS, hayvanların 25,32 önemli ölçüde zayıflatılmış . Böylece, NSS patogenezinde virülans faktörü olarak önemli bir rol oynar. NSS) dsRNA-dep IFN-beta mRNA sentezini 26 ve 3 baskılanması) bozulması 1) ev sahibi genel transkripsiyon 8, 2 bastırma tetikleyen bir çok işlevli bir proteindirendent protein kinaz (PKR) 9,10. Ebeveyn MP-12 suşu kesilmesi veya mutasyonlar NSS haline getirerek daha da zayıflatılmış olabilir. Diğer taraftan, mutant MP-12 immünojenite korumak da önemlidir. Tip-I IFN, dendritik hücreler, T hücreleri ve B hücreleri 12-14 farklılaşmaları için önemlidir olgunlaşması için bir rol oynar . IFN-beta bastırma fonksiyonu olmayan, tam veya kısmi NSS fonksiyonları muhafaza Çeşitli NSS mutantlar, aşı adayların immünojenite ve güvenlik NSS-aracılı IFN-beta bastırma fonksiyonu etkisini analiz etmek için yararlıdır. RVFV wt ZH548 gerginlik aktive NF-kB, IRF-3 ve AP-1 (Şekil 6), ile enfekte olan hücreleri IFN-beta mRNA sentezi transkripsiyonel seviyesi 7 NSS tarafından bastırıldı ise bilinmektedir. Böylece, tamamen işlevsel NSS 3 ifade MP-12, transcri NF-kB/IRF-3/7-inducible SEAP muhabiri geni mRNA sentezini inhibeptional seviyesi, C13type olarak rekombinant MP-12 eksikliği NSS fonksiyonları SEAP mRNA sentezini (Şekil 7) neden olabilir. Bu mutant immünojenite sonucu doğru anlamak için, fenotipleri, daha ileri hücre kültür sistemi karakterize edilmelidir. Örneğin, viral replikasyon kinetiği, insan akciğer diploid MRC-5 hücre ya da fare embriyonik fibroblast (MEF) hücreleri gibi tip I IFN yetkili hücreleri test edilmelidir. PKR bozulma fonksiyonu, insan ya da fare PKR spesifik antikorların Western Blot ile test edilebilir. NSS mutasyon IFN-beta mRNA indüksiyon insan veya fare IFN-beta mRNA digoxigenin etiketli RNA prob özel Northern blot ile teyit edilmelidir. Host genel transkripsiyon bastırma, doğmakta olan mRNA üridin analog birleşme analiz ederek test edilebilir. Sonunda, aday MP-12 NSS mutantlar immünojenite ve güvenlik farelerde test edilmelidir. Tipik olarak, 1 x 10 5 pfu CandidaPBS içinde seyreltilmesi te aşı subkutan verilen ve sera, 30 (veya 42) gün ve günde 180 retro-orbital sinüs toplanan RVFV N karşı nötralize edici antikor testi nötralize plak azalma (PRNT 80) ve total IgG varlığı için test edilmektedir . IgG ELISA ile Gn / Gc saflaştırılmış Rekombinant viral proteinleri ile kaplı. ABD ters hayvan biyogüvenlik düzeyi (BSL) 4 tesis veya geliştirilmiş BSL3 + tesisi; (ip, 1 x 10 3 pfu örneğin) aşı adayı etkinliği yabani tip ZH501 ile 42 gün sonrası bağışıklama zorlu fareler tarafından test edilmiş olması. genetik yaklaşım, tasarım ve güvenli ve immunojenik canlı zayıflatılmış RVFV aşılar üretmek için güçlü bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Bu çalışma, Hibe sayısı 5 Mükemmellik Batı Bölge Merkezi (WRCE) yoluyla U54 AI057156-07, 1 R01 AI08764301-A1 Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Üniversitesi'nde bir iç finansman Sealy Aşı Geliştirme Merkezi tarafından finanse edildi Texas Medical Branch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR international | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma-Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | Invitrogen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | Invitrogen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | Invitrogen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
