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Immunology and Infection

Usando genética reversa para manipular o NSS Gene do vírus da febre Rift Valley MP-12 Strain para melhorar a segurança e eficácia da vacina

Published: November 1, 2011 doi: 10.3791/3400
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Texas Medical Branch

Summary

O sistema de genética reversa para o vírus da febre Rift Vale cepa vacinal MP-12 é uma ferramenta útil para a criação de adicionais MP-12 mutantes com atenuação aumentada e imunogenicidade. Nós descrevemos o protocolo para gerar e caracterizar NSS cepas mutantes.

Abstract

Vírus da febre Rift Valley (RVFV), que causa febre hemorrágica, distúrbios neurológicos ou cegueira em humanos, e uma alta taxa de aborto e malformação fetal em ruminantes 1, foi classificado como um HHS / USDA sobreposição agente selecionado e um grupo de risco 3 patógeno. Pertence à Phlebovírus gênero no Bunyaviridae família e é um dos membros mais virulenta dessa família. Vários sistemas de genética reversa para a cepa vacinal MP-12 RVFV 2,3, bem como cepas do tipo selvagem RVFV 4-6, incluindo ZH548 e ZH501, têm sido desenvolvidos desde 2006. O MP-12 estirpe (que é um grupo de risco 2 patógeno e um agente não-select) é altamente atenuada por várias mutações em seu M e L-segmentos, mas ainda carrega virulenta segmento S-RNA 3, que codifica uma virulência funcional NSS fator. O rMP12-C13type (C13type) transportando 69% em-frame de eliminação do NSS ORF não tem todas as funções NSS conhecida, enquanto ele replica como effictário como faz MP-12 em células VeroE6 faltando tipo I IFN. NSS induz um shut-off de transcrição de hospedeiros, incluindo interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 e promove a degradação de double-stranded RNA-proteína quinase dependente (PKR) em nível de pós-translacionais. 9,10 IFN-beta é transcricionalmente upregulated por interferon fator de regulação 3 (IRF-3), NF-kB e proteína ativadora-1 (AP-1), ea ligação do IFN-beta para IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) estimula a transcrição de IFN-alpha genes ou de outros genes interferon estimulada (ISGs) 11, que induz actividades de acolhimento antiviral, ao passo que a supressão anfitrião de transcrição incluindo IFN-beta gene pela NSS impede que o gene upregulations daqueles ISGs em resposta a replicação viral, embora IRF-3, NF-kB e ativador proteína-1 (AP-1) pode ser ativado por RVFV7. . Assim, o NSS é um excelente alvo para continuar a atenuar MP-12, e para melhorar a resposta imune inata anfitrião, abolindo a função de supressão de IFN-beta. Aqui, Nós descrevemos um protocolo para a geração de um recombinante MP-12 NSS codificação mutado, e fornecer um exemplo de um método de triagem para identificar mutantes NSS falta a função de suprimir a síntese de IFN-beta mRNA. Além de seu papel essencial na imunidade inata, tipo I IFN é importante para a maturação das células dendríticas e indução de uma resposta imune adaptativa 12-14. Assim, os mutantes NSS induzindo tipo I IFN são mais atenuadas, mas ao mesmo tempo, são mais eficientes na resposta do hospedeiro estimulante imunológico do tipo selvagem MP-12, o que os torna candidatos ideais para abordagens de vacinação.

Protocol

1. Recuperação de recombinantes mutação NSS MP-12 codificação (s) de DNAs plasmídeo 2

  1. Spread rim de hamster bebé (BHK) / T7-9 células 15, que expressa estavelmente T7 RNA polimerase, em 6 cm de pratos em Meio Essencial Mínimo (MEM)-alfa (Invitrogen, Cat # 32561037) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS ), penicilina-estreptomicina (Penicilina: 100 U / ml Estreptomicina: 100 mcg / ml) (Invitrogen, Cat # 15140122), e 600 mg / ml de higromicina B (Cellgro, Cat # 30-240-CR).
    * A eficiência de recuperação viral é mais elevada em 6 cm-pratos do que em 35 mm-pratos. BHK/T7-9 células com baixo nível de passagem de suportar taxas mais altas de recuperação. Alternativamente, outras linhagens de células BHK que expressa estavelmente T7 RNA polimerase pode ser usada 4,5,16,17.
  2. Quando as células atingiram 70-80% confluência, substituir o sobrenadante da cultura com novas MEM alfa-contendo 10% FBS e penicilina-estreptomicina (não contendo higromicina B).

    Células * deve ser transfected dentro de 1 hora após a substituição do meio para evitar a perda de expressão T7 RNA polimerase.
  3. Para a recuperação de RVFV, um conjunto de plasmídeos codificação RNAs genômico viral para full-length expressão do RNA viral, e um segundo conjunto de codificação de gene viral quadros de leitura aberta para expressão da proteína viral (Figuras 1 e 2) são obrigatórios. Prepare uma mistura de plasmids2 seguinte (Figura 2) em um tubo de 1,5 ml:
    1. pProT7-S (+) com a mutação (s) no gene NSS (2 mg): Este plasmídeo codifica o anti-viral senso (sentido positivo) full-length RVFV MP-12 S-segmento ladeado pelo promotor T7 e da hepatite delta virus (HDV) seqüência de ribozima.
    2. pProT7-M (+) (2 mg): Este plasmídeo codifica o anti-viral senso (sentido positivo) full-length RVFV MP-12 M-segmento ladeado pelo promotor T7 e HDV seqüência de ribozima.
    3. pProT7-L (+) (2 mg): Este plasmídeo codifica anti-viral sentido (positivo-sentido) full-length RVFV MP-12 L-segmento flanked pelo promotor T7 e HDV seqüência de ribozima.
    4. PT7-IRES-VN (2 mg): Este plasmídeo codifica a RVFV MP-12 quadro de leitura aberto N (ORF) a jusante do promotor T7 e um vírus encefalomiocardite (EMCV) local de entrada interna ribossomo (IRES).
    5. PT7-IRES-vL (1 mg): Este plasmídeo codifica a RVFV MP-12 L ORF jusante do promotor T7 e uma IRES EMCV.
    6. pCAGGS-vG (1 mg): Este plasmídeo codifica RVFV MP-12 a jusante M ORF do frango promotor beta-actina.
      * A adição de PT7-IRES-VN, PT7-IRES-vL e pCAGGS-VG não é essencial para a recuperação de MP-12, mas aumenta a eficiência de resgate 2. Autores experientes expressão pobre de Gn / Gc usando PT7-IRES plasmídeo, provavelmente devido à falta de verificação de vazamento AUGs por ribossomos. Por isso, construímos pCAGGS-vG para cap-dependente expressão Gn / Gc.

  4. Adicionar 30 ml de Trânsito-LT1 (Mirus, Cat # MIR2300) para 385 ml de Opti-MEM (Invitrogen Cat, # 31985070) em um tubo de 1,5 ml, e brevemente vortex.
  5. Após 5 min de incubação à temperatura ambiente, adicione lentamente o Opti-MEM contendo lipossomas para a mistura de plasmídeo de 1,3 a passo, misture delicadamente por pipetagem e incubar por 15 min em temperatura ambiente.
  6. Adicione a mistura de lipossomas e plasmídeos para o meio de cultura das células BHK/T7-9 de gota a gota passo 1,2 (Figura 3).
  7. Incubar as células transfectadas a 37 ° C em uma incubadora com 5% de CO 2 por 24 h, e substituir o sobrenadante da cultura com novas MEM alfa-contendo 10% FBS e penicilina-estreptomicina (não contendo higromicina B).
  8. Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora com 5% de CO 2 para 4 dias adicionais (incubar por 5 dias no total), e recolher o sobrenadante da cultura em um tubo de 15 ml.

    * O efeito citopático (CPE) observaram aqui não refletem, necessariamente, o resultado da recuperação viral bem sucedida, porque a transfecçãoinduz a morte celular que aparece semelhante ao CPE causadas pela replicação viral RNA ou a síntese de proteínas virais.
  9. Centrifugar o sobrenadante a 2.200 xg a 4 ° C por 5 min.

    * O objetivo desta etapa é a pelota para baixo os detritos celulares do estoque viral. Um balde de centrifugação anti-aerossol é recomendado para maior segurança.
  10. Transfira o sobrenadante para tampa de rosca 5 criotubos ml, e armazenar a passagem 0 (P0) ação de vírus a -80 ° C para uso posterior.

2. Amplificação de P0 vírus

  1. O P0 amostras contêm frequentemente título viral insuficiente para experimentos a jusante 2. Um passo de amplificação em VeroE6 células, que é um clone de macaco verde Africano renal (Vero) células sem a genes IFN-alpha/beta 18,19, aumenta a título de viral até o nível máximo. Alternativamente, outras células faltando tipo I IFN respostas, tais como células Hec1B 20 ou células MEF de IFNAR1 knockout-21 camundongos might ser usados ​​para este passo. Spread VeroE6 células em 10 cm de pratos modificado Dulbecco meio mínimo essencial (DMEM) (Invitrogen, Cat # 11965092), contendo 10% FBS, penicilina-estreptomicina (Penicilina: 100 U / ml Estreptomicina: 100 mg / ml), e incubar a 37 ° C em uma incubadora com 5% de CO 2 até atingirem confluência de 80%.
    * Recombinante MP-12 cepas mutantes de codificação NSS muitas vezes não conseguem replicar eficientemente em tipo I IFN-competente células.
  2. Misture 300 ml de P0 amostras com 2,7 ml de DMEM com 10% de FBS e penicilina-estreptomicina. Remova o meio de cultura das células de 2,1 VeroE6 etapa e substituir com a amostra diluída P0. Incubar a 37 ° C durante 1 h em uma incubadora com 5% de CO 2.
  3. Remover o inóculo e adicione 10 ml de DMEM com 10% de FBS e penicilina estreptomicina para cada prato.
  4. Incubar a 37 ° C por 3 a 4 dias até CPE VeroE6 de células torna-se aparente.
    * Rompimento de monocamada ocorre durante MP-12, infecção whilrecombinante e MP-12 NSS falta, como rMP12-C13type (C13type) (Figura 4), ​​não interrompe a monocamada, mas um número de células mortas flutuando aparecem 2-3 dias após a infecção.
  5. Colheita do sobrenadante menos 3 a 4 dpi, conforme descrito nas seções 1.9) e 1.10), e designar as amostras como E6P1.

3. Titulação de recombinante MP-12 pelo ensaio de placa

  1. Spread VeroE6 células em 6-lamelas.
    * Análise Duplicate por amostra é mais confiável do que a análise única.
  2. Quando as células VeroE6 têm crescido a 80% confluência, prepare-10 diluições de amostras de vírus em DMEM com 10% de FBS e penicilina-estreptomicina até 06/10 como segue:
    • 10 ml de amostra + 990 E6P1 ml de DMEM com 10% de FBS e penicilina-estreptomicina (10 -2 diluição)
    • 100 ml da amostra de 10 -2 + 900 ml de DMEM com 10% de FBS e penicilina-estreptomicina (10 diluição -3)
    • 100mL da amostra de 10 -3 + 900 ml de DMEM com 10% de FBS e penicilina-estreptomicina (10 diluição -4)
    • 100 ml da amostra de 10 -4 + 900 ml de DMEM com 10% de FBS e penicilina-estreptomicina (05/10 diluição)
  3. Aspirar médio da placa de seis poços a partir do passo 3.1 e acrescentar 400 mL de cada diluição (do passo 3.2) para os poços (Figura 3).
  4. Incubar a 37 ° C durante 1 h em uma incubadora com 5% de CO 2.
  5. Durante a incubação, preparar dois tubos de 15 ml para a gelose de cobertura, como segue:
    Um tubo (manter em banho-maria 42 ° C): 7 ml de 1,2% agar nobre (VWR, Cat # 101170-362) em água
    Tubo B (manter em banho-maria 37 ° C): 7 ml de Águia Modificado Medium (MEM 2x) (Invitrogen, Cat # 11935046), contendo 10% FBS, penicilina-estreptomicina (Penicilina: 100 Estreptomicina U / ml: 100 mg / ml), e 10% de fosfato triptose caldo (MP Biomedicals, Cat # 1682149).
  6. Após 1 h de incubação, remova o viralinóculos, e imediatamente adicionar 2 ml por poço de uma mistura 1:1 de tubo A e B do tubo (a partir do passo 3.5).
    * Tome cuidado para adicionar a sobreposição imediatamente como secagem de poços provoca a morte das células não infectadas.
  7. Incubar as placas a 37 ° C por 3 dias em uma incubadora com 5% de CO 2.
  8. Prepare tubo A e B tubo novamente conforme descrito no passo 3.5. Prepare também a 500 mL de solução 0,33% vermelho neutro (Sigma Aldrich, Cat # N2889-100ML) por placa, que também é mantida a 37 ° C banho-maria.
  9. Tubo de mistura A, B e tubo de 500 ml (conc final. 0,011%) de solução de vermelho neutro e adicionar 2 ml da mistura por poço.
    * A quantidade de solução de vermelho neutro para ser adicionado varia de acordo com o lote de solução de vermelho neutro, e otimização inicial é necessária. Armazenamento de longo prazo de 0,33% de solução vermelho neutro provoca precipitação. Nesses casos, o precipitado pode ser dissolvido completamente por incubação a 55 ° C por 10 min seguido de agitação vigorosa. O uso de r neutro precipitadoresultados da solução ed na coloração fraca de células, enquanto re-dissolvido neutro manchas solução de vermelho de células também.
  10. Incubar a placa por 16 h (ou noite) a 37 ° C em uma incubadora com 5% de CO 2.
  11. Contar o número de placas no poço que contém 1-10 placas por poço. Calcular o número de unidades formadoras de placa / ml. Por exemplo, se observarmos 28 placas nos poços inoculados com a diluições 10 -5, 28 (n º de placas) x (1 ml/0.4 ml) x 10 5 (diluição) = 7,0 x 10 6 unidades formadoras de placa (UFP) / ml (Figuras 5).

4. Triagem de mutantes NSS faltando o tipo-I função de supressão de IFN

  1. Spread C57/WT células MEF (InvivoGen, Cat # mef-c57wt), que codifica uma fosfatase alcalina secretada embrionárias (SEAP) induzida pelo gene NF-kB e IRF-07/03 (Figura 6), em 12-lamelas. As células são mantidas em DMEM com 10% de SFB, penicilina-estreptomicina (PeniciLLIN: 100 U / ml Estreptomicina: 100 mcg / ml), Blasticidin S (3 mg / ml), e Zeocin (100 mg / ml).
  2. Quando as células se tornam sub-confluentes (80%), as células são mock-infectados ou infectados com o MP-12 ou recombinante MP-12 mutações de codificação NSS na multiplicidade de infecção (moi), de 3 ou 0,1 (ver secções 2 e 3, a quantidade de cada inóculo deve ser 300 ml). Em 1 h após a infecção, remover os inóculos, e adicionar 1 ml por poço de DMEM com 10% de SFB, penicilina-estreptomicina (Penicilina: 100 U / ml Estreptomicina: 100 mcg / ml) (Blasticidin e Zeocin não são adicionados a esta tempo).
  3. Menos 14 h após a infecção, coletar sobrenadantes de cultura. Adicionar 200 mL de QUANTI-Blue (InvivoGen, Cat # rep-QB1) e 50 ul de cada amostra (em triplicado) para poços de uma placa de 96 poços. Seal e incubar a placa a 37 ° C por 1 h.
    * Ambos MP-12 e MP-12 recombinante NSS falta claramente induzir supressão anfitrião translacional em células IFN-alpha/beta competentes, incluindo a 293 células, as células MRC-5 e EMBR do mouseYonic fibroblastos (MEF) células após 14 horas, a infecção pós-alta moi. Por outro lado, IFN-beta mRNA ou ISG56 mRNA acumula abundantemente em 7-8 horas após a infecção no tipo I IFN células competentes. Assim, optou-se 14 horas após a infecção para recolher o sobrenadante para ver o acúmulo de SEAP induzida pela resposta imune inata.
  4. Ler os valores OD a 650 nm usando um leitor de placa (Figura 7).
    * Os resultados são consistentes com os dados obtidos por Northern blot usando uma sonda de RNA específicas para mRNA do mouse ISG56, que mostra up-regulação do mRNA ISG56 na ausência de expressão NSS (Figura 8).
    * Deve-se notar que a atividade SEAP é determinada pela abundância de proteínas que poderiam ser afetados pela atividade de tradução host. A nível relativo do SEAP não poderá ser elevada em relação ao aumento do nível de mRNA porque SEAP não podem ser sintetizados, mesmo na presença de mRNA SEAP se a tradução celular é SUPPREssed. Northern blot é um ensaio mais simples e de forma mais precisa para avaliar a quantidade de mRNA induzida pela falta de funções NSS nas células infectadas do que o ensaio repórter SEAP. No entanto, o sistema repórter SEAP é mais rápida do Northern blot e, portanto, útil para a detecção rápida de mutantes NSS potencialmente falta anfitrião função de supressão de transcrição.

5. Resultados representativos:

O sistema de genética reversa consistentemente gerado viável recombinante MP-12 vírus com títulos superiores a 1 x 10 6 UFP / ml. Vírus C13type faltando funções NSS formado placas turva grandes, enquanto MP-12 formado placas claras de vários tamanhos 2 (Figura 5). Mock células infectadas pelo MEF C57/WT ou pessoas infectadas com o MP-12 não aumentou o nível de SEAP em sobrenadante de cultura em comparação com mock-células infectadas, enquanto que o sobrenadante de cultura de células infectadas com o MEF C57/WT C13type continha um aumentonível de SEAP por 14 horas após a infecção (hpi) (Figura 7). Estes resultados são consistentes com aqueles obtidos por Northern blot usando uma sonda de RNA específicas para mRNA do mouse ISG56 (Figura 8).

Figura 1
Figura estrutura Genoma 1. RVFV de
RVFV tem um sentido tripartite negativa ou ambisense genoma RNA chamado S, M, L e segmentos. S segmento codifica genes N e NSS de forma ambisense. N mRNA é sintetizado a partir do senso viral (sentido negativo) S-segmento, enquanto NSS mRNA é sintetizado a partir do anti-viral senso (sentido positivo) S-segmento. M-segmento codifica um mRNA M única e sintetiza the78kD, NSM, Gn ou proteínas Gc por varredura com vazamento de AUGs várias ao 5'region de mRNA M, seguido do seu clivagem co-traducional 22,23. L-segmento codifica a proteína L. As proteínas N e L são essenciais para a transcrição e replicação viral, enquanto Gn e Gc são as proteínas do envelope viral. NSS e proteínas NSM são proteínas não estruturais, que não são incorporadas partículas de vírus.

Figura 2
Figura 2.. Desenho de DNA plasmidial para a recuperação de recombinantes MP-12 RVFV tensão
A codificação de cDNA full-length anti-viral sentido-S, M, L ou segmento são cloneddownstream de promotor T7 e upstream de hepatite delta virus (HDV) seqüências de ribozima, designado como pProT7-S (+), pProT7-M (+), ou pProT7-L (+), respectivamente 2. T7 RNA polimerase, expresso em células BHK/T7-9 transcreve a codificação RNA full-length-S, M, L ou segmentos com fim preciso genoma 3 '. O quadro de leitura aberta (ORF) de N ou proteínas L são clonados sob encefalomiocardite vírus (EMCV) local de entrada interna ribossomo (IRES), que são designados como PT7-IRES-VN ou PT7-IRES-vL, respectivamente, para permitir que o sem tampa T7 RNA transcrito para ser reconhecido pelo ribossomos na cap-independênciamaneira dent. A ORF M é clonado, com um promotor de frango b-actina de pCAGGS plasmídeo 24, que é designado como pCAGGS-VG, para permitir a síntese de 78kD, NSM, Gn e Gc proteínas, que são gerados a partir AUGs diferentes, digitalizando leaky 23. Ambos N e proteínas L são necessários para iniciar a transcrição ou replicação do RNA, enquanto que o PT7-IRES-VN e PT7-IRES-vL não são essenciais para a recuperação de recombinantes 2 MP-12, provavelmente devido à expressão presumível fuga de Pol- II-driven capped transcrições RNA de codificação N-ORF e ORF de L-pProT7-S (+) e pProT7-L (+), respectivamente.

Figura 3
Figura 3. Recuperação de RVFV MP-12 a partir de DNA plasmídeo
Transfecção de células com BHK/T7-9 pProT7-S (+), pProT7-M (+), pProT7-L (+), PT7-IRES-VN, PT7-IRES-vL e pCAGGS-vG plasmídeos (Fig.1 ) gera infecciosas recombinante RVFV MP-12 tensão em sobrenadante de culturas. O sobrenadante, 5 dias após transfecção é coletado, e em várias passagens fresco Vero E6 de células para a amplificação viral. Tipicamente, mais de 1 x 10 6 UFP / ml do vírus pode ser recuperado em 3 a 4 dias após a infecção. O vírus amplificado (E6P1 vírus) é titulada usando ensaio de placa com células Vero E6 e utilizado para a análise do fenótipo e estudos de imunogenicidade.

Figura 4
Figura 4. S segmento de MP-12 e rMP12-C13type
A comparação do MP-12 e rMP12-C13type (C13type) S-segmentos. Em comparação com o NSS-12 da MP tensão, a ORF NSS de C13type é truncado em 69%, e é idêntico ao do clone naturalmente isolado 13 estirpe 2,25.

Figura 5
Figura 5. Plaque ensaio para a MP-12 (NSS funcional) e C13type (não-funcionais NSS)
A monocamada de Vero E6 células em um prato 6-bem é usado para ensaio de placa. Após 3 dias de incubação com overlay agar 0,6%, o overlay agar segundo contendo solução de vermelho neutro é adicionado. Então, as placas são contados em dias pós-infecção 4. MP-12 placas claras formas de tamanhos variados, enquanto C13type formas placas turva grande (ou focos). O bem com 1-10 placas devem ser usados ​​para contagem.

Figura 6
Figura 6. Via de ativação da secreção de fosfatase alcalina (SEAP) do gene repórter em células C57/WT MEF
Interferon-beta promotor inclui as seqüências de ligação de AP-1, NF-kB e IRF-3. Replicação ativa RVFV AP-1, NF-kB e IRF-3 7,11. No entanto, o NSS inibir a liberação do complexo repressor do promotor IFN-beta, mesmo após a ligação dos fatores de transcrição, suprimindo assim a síntese de IFN-beta mRNA 26. Além disso, o NSS sequestra TFIIH p44 subunits8 e umlso promove a degradação da p62 TFIIH subunidades 27, induzindo assim uma supressão geral de transcrição de hospedeiros, incluindo IFN-alpha gene e os genes sob o promotor ISRE. C13type ou outros mutantes NSS falta IFN-beta função de supressão de induzir a síntese de IFN-beta, que por sua vez ativa o promotor IFN alfa-interferon e da resposta sensível ao elemento promotor (ISRE). IRF-7 é, então, transcricionalmente regulada por IFN-alpha/beta estimulação e ainda upregulated por IFN-alpha em apoio à IRF-3 28,29. Neste ensaio, as células C57/WT MEF codificar secretado fosfatase alcalina (SEAP) no downstream de uma seqüência artificial ligação do NF-kB, IRF-3 e IRF-7. Assim, os mutantes NSS falta IFN-beta função de supressão upregulate SEAP cuja secreção é então medido.

Figura 7
Figura 7. Indução da SEAP por C13type
Células C57/WT MEF (InvivoGen) foram simuladaInfectados ou infectados com o MP-12 ou rMP12-C13type (C13type) no moi de 3 (painel esquerdo) ou 0,01 (painel direito). Sobrenadantes de cultura (50 mL) com 14 hpi foram misturados com 200 mL de QUANTI-Blue (InvivoGen) substrato em 96 placa bem e os valores de DO a 650 nm foram medidos após 1 h de incubação a 37 ° C por um leitor de placas. O aumento relativo da SEAP para zombar células infectadas são mostrados. Os dados representam a média + / - desvio padrão de três experimentos independentes. O sobrenadante de cultura de células infectadas C13type mostra SEAP aumentou, sugerindo a falta de repressão da transcrição de acolhimento por NSS.

Figura 8
Figura 8. Northern blot com DIG marcado com sonda RNA
Tipo selvagem embrionárias de camundongos de fibroblastos (MEF), as células foram mock-infectados ou infectados com o MP-12 ou rMP12-C13type (C13type) no moi de 3. RNA total foi coletado em 7 hpi usando Trizol (Invitrogen), e do Norte blote foi realizada utilizando sonda marcada com digoxigenina RNA específicos para rato mRNA ISG56 endógena ou MP-12 mRNA N / anti-viral sentido-S-segmento 2,30. Para fazer as sondas para mouse mRNA ISG56 endógena ou RVFV N mRNA / anti-viral sentido-S-segmento, os fragmentos amplificados por PCR o primer conjunto de KpnmISG56F (TGG TAC GGG CGC TCC ACT TTC AGA GCC GCA TTC AAG GAC) e HindmISG56 (TAC AAA GGG GCT TAT TGA AGA GAA TGC TGG TGA CCA GG) para ISG56 mRNA ou KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA TCG TGC G) e HindNR (GGG GCT TTT CAA AGG CTG CTG TCT TGT AAG) para RVFV N mRNA / anti-viral sentido-S-segmento foram digeridos com TMN I e III Hind, e ligados em pSPT18 plasmídeo (sondas Roche. Então RNA marcadas com digoxigenina foram sintetizados usando DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche, Cat # 1 175 025). O 28S rRNA nível de cada amostra também é mostrado como o carregamento de controle. células tipo selvagem MEF infectados com C13type síntese mRNA induzida ISG56, enquanto os infectados com o MP-12 Não induzi-la, sugerindo a ausência de supressão anfitrião transcrição em C13type células infectadas. Os dados são consistentes com os obtidos por ensaio SEAP na Figura 6.

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Discussion

Genética reversa de sistemas para RVFV foram desenvolvidos por vários grupos, utilizando T7 promoter 2,4,5 ou mouse de 3 ou 4 humanos promotor pol-I. Neste manuscrito, nós descrevemos um protocolo para gerar recombinantes RVFV MP-12 linhagens de células usando BHK/T7-9 15 que expressa estavelmente T7 RNA polimerase. A eficiência de recuperação viral variava de acordo com a condição de BHK/T7-9 células, a quantidade de plasmídeos, o número de células transfectadas e assim por diante. Nós sempre ampliar o vírus P0 em Vero E6 de células para obter stocks de vírus de alto título para experimentos. Tipo I IFN-competentes, tais como células diplóides de pulmão humano (MRC-5), as células poderiam ser usadas para a amplificação viral somente quando o NSS função apoiou uma replicação viral eficiente, inibindo atividades antiviral, incluindo tipo I IFN ou PKR.

Um ensaio de placa é um método bastante útil para titulação MP-12 e os mutantes NSS. Como medida de precaução gerais para aensaio de placa bacteriana, as células devem ser imediatamente adicionada com sobreposição à temperatura adequada após a remoção do inóculo viral. Coloração violeta cristal não é adequado para a detecção de placas de vírus C13type, porque o vírus C13type não perturbar a monocamada de células Vero E6 2. Por outro lado, a coloração vermelho neutro pode detectar com sucesso placas formadas por vírus C13type. A força de coloração celular com vermelho neutro é determinada pela incorporação relativa de corante vermelho neutro em células vivas. Assim, é provável que C13type células infectadas têm uma atividade metabólica reduzida, que leva à diminuição da incorporação de corante vermelho neutro em relação ao de células não infectadas, e que forma um foco coloração fraca. A quantidade necessária de vermelho neutro varia de acordo com o lote de solução de vermelho neutro. Armazenamento de longo prazo de solução de vermelho neutro muitas vezes gera precipitados. Isso poderia ser evitado pelo calor de dissolução da solução de vermelho neutro a 55 ° C por 10 min, no entanto,afeta a coloração de células.

É importante o uso de vírus com título viral precisas em experiências. O título em um estoque viral poderia ser diminuído pela mídia com pH abaixo de 6,5 31, que é indicado pela cor amarelada de vermelho de fenol no estoque viral, armazenamento a longo prazo, repetidos ciclos de congelamento e descongelamento e assim por diante. Assim, é importante o uso de ações virais fresco para a vacinação de animais ou titular o estoque novamente pouco antes de experimentar.

RVFV codificam duas proteínas não estruturais caracterizadas; NSS e NSM. O NSS RVFV falta é significativamente atenuado em animais 25,32, enquanto o NSM RVFV falta é ainda altamente virulentas em ratos 33. Assim, o NSS desempenha um papel importante como fator de virulência na patogênese. NSS é uma proteína multifuncional que induz 1) supressão da transcrição anfitrião geral 8, 2) a supressão da síntese de IFN-beta mRNA 26 e 3) degradação de dsRNA-dependent proteína quinase (PKR) 9,10. Os pais MP-12 estirpe poderia estar mais atenuada através da introdução de truncamento ou mutações em NSS. Por outro lado, também é importante para manter a imunogenicidade de tais mutantes MP-12. Tipo I IFN desempenha um papel para a maturação das células dendríticas, que é importante para a diferenciação de células T e B 14/12. NSS vários mutantes sem IFN-beta função de supressão, que mantêm funções NSS total ou parcial, são úteis para analisar o impacto da função de supressão NSS-mediada IFN-beta sobre a imunogenicidade ea segurança de vacinas candidatas. Sabe-se que as células infectadas com RVFV wt tensão ZH548 ativar NF-kB, IRF-3 e AP-1 (Figura 6), enquanto a síntese de IFN-beta mRNA é suprimida pela NSS a nível transcricional 7. Assim, MP-12, que expressa NSS totalmente funcional 3, inibe a síntese de mRNA do gene SEAP NF-kB/IRF-3/7-inducible repórter transcrinível ptional, enquanto recombinante MP-12 funções, tais como falta NSS C13type poderia induzir a síntese de mRNA SEAP (Figura 7). Para entender corretamente o resultado de imunogenicidade dos mutantes, o fenótipo deve ser ainda caracterizada no sistema de cultura celular. Por exemplo, a cinética de replicação viral devem ser testados em células do tipo I IFN competentes, tais como diplóides pulmão humano MRC-5 ou células de fibroblastos de rato embrionárias (MEF) células. A função da degradação PKR pode ser testado por Western blot com anticorpos específicos para PKR humano ou mouse. IFN-beta indução mRNA por mutação NSS deve ser confirmada por Northern blot com RNA marcada com digoxigenina sonda específica para a saúde humana ou o mouse mRNA IFN-beta. Anfitrião supressão de transcrição geral pode ser testado através da análise da incorporação de um análogo de uridina em mRNA nascente. Eventualmente, a imunogenicidade e segurança do candidato MP-12 mutantes NSS deve ser testado em camundongos. Tipicamente, 1 x 10 5 PFU da candidate vacina diluída em PBS é administrada por via subcutânea e soros coletado do seio retro-orbital no dia 30 (ou 42) e de 180 dias são testados para a presença de anticorpos neutralizantes por redução de placas de neutralização de teste (PRNT 80) e IgG total contra RVFV N e Gn / Gc por IgG ELISA revestida com proteínas recombinantes purificadas viral. A eficácia de vacinas candidatas podem ser testadas por ratos desafiador aos 42 dias de imunização post com tipo selvagem ZH501 (por exemplo, ip, 1 x 10 3 PFU) em animais nível de biossegurança (BSL) 4 instalações ou melhorados BSL3 instalação + nos EUA O reverso abordagem genética é uma ferramenta poderosa para projetar e gerar segura e imunogênica vacinas vivas atenuadas RVFV.

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Disclosures

Não temos nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Grant Number 5 U54 AI057156-07 através do Centro Regional de Excelência Ocidental (WRCE), um R01 AI08764301-A1 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, e um financiamento interno do Sealy Center for Vaccine Development da Universidade de Texas Medical Branch.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium (MEM)-alpha Invitrogen 32561037
Dulbecco’s modified minimum essential medium Invitrogen 11965092
Modified Eagle Medium (MEM 2x) Invitrogen 11935046
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Hygromycin B Cellgro 30-240-CR
Tryptose phosphate broth MP Biomedicals 1682149
Noble agar VWR international 101170-362
TransIT-LT1 Mirus Bio LLC MIR2300
Opti-MEM Invitrogen 31985070
Aerosol tight lid Eppendorf C-2223-25
0.33% neutral red solution Sigma-Aldrich N2889-100ML
C57/WT MEF cells Invitrogen mef-c57wt
Blasticidin S Invitrogen Ant-bl-1
Zeocin Invitrogen ant-zn-1
QUANTI-Blue Invitrogen rep-qb1
BHK/T7-9 cells15 Gifu university, Japan
Vero E6 cells ATCC CRL-1586

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References

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Imunologia vírus da febre Rift Valley genética reversa NSS MP-12 o desenvolvimento de vacinas
Usando genética reversa para manipular o NSS Gene do vírus da febre Rift Valley MP-12 Strain para melhorar a segurança e eficácia da vacina
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Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Ikegami, T. Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy. J. Vis. Exp. (57), e3400, doi:10.3791/3400 (2011).

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