Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ved hjelp av revers genetikk å manipulere NSS Gene av Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain å forbedre Vaccine sikkerhet og effekt

Published: November 1, 2011 doi: 10.3791/3400
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Texas Medical Branch

Summary

Den revers genetikk system for Rift Valley fever virus MP-12 vaksinestammen er et nyttig verktøy for å skape ekstra MP-12 mutanter med økt demping og immunogenisitet. Vi beskriver protokollen til å generere og karakterisere NSS mutant stammer.

Abstract

Rift Valley fever virus (RVFV), som forårsaker hemoragisk feber, nevrologiske lidelser eller blindhet hos mennesker, og en høy abort og fosterets misdannelser hos drøvtyggere 1, har blitt klassifisert som et HHS / USDA overlapping velge agent og en risikogruppe 3 patogen. Den tilhører slekten Phlebovirus i familien Bunyaviridae og er en av de mest virulente medlemmene av denne familien. Flere revers genetikk systemer for RVFV MP-12 vaksinestammen 2,3 samt villtype RVFV stammer 4-6, herunder ZH548 og ZH501, har blitt utviklet siden 2006. MP-12 belastning (som er en risiko gruppe 2 patogen og en ikke-velg agent) er svært svekket av flere mutasjoner i M-og L-segmenter, men likevel bærer virulente S-segment 3 RNA, som koder for et funksjonelt virulens faktor, NSS. Den rMP12-C13type (C13type) bærer 69% i-frame sletting av NSS ORF mangler alle de kjente NSS funksjoner, mens det replikeres som efficient som gjør MP-12 i VeroE6 celler mangler type-I IFN. NSS induserer en avstenging av verten transkripsjon herunder interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 og fremmer nedbrytning av dobbel-strandet RNA-avhengig protein kinase (PKR) på posttranslasjonelle nivå. 9,10 IFN-beta er transcriptionally oppregulert med interferon regulerende faktor 3 (IRF-3), NF-kB og aktivator protein-1 (AP-1), og bindingen av IFN-beta til IFN-alpha/beta reseptor (IFNAR) stimulerer transkripsjon av IFN-alfa gener eller andre interferon stimulert gener (ISGs) 11, som induserer vert antiviral aktiviteter, mens host transkripsjon undertrykkelse inkludert IFN-beta genet ved NSS hindrer genet upregulations av de ISGs svar på virusreplikasjon selv om IRF-3, NF-kB og aktivator protein-1 (AP-1) kan aktiveres ved RVFV7. . Dermed er NSS et utmerket mål for ytterligere å dempe MP-12, og for å styrke host medfødte immunresponser ved å avskaffe IFN-beta undertrykkelse funksjon. HerBeskriver vi en protokoll for å generere et rekombinant MP-12 koding mutert NSS, og gi et eksempel på en screening metode for å identifisere NSS mutanter mangler funksjon for å undertrykke IFN-beta mRNA syntese. I tillegg til sin avgjørende rolle i medfødt immunitet, er type-I IFN viktig for modningen av dendrittiske celler og induksjon av en adaptiv immunrespons 12-14. Dermed NSS mutanter inducing type-I IFN er ytterligere svekket, men samtidig er mer effektiv på å stimulere vert immunresponser enn vill-type MP-12, noe som gjør dem ideelle kandidater for vaksinasjon tilnærminger.

Protocol

1. Gjenoppretting av rekombinant MP-12 encoding NSS mutasjon (s) fra plasmid DNAS 2

  1. Spre hamsterunge nyre (BHK) / T7-9 celler 15, som stabilt uttrykke T7 RNA polymerase, inn 6-cm retter i Minimum Essential Medium (MEM)-alpha (Invitrogen, Cat # 32561037) inneholder 10% fetal bovint serum (FBS ), Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 mikrogram / ml) (Invitrogen, Cat # 15140122), og 600 mikrogram / ml av hygromycin B (Cellgro, Cat # 30 x 240 CR).
    * Effektiviteten av viral utvinning er høyere i 6-cm retter enn i 35-mm retter. BHK/T7-9 celler med lav passering nivå støtte høyere forekomst av utvinning. Alternativt kan andre BHK cellelinjer som stabilt uttrykke T7 RNA polymerase kunne brukes 4,5,16,17.
  2. Når cellene har nådd 70-80% confluency, erstatte kultur supernatanten med fersk MEM-alfa inneholder 10% FBS og Penicillin-Streptomycin (som ikke inneholder hygromycin B).

    * Cellene må transfected innen 1 time etter du har byttet medium for å unngå tap av T7 RNA polymerase uttrykk.
  3. For utvinning av RVFV, et sett av plasmider koding viral genomisk RNAS for full-lengde viral RNA uttrykk, og et ekstra sett koding viral genet åpne leserammer for viral protein uttrykk (Figur 1 og 2) er påkrevd. Forbered en blanding av følgende plasmids2 (Figur 2) i en 1,5 ml tube:
    1. pProT7-S (+) med mutasjon (er) i NSS genet (2 mg): Dette plasmid koder anti-viral-sense (positiv-sense) full-lengde RVFV MP-12 S-segmentet flankert av T7 promoter og hepatitt deltaet virus (HDV) Ribozyme sekvens.
    2. pProT7-M (+) (2 mg): Dette plasmid koder anti-viral-sense (positiv-sense) full-lengde RVFV MP-12 M-segmentet flankert av T7 promoter og HDV Ribozyme sekvensen.
    3. pProT7-L (+) (2 mg): Dette plasmid koder anti-viral-sense (positiv-sense) full-lengde RVFV MP-12 L-segmentet FLAnked av T7 promoter og HDV Ribozyme sekvensen.
    4. pT7-IRES-vn (2 mg): Dette plasmid koder RVFV MP-12 N åpne lesing ramme (ORF) nedstrøms T7 promoter og en encephalomyocarditis virus (EMCV) interne ribosomet oppføring hotellet (IRES).
    5. pT7-IRES-VL (1 mg): Dette plasmid koder RVFV MP-12 L ORF nedstrøms T7 promoter og en EMCV IRES.
    6. pCAGGS-VG (1 mg): Dette plasmidet koder RVFV MP-12 M ORF nedstrøms av kylling beta-aktin promoter.
      * Tillegg av pT7-IRES-VN, pT7-IRES-VL og pCAGGS-VG er ikke avgjørende for gjenvinning av MP-12, men det forbedrer effektiviteten av redningen 2. Forfattere opplevd dårlig uttrykk for GN / Gc med pT7-IRES plasmid, sannsynligvis på grunn av mangel på lekk skanning av AUGs av ribosomer. Derfor bygget vi pCAGGS-VG for cap-avhengige GN / Gc uttrykk.

  4. Tilsett 30 ml av Transit-LT1 (Mirus, Cat # MIR2300) til 385 ml Opti-MEM (Invitrogen, Cat # 31985070) i ​​et 1,5 ml tube, og vortex kort.
  5. Etter 5 min inkubasjon ved romtemperatur, sakte legge til Opti-MEM inneholder liposomer til plasmidet blandingen fra trinn 1,3 til, bland forsiktig ved pipettering og inkuberes i 15 minutter ved romtemperatur.
  6. Tilsett blandingen av liposome og plasmider til kulturen medium BHK/T7-9 celler fra trinn 1,2 dråpe for dråpe (figur 3).
  7. Inkuber transfektert cellene ved 37 ° C i en kuvøse med 5% CO 2 for 24 timer, og erstatte den kulturen supernatanten med fersk MEM-alfa inneholder 10% FBS og Penicillin-Streptomycin (som ikke inneholder hygromycin B).
  8. Inkuber cellene ved 37 ° C i en kuvøse med 5% CO 2 for 4 ekstra dager (inkuberes i 5 dager totalt), og samle kulturen supernatants inn i en 15 ml tube.

    * Den cytopathic effekt (CPE) observeres her ikke nødvendigvis et resultat av vellykket viral utvinning, fordi transfeksjoninduserer celledød som ligner CPE forårsaket av viral RNA replikasjon eller viral protein syntese.
  9. Sentrifuger supernatants på 2200 xg ved 4 ° C i 5 min.

    * Hensikten med dette trinnet er å pellet ned mobilnettet rusk fra viral lager. En aerosol-tight sentrifuge bøtte anbefales for økt sikkerhet.
  10. Overfør supernatants inn skrue-cap 5 ml cryotubes, og lagre passasjen 0 (P0) virus lager ved -80 ° C for videre bruk.

2. Forsterkning av P0 virus

  1. Den P0 Prøvene inneholder ofte utilstrekkelig viral titer for nedstrøms eksperimenter 2. En forsterkning skritt i VeroE6 celler, som er en klone av afrikanske grønne aper nyre (Vero) celler mangler IFN-alpha/beta genene 18,19, øker viral titer opp til maksimalt nivå. Alternativt kan andre celler mangler type-I IFN tiltak som for eksempel Hec1B celler 20 eller MEF celler fra IFNAR1-knockout mus 21 might brukes til dette trinnet. Spre VeroE6 celler til 10 cm retter i Dulbecco modifiserte minimum viktig medium (DMEM) (Invitrogen, Cat # 11965092) inneholder 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 mg / ml), og inkuber ved 37 ° C i en kuvøse med 5% CO 2 før de når 80% confluency.
    * Rekombinant MP-12 stammer koding mutant NSS ofte ikke klarer å gjenskape effektivt i type-I IFN-kompetente celler.
  2. Bland 300 ml av P0 prøver med 2,7 ml DMEM med 10% FBS og Penicillin-Streptomycin. Fjern kultur medium fra VeroE6 cellene fra trinn 2,1 og erstatte med fortynnet P0 prøven. Inkuber ved 37 ° C i 1 time i en kuvøse med 5% CO 2.
  3. Fjern inocula og tilsett 10 ml DMEM med 10% FBS og Penicillin-Streptomycin til hver rett.
  4. Inkuber ved 37 ° C i 3 til 4 dager før CPE av VeroE6 cellene blir tydelig.
    * Forstyrrelse av monolayer oppstår under MP-12 infeksjon, while rekombinant MP-12 mangler NSS, som rMP12-C13type (C13type) (figur 4), ikke forstyrrer ikke monolayer, men en rekke døde flytende celler synes 2 til 3 dager etter smitte.
  5. Høste supernatanten på 3 til 4 ppt, som beskrevet i avsnitt 1.9) og 1.10), og utpeke de prøvene som E6P1.

3. Titrering av rekombinant MP-12 ved plakk analysen

  1. Spre VeroE6 celler inn i 6-brønn plater.
    * Duplicate analyser per prøve er mer pålitelige enn én analyse.
  2. Når VeroE6 cellene har vokst til 80% confluency, forberede 10-fold serielle fortynninger av virus prøver i DMEM med 10% FBS og Penicillin-Streptomycin opp til 10-6 som følger:
    • 10 mL av E6P1 sample + 990 ml DMEM med 10% FBS og Penicillin-Streptomycin (10 -2 fortynning)
    • 100 mL av 10 -2 sample + 900 ml DMEM med 10% FBS og Penicillin-Streptomycin (10 -3 fortynning)
    • 100mL av 10 -3 sample + 900 ml DMEM med 10% FBS og Penicillin-Streptomycin (10 -4 fortynning)
    • 100 mL av 10 -4 sample + 900 ml DMEM med 10% FBS og Penicillin-Streptomycin (10-5 fortynning)
  3. Aspirer medium fra seks-brønns plate fra trinn 3,1 og tilsett 400 mL av hver fortynning (fra trinn 3.2) i brønnene (figur 3).
  4. Inkuber ved 37 ° C i 1 time i en kuvøse med 5% CO 2.
  5. Under inkubasjon forberede to 15 ml rør for agar-overlay som følger:
    Tube A (holde i 42 ° C vannbad): 7 ml 1,2% edel agar (VWR, Cat # 101170-362) i vann
    Tube B (holde i 37 ° C vannbad): 7 ml Modified Eagle Medium (MEM 2x) (Invitrogen, Cat # 11935046) inneholder 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 mikrogram / ml), og 10% Tryptose fosfat kjøttkraft (MP biomedicals, Cat # 1682149).
  6. Etter 1 t inkubasjon, fjerne viralinocula, og straks tilsett 2 ml per brønn av en 1:1 blanding av rør A og tube B (fra trinn 3,5).
    * Pass på å legge til overlegget umiddelbart som tørking opp av brønner forårsaker død infiserte celler.
  7. Inkuber skålene ved 37 ° C i 3 dager i en kuvøse med 5% CO 2.
  8. Forbered tube A og rør B igjen som beskrevet i trinn 3.5. Forbered også 500 mL av 0,33% nøytral rød-løsning (Sigma Aldrich, Cat # N2889-100ML) per plate som også holdes på 37 ° C vannbad.
  9. Mix tube A, tube B og 500 ml (endelig kons. 0,011%) av nøytrale røde løsning og tilsett 2 ml av blandingen per brønn.
    * Mengden av nøytrale rødt løsning å bli lagt varierer med den mye nøytral rød løsning, og initial optimalisering er nødvendig. Langtidslagring på 0,33% nøytral rød løsning årsaker nedbør. I slike tilfeller kan fremskynde være helt oppløst ved inkubering ved 55 ° C i 10 min etterfulgt av kraftig risting. Bruken av utfelt nøytral red løsning resulterer i svak farging av celler, mens re-oppløst nøytral røde løsning flekker celler godt.
  10. Inkuber platen for 16 h (eller over natten) ved 37 ° C i en kuvøse med 5% CO 2.
  11. Tell antall plakk i brønnen som inneholder 10-100 plaques per brønn. Beregne antall plakk forming units / ml. For eksempel hvis vi observerer 28 plaketter i brønnene inokulert med 10 -5 fortynninger, 28 (# av plakk) x (1 ml/0.4 ml) x 10 5 (fortynning) = 7,0 x 10 6 plaque forming units (PFU) / ml (figur 5).

Fire. Screening av NSS mutanter som mangler type-I IFN undertrykkelse funksjon

  1. Spre C57/WT MEF celler (InvivoGen, Cat # MEF-c57wt), som kode et utskilt embryonale alkalisk fosfatase (SEAP) genet induserbar av NF-kB og IRF-3 / 7 (figur 6), inn i 12-brønn plater. Cellene er opprettholdt i DMEM med 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 mikrogram / ml), Blasticidin S (3 mg / ml), og Zeocin (100 mikrogram / ml).
  2. Når cellene blir sub-confluent (80%), celler er mock-smittet eller infisert med MP-12 eller rekombinant MP-12 koding NSS mutasjoner på mangfaldet av infeksjon (Moi) av 3 eller 0,1 (se pkt. 2 og 3, mengde hvert podestoff bør være 300 mL). På 1 t innlegg infeksjon, fjerne inocula, og tilsett 1 ml per brønn DMEM med 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 mikrogram / ml) (Blasticidin og Zeocin ikke er lagt på dette tid).
  3. På 14 timer etter infeksjonen, samle kulturen supernatants. Tilsett 200 mL av mengdene Blue (InvivoGen, Cat # rep-QB1) og 50 mL av hver prøve (i tre eksemplarer) til brønner på en 96-brønns plate. Seal og inkuber platen ved 37 ° C for 1 h.
    * Både MP-12 og rekombinant MP-12 mangler NSS klart indusere vert translasjonsforskning undertrykkelse i IFN-alpha/beta kompetente celler, inkludert 293 celler, MRC-5 celler og mus embryonic fibroblast (MEF) celler etter 14 timer etter infeksjon ved høye Moi. På den annen side, akkumulerer IFN-beta mRNA eller ISG56 mRNA rikelig ved 7 til 8 timer etter infeksjon i type-I IFN kompetente celler. Derfor valgte vi 14 timer etter infeksjonen å samle supernatants å se akkumulering av SEAP indusert av medfødte immunreaksjoner.
  4. Les OD verdiene ved 650 nm ved hjelp av en plateavleseren (figur 7).
    * Resultatene er konsistent med data innhentet ved Northern blot hjelp av en RNA probe som er spesifikk for mus ISG56 mRNA, som viser oppregulering av ISG56 mRNA i fravær av NSS uttrykk (Figur 8).
    * Det bør bemerkes at SEAP aktiviteten bestemmes av overflod av proteiner som kan bli berørt av vert oversettelse aktivitet. En relativ nivå SEAP kanskje ikke være høye i forhold til den økte nivået av mRNA fordi SEAP ikke kan syntetiseres, selv i nærvær av SEAP mRNA hvis cellular oversettelsen er suppressed. Northern blot er en mer enkel analyse og en mer nøyaktig måte å vurdere mengden av mRNA indusert av mangel på NSS funksjoner i infiserte celler enn SEAP reporter analysen. Imidlertid er SEAP reporter systemet raskere enn Northern blot og dermed nyttig for rask screening av NSS mutanter potensielt mangler vert transkripsjon undertrykkelse funksjon.

5. Representant Resultater:

Den revers genetikk system konsekvent generert levedyktig rekombinant MP-12 virus med titer høyere enn 1 x 10 6 PFU / ml. C13type virus mangler NSS funksjoner dannet store grumset plaketter, mens MP-12 dannet tydelige plakk i ulike størrelser 2 (figur 5). Mock-infiserte C57/WT MEF celler eller de som blir smittet med MP-12 har ikke øker nivået av SEAP i kultur supernatanten sammenlignet med mock-infiserte celler, mens kulturen supernatanten av C57/WT MEF celler infisert med C13type inneholdt en øktnivå av SEAP med 14 timer etter infeksjon (HPI) (figur 7). Disse resultatene er konsistente med de som oppnås ved Northern blot hjelp av en RNA probe som er spesifikk for mus ISG56 mRNA (Figur 8).

Figur 1
Figur 1. Genome struktur RVFV
RVFV har en tredelt negativ-sense eller ambisense RNA genom som heter S-, M-og L-segmentet. S-segmentet koder N og NSS gener i en ambisense måte. N mRNA er syntetisert fra viral-sense (negativ forstand) S-segmentet, mens NSS mRNA er syntetisert fra anti-viral-sense (positiv-sense) S-segmentet. M-segmentet koder for et enkelt M mRNA og syntese the78kD, NSM, GN eller Gc proteiner ved utett skanning av flere AUGs ved 5'region av M mRNA, etterfulgt av sin co-translasjonell cleavage 22,23. L-segmentet koder L protein. Både N og L proteiner er avgjørende for viral transkripsjon og replikasjon, mens GN og Gc er viruskapselen proteiner. NSS og NSM proteiner er nonstructural proteiner, som ikke er innlemmet i viruspartikler.

Figur 2
Figur 2.. Design av plasmid DNA for gjenvinning av rekombinant RVFV MP-12 påkjenning
Den cDNA encoding full-lengde anti-viral-sense S-, M-eller L-segmentet er cloneddownstream av T7 promoter og oppstrøms av hepatitt delta virus (HDV) Ribozyme sekvenser, utpekt som pProT7-S (+), pProT7-M (+), eller pProT7-L (+), henholdsvis 2. T7 RNA polymerase uttrykt i BHK/T7-9 celler transcribes RNA koding full-lengde S-, M-eller L-segmentet med presis genomet 3 'enden. Den åpne lesing rammen (ORF) av N eller L proteiner er klonet i henhold encephalomyocarditis virus (EMCV) interne ribosomet oppføring hotellet (IRES), som er utpekt som pT7-IRES-VN eller pT7-IRES-VL, henholdsvis, slik at Uncapped T7 RNA transkripsjon å bli gjenkjent av ribosomer i cap-uavbulk måte. M ORF er klonet i henhold kylling b-aktin pådriver for pCAGGS plasmid 24, som er utpekt som pCAGGS-VG, å tillate syntese av 78kD, NSM, GN og Gc proteiner, som er generert fra ulike AUGs ved utett skanne 23. Både N og L proteiner er nødvendige for å initiere transkripsjon eller RNA replikering, mens pT7-IRES-VN og pT7-IRES-VL er ikke avgjørende for gjenvinning av rekombinant MP-12 2, sannsynligvis på grunn av presumable lekk uttrykk for Pol- II-drevet capped RNA transkripsjoner koding N-ORF og L-ORF fra pProT7-S (+) og pProT7-L (+), henholdsvis.

Figur 3
Figur 3. Gjenoppretting av RVFV MP-12 fra plasmid DNA
Transfeksjon av BHK/T7-9 celler med pProT7-S (+), pProT7-M (+), pProT7-L (+), pT7-IRES-VN, pT7-IRES-VL og pCAGGS-VG plasmider (Fig.1 ) genererer infeksiøs rekombinant RVFV MP-12 belastningen i kultur supernatants. Supernatanten ved 5 dag etter transfeksjon samles, og passaged til frisk Vero E6 celler for viral forsterkning. Vanligvis kan mer enn 1 x 10 6 PFU / ml av virus gjenvinnes på 3 til 4 dager etter smitte. Den forsterkede virus (E6P1 virus) titreres ved hjelp av plakk analysen med Vero E6 celler og brukes til fenotype analyse og immunogenisitetsstudier.

Figur 4
Figur 4. S-segmentet av MP-12 og rMP12-C13type
Sammenligningen av MP-12 og rMP12-C13type (C13type) S-segmenter. Sammenlignet med NSS av MP-12 belastning, er NSS ORF av C13type avkortet med 69%, og er identisk med naturlig isolerte klone 13 påkjenning 2,25.

Figur 5
Figur 5. Plakk assay for MP-12 (funksjonell NSS) og C13type (ikke-funksjonelle NSS)
Den monolayer av Vero E6 celler i en 6-brønns plate blir brukt for plakk analysen. Etter 3 dagers inkubasjon med 0,6% agar overlegg, den andre agar overlay inneholder nøytral rød løsningen er lagt til. Deretter er plaketter telles på dag 4 etter infeksjon. MP-12 former klare plaques varierte størrelser, mens C13type danner store grumsete plaketter (eller foci). Brønnen med 10-100 plaques bør brukes for telling.

Figur 6
Figur 6. Aktivering vei av utskilles alkalisk fosfatase (SEAP) reporter genet i C57/WT MEF celler
Interferon-beta promoter inkluderer bindende sekvenser av AP-1, NF-kB og IRF-3. RVFV replikering aktiverer AP-1, NF-kB og IRF-3 7,11. Men NSS hemme frigjøring av repressor komplekse fra IFN-beta promoter selv etter binding av de transkripsjonsfaktorer, og dermed undertrykker syntesen av IFN-beta mRNA 26. Videre NSS sequesters TFIIH P44 subunits8 og enLSO fremmer nedbrytning av TFIIH p62 subenheter 27, og dermed indusere en generell vert transkripsjon undertrykkelse inkludert IFN-alfa genet og gener under ISRE arrangøren. C13type eller andre NSS mutanter mangler IFN-beta undertrykkelse funksjon indusere IFN-beta syntese, som igjen aktiverer IFN-alfa promoter og interferon-sensitive respons element (ISRE) promoter. IRF-7 er da transcriptionally oppregulert ved IFN-alpha/beta stimulering og videre oppregulert ved IFN-alfa til støtte for IRF-3 28,29. I denne analysen, C57/WT MEF celler kode secreted alkalisk fosfatase (SEAP) på nedstrøms en kunstig binding sekvens av NF-kB, IRF-3 og IRF-7. Dermed NSS mutanter mangler IFN-beta undertrykkelse funksjon upregulate SEAP hvis sekresjon er så målt.

Figur 7
Figur 7. Induksjon av SEAP ved C13type
C57/WT MEF celler (InvivoGen) var mock-Smittet eller infisert med MP-12 eller rMP12-C13type (C13type) på Moi av 3 (venstre panel) eller 0.01 (høyre panel). Kultur supernatants (50 mL) ved 14 HPI ble blandet med 200 mL av mengdene Blue (InvivoGen) substrat i 96 bra plate, og OD verdiene ved 650 nm ble målt etter 1 t inkubasjon ved 37 ° C med en plate leser. Den relative økning av SEAP til mock-infiserte celler er vist. Dataene representerer gjennomsnittet + / - standardavvik av tre uavhengige eksperimenter. Kulturen supernatant fra C13type-infiserte celler viser økt SEAP, tyder på mangel på verten transkripsjon undertrykking av NSS.

Figur 8
Figur 8. Northern blot med DIG-merket RNA probe
Wild-type mus embryonale fibroblast (MEF) celler var mock-smittet eller infisert med MP-12 eller rMP12-C13type (C13type) på Moi på 3. Total RNA ble samlet inn ved 7 HPI ved bruk Trizol (Invitrogen), og Nord-bMye ble utført ved å bruke digoxigenin-merket RNA probe som er spesifikk for mus endogent ISG56 mRNA eller MP-12 N mRNA / anti-viral-sense S-segment 2,30. For å gjøre prober for musen endogene ISG56 mRNA eller RVFV N mRNA / anti-viral-sense S-segmentet, PCR fragmenter forsterket av primer sett av KpnmISG56F (GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG) og HindmISG56 (TAC AAA GCT TAT GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG) for ISG56 mRNA eller KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA GCT TGC G) og HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG) for RVFV N mRNA / anti-viral-sense S-segmentet var fordøyd med KPN Jeg og Hind III, og ligated inn pSPT18 plasmid (Roche. Da RNA prober merket med digoxigenin ble syntetisert ved bruk av DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche, Cat # 1 175 025). Det 28S rRNA nivå av hver prøve er også vist som lasting kontroll. Wild-type MEF celler infisert med C13type indusert ISG56 mRNA syntese, mens de som blir smittet med MP-12 Induserte ikke det, tyder på mangel på verten transkripsjon undertrykkelse i C13type-infiserte celler. Dataene er konsistente med de som oppnås ved SEAP analysen i figur 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Revers genetikk systemer for RVFV har blitt utviklet av flere grupper ved å utnytte T7 promoter 2,4,5 eller mus 3 eller human fire pol-I promoter. I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll for å generere rekombinant RVFV MP-12 stammer ved hjelp BHK/T7-9 celler 15 som stabilt uttrykke T7 RNA polymerase. Effektiviteten av viral utvinning varierte avhengig av tilstanden til BHK/T7-9 celler, mengden av plasmider, antall transfektert celler og så videre. Vi har alltid forsterke P0 viruset i Vero E6 cellene å oppnå høy titer virus aksjer for eksperimenter. Type-I IFN-kompetente celler slik som humant lunge diploide (MRC-5) celler kan brukes for viral forsterkning kun når NSS-funksjonen støttes en effektiv viral replikasjon ved å hemme antiviral aktiviteter som type-I IFN eller PKR.

En plakett-analysen er en ganske nyttig metode for titrering MP-12 og NSS mutanter. Som en generell forholdsregel forplakk analyse, bør cellene umiddelbart lagt med overlegg på riktig temperatur etter fjerning av viral inocula. Krystallfiolett farging er ikke egnet for å oppdage C13type virus plaketter, fordi C13type viruset ikke forstyrre monolayer av Vero E6 celler 2. På den annen side, kunne nøytral røde flekker hell detektere plakk dannes ved C13type virus. Styrken i cellulære farging med nøytral rød bestemmes av relative inkorporering av nøytral rødt fargestoff inn i levende celler. Dermed er det sannsynlig at C13type-infiserte celler har en redusert metabolsk aktivitet som fører til nedsatt inkorporering av nøytral rødt fargestoff sammenlignet med friske celler, og som danner en svak misfarging fokus. Den nødvendige mengden av nøytrale rødt varierer fra mye nøytral rød løsning. Langtidslagring av nøytrale røde løsning genererer ofte bunnfall. Dette kan forebygges ved varme-oppløsning av nøytral rødt løsning ved 55 ° C i 10 min, men detpåvirker farging av celler.

Det er viktig å bruke virus med nøyaktig viral titer i eksperimenter. Den titer i en viral lager kunne være redusert med media med pH under 6.5 31 som er indikert med gulaktig farge av fenol rødt i viral lager, langsiktig lagring, gjentatte fryse-tine sykluser og så videre. Derfor er det viktig å bruke frisk viral lager for animalsk vaksinasjon eller titrere lager igjen like før forsøket.

RVFV kode to karakterisert nonstructural proteiner, NSS og NSM. Den RVFV mangler NSS er betydelig svekket i dyr 25,32, mens RVFV mangler NSM er fortsatt svært virulente hos rotter 33. Dermed spiller NSS en viktig rolle som virulens faktor i patogenesen. NSS er et multifunksjonelt protein som induserer 1) undertrykkelse av host generell transkripsjon 8, 2) undertrykkelse av IFN-beta mRNA syntese 26 og 3) nedbrytning av dsRNA-dependent protein kinase (PKR) 9,10. Foreldrenes MP-12 stamme kunne bli ytterligere svekket ved innføring av trunkering eller mutasjoner i NSS. På den annen side er det også viktig å opprettholde immunogenisiteten av slike muterte MP-12. Type-I IFN spiller en rolle for modningen av dendrittiske celler, som er viktig for differensiering av T-celler og B-celler 12-14. Ulike NSS mutanter mangler IFN-beta undertrykkelse funksjon, som opprettholder full eller delvis NSS-funksjoner, er nyttig å analysere virkningen av NSS-mediert IFN-beta undertrykking funksjon på immunogenisitet og sikkerhet av vaksine kandidater. Det er kjent at celler infisert med RVFV WT ZH548 belastning aktivere NF-kB, IRF-3, og AP-1 (figur 6), mens IFN-beta mRNA syntese er undertrykt av NSS på transcriptional nivå 7. Dermed hemmer MP-12, som uttrykker fullt funksjonelle NSS 3, syntesen av NF-kB/IRF-3/7-inducible SEAP reporter genet mRNA ved transcriptional nivå, mens rekombinant MP-12 mangler NSS funksjoner som C13type kan indusere SEAP mRNA syntese (figur 7). For å riktig forstå resultatet av immunogenisitet av slike mutanter bør fenotyper bli ytterligere preget i cellekultur system. For eksempel bør virusreplikasjon kinetikken testes i type I IFN kompetente celler som menneskelige lunge diploide MRC-5 celler eller mus embryonale fibroblast (MEF) celler. Den PKR fornedrelse funksjonen kan testes ved Western blot med antistoffer som er spesifikke for human eller mus PKR. IFN-beta mRNA induksjon ved NSS mutasjon bør bekreftes ved Northern blot med digoxigenin-merket RNA probe som er spesifikke for human eller mus IFN-beta mRNA. Host generelle transkripsjon undertrykkelse kan testes ved å analysere inkorporering av en uridine analog inn begynnende mRNA. Til slutt bør immunogenisiteten og sikkerhet kandidat MP-12 NSS mutanter bli testet på mus. Vanligvis, 1 x 10 5 PFU av candidaTe vaksine fortynnet i PBS gis subkutant og sera hentet fra retro-orbital sinus på dag 30 (eller 42) og dag 180 testes for tilstedeværelse av nøytraliserende antistoffer av plakk reduksjon nøytralisere test (PRNT 80) og total IgG mot RVFV N og GN / Gc av IgG ELISA belagt med renset rekombinante virale proteiner. Effekten av vaksinen kandidater kan testes ved å utfordre mus på 42 dager etter vaksinasjon med villtype ZH501 (f.eks; ip, 1 x 10 3 PFU) på dyr biosikkerhet nivå (BSL) 4 anlegget eller forbedrede BSL3 + anlegget i USA omvendt genetikk tilnærming er et kraftig verktøy for å designe og skape trygge og immunogene levende svekkede RVFV vaksiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Grant Nummer 5 U54 AI057156-07 gjennom Western Regional Center of Excellence (WRCE), 1 R01 AI08764301-A1 fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, og en intern finansiering fra Sealy Center for Vaccine Development ved Universitetet i Texas Medical Branch.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium (MEM)-alpha Invitrogen 32561037
Dulbecco’s modified minimum essential medium Invitrogen 11965092
Modified Eagle Medium (MEM 2x) Invitrogen 11935046
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Hygromycin B Cellgro 30-240-CR
Tryptose phosphate broth MP Biomedicals 1682149
Noble agar VWR international 101170-362
TransIT-LT1 Mirus Bio LLC MIR2300
Opti-MEM Invitrogen 31985070
Aerosol tight lid Eppendorf C-2223-25
0.33% neutral red solution Sigma-Aldrich N2889-100ML
C57/WT MEF cells Invitrogen mef-c57wt
Blasticidin S Invitrogen Ant-bl-1
Zeocin Invitrogen ant-zn-1
QUANTI-Blue Invitrogen rep-qb1
BHK/T7-9 cells15 Gifu university, Japan
Vero E6 cells ATCC CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
  2. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
  3. Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
  4. Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
  5. Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
  6. Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
  7. May, N. L. e TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
  8. Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
  9. Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
  10. Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
  11. Bon, A. L. e Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
  12. Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
  13. Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
  14. Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
  15. Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
  16. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  17. Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
  18. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
  19. Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
  20. Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
  21. Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
  22. Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
  23. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  24. Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
  25. Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
  26. Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
  27. Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
  28. Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
  29. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
  30. Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
  31. Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
  32. Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).

Tags

Immunologi Rift Valley fever virus revers genetikk NSS MP-12 vaksineutvikling
Ved hjelp av revers genetikk å manipulere NSS Gene av Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain å forbedre Vaccine sikkerhet og effekt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kalveram, B., Lihoradova, O.,… More

Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Ikegami, T. Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy. J. Vis. Exp. (57), e3400, doi:10.3791/3400 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter