Summary
Die reverse Genetik für die Rift Valley-Fieber-Virus MP-12 Impfstamm ist ein nützliches Werkzeug für die Schaffung zusätzlicher MP-12-Mutanten mit erhöhter Dämpfung und Immunogenität. Wir beschreiben das Protokoll zu erzeugen und zu charakterisieren NSs Mutanten.
Abstract
Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV), die hämorrhagisches Fieber, neurologischen Erkrankungen oder Erblindung bei Menschen, und eine hohe Rate Abtreibung und fetale Missbildungen bei Wiederkäuern 1 bewirkt hat als HHS / USDA eingestuft überschneiden wählen Agent und eine Risikogruppe 3 Erreger. Es gehört zur Gattung Phlebovirus in der Familie Bunyaviridae und ist einer der bösartigsten Mitglieder dieser Familie. Mehrere reversen Genetik-Systeme für den RVFV MP-12 Impfstamm 2,3 sowie Wildtyp-RVFV Stämme 4-6, einschließlich ZH548 und ZH501, seit 2006 entwickelt worden. Der MP-12-Stamm (das ist ein Risiko, Gruppe 2 Erreger und einem Nicht-wählen-Agent) ist stark gedämpft durch mehrere Mutationen im M-und L-Segmente, aber trägt noch virulent S-Segment RNA 3, die eine funktionelle Virulenz kodiert Faktor, NSS. Die rMP12-C13type (C13type) tragen 69% in-frame-Deletion von NSS ORF fehlt allen bekannten NSs Funktionen, während es als effic repliziertient ebenso wie MP-12 in VeroE6 Zellen ohne Typ-I-IFN. NSs induziert eine Abschaltung von Host-Transkription einschließlich Interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 und fördert Abbau von doppelsträngigen RNA-abhängige Proteinkinase (PKR) in der post-translationalen Ebene. 9,10 IFN-beta ist transkriptionell hochreguliert durch Interferon regulatory factor 3 (IRF-3), NF-kB und Aktivator-Protein-1 (AP-1), und die Bindung von IFN-beta zu IFN-alpha/beta Rezeptor (IFNAR) stimuliert die Transkription von IFN-alpha Gene oder anderen Interferon-stimulierten Genen (ISGs) 11, welcher Host antivirale Aktivitäten induziert, während Host Transkription Unterdrückung einschließlich IFN-beta-Gen von NSS verhindert das Gen upregulations dieser ISGs in Reaktion auf die virale Replikation, obwohl IRF-3, NF-kB und Aktivator Protein-1 (AP-1) kann durch RVFV7 aktiviert werden. . So ist NSs ein hervorragendes Ziel weiter dämpfen MP-12 und zum Host angeborenen Immunantwort durch die Abschaffung der IFN-beta Unterdrückung Funktion zu verbessern. HierWir beschreiben ein Protokoll zur Erzeugung eines rekombinanten MP-12-Codierung mutierte NSS und liefern ein Beispiel für ein Screening-Verfahren auf NSS-Mutanten fehlt die Funktion, IFN-beta-mRNA-Synthese zu unterdrücken identifizieren. Zusätzlich zu ihrer wesentlichen Rolle in der angeborenen Immunität, ist der Typ-I IFN für die Reifung von dendritischen Zellen und die Induktion einer adaptiven Immunantwort 12-14 wichtig. So induzieren NSs Mutanten-Typ-I IFN sind weiter abgeschwächt, aber gleichzeitig sind effizienter zu stimulieren Host Immunreaktionen als Wildtyp-MP-12, die sie zu idealen Kandidaten für die Impfung Ansätze macht.
Protocol
1. Rückgewinnung von rekombinanten MP-12-Codierung NSs Mutation (en) von Plasmid-DNA 2
- Spread-Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK) / T7-9-Zellen 15, die stabil exprimieren, T7-RNA-Polymerase, in 6-cm-Schalen in Minimum Essential Medium (MEM)-alpha (Invitrogen, Kat. Nr. 32561037) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS ), Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 pg / ml) (Invitrogen, Kat. Nr. 15140122) und 600 pg / ml Hygromycin B (CellGro, Kat. Nr. 30 bis 240-CR).
* Die Effizienz der viralen Erholung höher ist in 6-cm-Schalen als in 35-mm-Gerichte. BHK/T7-9 Zellen mit niedrigen Gang-Level-Support höhere Erholung. Alternativ können auch andere BHK-Zelllinien, die stabil exprimieren, T7-RNA-Polymerase konnte 4,5,16,17 verwendet werden. - Wenn die Zellen haben 70-80% Konfluenz erreicht, ersetzen Sie den Kulturüberstand mit frischem MEM-alpha mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (nicht mit Hygromycin B).
* Die Zellen sollten transfected innerhalb von 1 Stunde nach dem Austausch des Mediums, den Verlust der T7-RNA-Polymerase Ausdruck zu vermeiden. - Für die Erholung der RVFV, eine Reihe von Plasmiden viralen genomischen RNAs für full-length virale RNA-Expression, und ein zweiter Satz kodiert virale Gen open reading frames für virale Protein-Expression (Abbildungen 1 und 2) sind erforderlich. Bereiten Sie eine Mischung der folgenden plasmids2 (Abbildung 2) in einem 1,5 ml-Tube:
- pProT7-S (+) mit Mutation (en) in der NSS-Gen (2 mg): Dieses Plasmid kodiert für die anti-viral-sense (positive-sense) full-length RVFV MP-12 S-Segment von der T7-Promotor flankiert und das Hepatitis Delta-Virus (HDV) Ribozymsequenz.
- pProT7-M (+) (2 mg): Dieses Plasmid kodiert für die anti-viral-sense (positive-sense) full-length RVFV MP-12 M-Segment durch die T7-Promotor und das HDV-Ribozym-Sequenz flankiert.
- pProT7-L (+) (2 mg): Dieses Plasmid kodiert anti-viral-sense (positive-sense) full-length RVFV MP-12 L-Segment flanked von der T7-Promotor und das HDV-Ribozym-Sequenz.
- pT7-IRES-VN (2 mg): Dieses Plasmid kodiert die RVFV MP-12 N open reading frame (ORF) hinter dem T7-Promotor und eine Encephalomyocarditisvirus (EMCV) interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES).
- pT7-IRES-vL (1 mg): Dieses Plasmid kodiert die RVFV MP-12 L ORF stromabwärts des T7-Promotors und eines EMCV IRES.
- pCAGGS-VG (1 mg): Dieses Plasmid kodiert RVFV MP-12 M ORF hinter dem Huhn beta-Aktin-Promotor.
* Der Zusatz von pT7-IRES-vN, pT7-IRES-vL und pCAGGS-VG ist nicht notwendig für die Verwertung von MP-12, aber es steigert die Effizienz der Rettungs-2. Autoren erfahrene armen Ausdruck Gn / Gc mit pT7-IRES-Plasmid, wahrscheinlich aufgrund des Mangels an undichten Scannen von AUGs von Ribosomen. Deshalb distanzieren wir uns pCAGGS-VG für cap-abhängigen Gn / Gc Ausdruck konstruiert.
- 30 ml Transit-LT1 (Mirus, Kat. Nr. MIR2300) auf 385 ml Opti-MEM (Invitrogen, Cat # 31985070) in einem 1,5 ml-Tube, und kurz vortexen.
- Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur langsam das Opti-MEM mit Liposomen, die Plasmid-Mischung aus Schritt 1,3 bis sanft durch Pipettieren gründlich mischen und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie die Mischung von Liposomen und Plasmide in das Kulturmedium der BHK/T7-9 Zellen aus Schritt 1.2 Tropfen für Tropfen (Abbildung 3).
- Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% CO 2 für 24 h, und ersetzen Sie den Kulturüberstand mit frischem MEM-alpha mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (nicht mit Hygromycin B).
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% CO 2 für 4 weitere Tage (Inkubation für 5 Tage insgesamt), und sammeln die Kulturüberstände in eine 15 ml Tube.
* Die zytopathischen Effekts (CPE) beobachtet hier nicht unbedingt das Ergebnis einer erfolgreichen viralen Erholung, da die TransfektionZelltod, die ähnlich CPE durch virale RNA-Replikation oder virale Proteinsynthese verursacht wird. - Centrifuge die Überstände bei 2.200 xg bei 4 ° C für 5 min.
* Der Zweck dieses Schrittes ist es, Pellet nach der Zelltrümmer von viralen Lager. Ein aerosoldicht Zentrifugenbecher für erhöhte Sicherheit empfohlen. - Die Überstände in Schraubverschluss 5 ml Kryoröhrchen, und speichern Sie die Passage 0 (P0)-Virus Lager bei -80 ° C zur weiteren Verwendung.
2. Verstärkung von P0-Virus
- Die P0 Proben enthalten oft unzureichend Virustiter für nachgeschaltete Experimente 2. Eine Verstärkung Schritt in VeroE6 Zellen, die ein Klon des Affennierenfibroblasten (Vero-Zellen) fehlen die IFN-alpha/beta Gene 18,19 wird, erhöht sich virale Titer bis zum Maximum. Alternativ fehlt anderen Zellen Typ-I-IFN Reaktionen wie Hec1B Zellen 20 oder MEF-Zellen aus IFNAR1-Knockout-Mäusen 21 might für diesen Schritt verwendet werden. Verbreiten Sie VeroE6 Zellen in 10-cm-Schalen in modifizierter Minimum Dulbeccos essential medium (DMEM) (Invitrogen, Kat. Nr. 11965092) mit 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 mg / ml), und inkubieren bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% CO 2, bis sie 80% Konfluenz erreichen.
* Recombinant MP-12-Stämme-Kodierung mutierten NSs oft nicht effizient replizieren in Typ-I-IFN-kompetenten Zellen. - 300 ml P0 Proben mit 2,7 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin. Entfernen Kulturmedium aus dem VeroE6 Zellen aus Schritt 2.1 und ersetzen mit dem verdünnten P0 Probe. Bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator mit 5% CO 2.
- Entfernen Sie die Inokula und 10 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin zu jedem Gericht.
- Bei 37 ° C für 3 bis 4 Tage bis CPE von VeroE6 Zellen sichtbar wird.
* Störung der Monoschicht erfolgt während MP-12-Infektion, while rekombinanten MP-12 fehlt NSS, wie rMP12-C13type (C13type) (Abbildung 4), keine Störung der Monoschicht, aber eine Reihe von toten schwimmenden Zellen erscheinen 2 bis 3 Tage nach der Infektion. - Ernte der Überstand bei 3 bis 4 dpi, wie in den Abschnitten 1,9) und 1,10 beschrieben), und bezeichnen die Proben als E6P1.
3. Titration von rekombinanten MP-12 von Plaque-Assay
- Verbreiten Sie VeroE6 Zellen in 6-well Platten.
* Doppelte Analyse pro Probe ist zuverlässiger als einzige Analyse. - Wenn VeroE6 Zellen haben zu 80% Konfluenz gewachsen, bereiten 10-fache serielle Verdünnungen von Virus-Proben in DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin bis zu 10-6 wie folgt:
- 10 ul E6P1 Probe + 990 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (10 -2 Verdünnung)
- 100 ul von 10 -2 Probe + 900 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (10 -3 Verdünnung)
- 100ul von 10 -3 Probe + 900 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (10 -4 Verdünnung)
- 100 ul von 10 -4 Probe + 900 ml DMEM mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin (10-5 Verdünnung)
- Absaugen Medium aus dem 6-Well-Platte aus Schritt 3.1 und fügen 400 ul jeder Verdünnung (aus Schritt 3.2) in die Vertiefungen (Abbildung 3).
- Bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator mit 5% CO 2.
- Während der Inkubation, bereiten zwei 15-ml-Röhrchen für die Agar-Overlay wie folgt:
Rohr A (halten in 42 ° C Wasserbad): 7 ml von 1,2% edlen Agar (VWR, Kat. Nr. 101170-362) in Wasser
U-Bahn B (keep in 37 ° C Wasserbad): 7 ml Modified Eagle Medium (MEM 2x) (Invitrogen, Kat. Nr. 11935046) mit 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 ug / ml) und 10% Tryptosephosphat Brühe (MP Biomedicals, Kat. Nr. 1682149). - Nach 1 h Inkubation, entfernen Sie den VirusInokula, und sofort 2 ml pro Vertiefung einer 1:1-Mischung von Rohr A und Rohr B (aus Schritt 3.5).
* Achten Sie darauf, um die Überlagerung sofort hinzufügen, wie Austrocknung von Brunnen verursacht den Tod der infizierten Zellen. - Die Inkubation bei 37 ° C für 3 Tage in einem Inkubator mit 5% CO 2.
- Bereiten Rohr A und Rohr B wieder wie in Schritt 3.5 beschrieben. Bereiten Sie auch 500 ul von 0,33% Neutralrot-Lösung (Sigma Aldrich, Kat. Nr. N2889-100ml) pro Platte, die auch bei 37 ° C warmes Wasserbad gehalten wird.
- Mix Rohr A, Rohr B und 500 ml (Endkonzentration. 0,011%) der Neutralrot-Lösung und 2 ml der Mischung pro Vertiefung.
* Die Höhe der Neutralrot-Lösung hinzugefügt werden hängt von der Menge Neutralrot-Lösung und erste Optimierung erforderlich ist. Langzeitlagerung von 0,33% Neutralrot-Lösung zum Niederschlag. In solchen Fällen kann sich der Niederschlag vollständig durch Inkubation bei 55 ° C gelöst für 10 min durch kräftiges Schütteln folgte. Die Verwendung von gefälltem neutral red-Lösung führt zu schwache Färbung der Zellen, während wieder aufgelöst neutral rote Lösung färbt Zellen gut. - Die Platte für 16 h (oder über Nacht) bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% CO 2.
- Zählen Sie die Anzahl der Plaques in den Brunnen, der von 10 bis 100 Plaques pro Well enthält. Berechnen Sie die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten / ml. Zum Beispiel, wenn wir beobachten 28 Plaques in den Gefäßen mit den 10 -5 Verdünnungen, 28 (Anzahl der Plaques) x (1 ml/0.4 ml) x 10 5 (Verdünnung) = 7,0 x 10 6 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) geimpft / ml (Abb. 5).
4. Screening von NSS-Mutanten fehlt der Typ-I-IFN Unterdrückung Funktion
- Verbreiten Sie C57/WT MEF-Zellen (InvivoGen, Kat. Nr. MEF-c57wt), die einen abgesondert embryonalen alkalische Phosphatase (SEAP)-Gen induzierbar durch NF-kB und IRF-7.3 (Abbildung 6) codieren, in 12-Well-Platten. Die Zellen werden in DMEM mit 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penici gepflegtllin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 ug / ml), Blasticidin S (3 mg / ml), und Zeocin (100 pg / ml).
- Wenn Zellen subkonfluenten (80%) werden, sind die Zellen mock-infizierten oder infiziert mit MP-12 oder rekombinante MP-12-Codierung NSs Mutationen an Multiplizität der Infektion (moi) von 3 oder 0,1 (siehe Abschnitte 2 und 3, die Höhe der jeder Inokulum sollte 300 pl werden). Bei 1 h nach der Infektion, entfernen Sie die Inokula, und fügen Sie 1 ml pro Vertiefung DMEM mit 10% FBS, Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 ug / ml) (Blasticidin und Zeocin sind derzeit nicht gegeben Zeit).
- Mit 14 h nach Infektion, sammeln Kulturüberständen. Add 200 ul Quanti-Blue (InvivoGen, Cat # rep-QB1) und 50 ul jeder Probe (in dreifacher Ausfertigung) in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Seal und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 1 h.
* Beide MP-12 und rekombinante MP-12 fehlt NSs deutlich induzieren Host translationale Suppression in IFN-alpha/beta kompetente Zellen, einschließlich 293-Zellen, MRC-5-Zellen und Maus EMBRYonic Fibroblasten (MEF)-Zellen nach 14 Stunden nach der Infektion bei hohen moi. Auf der anderen Seite sammelt sich IFN-beta-mRNA oder mRNA ISG56 reichlich bei 7 bis 8 Stunden nach der Infektion in Typ-I-IFN kompetenten Zellen. So wählten wir 14 Stunden nach der Infektion auf die Überstände zu sammeln, um die Ansammlung von SEAP durch angeborene Immunantwort induziert sehen. - Lesen Sie die OD-Werte bei 650 nm mit einem Platten-Lesegerät (Abbildung 7).
* Die Ergebnisse sind konsistent mit den Daten von Northern Blot unter Verwendung einer RNA-Sonde spezifisch für Maus ISG56 mRNA, die up-Regulierung zeigt der ISG56 mRNA in Abwesenheit von NSS Ausdruck (Abbildung 8).
* Es wird darauf hingewiesen, dass die SEAP-Aktivität durch die Fülle von Proteinen, die von Host-Übersetzung Tätigkeit betroffen sein könnten, bestimmt werden. Eine relative Niveau der SEAP möglicherweise nicht hoch im Vergleich zu dem Anstieg der mRNA, weil SEAP kann nicht einmal in der Gegenwart von SEAP mRNA synthetisiert werden, wenn zelluläre Übersetzung HGAEssed. Northern Blot ist ein einfacher Test und ein genauerer Weg, um die Menge der mRNA durch das Fehlen von NSS-Funktionen in infizierten Zellen als die SEAP Reporter-Assay induzierte bewerten. Allerdings ist die SEAP Reporter-System schneller als Northern-Blot-und damit nützlich für das schnelle Screening von NSS-Mutanten möglicherweise fehlt Host Transkription Unterdrückung funktionieren.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Die reverse Genetik-System konsequent tragfähige rekombinanten MP-12-Viren mit Titern größer als 1 x 10 6 pfu / ml erzeugt. C13type Virus fehlt NSs Funktionen gebildet große trübe Plaques, während MP-12 bildeten klare Plaques in verschiedenen Größen 2 (Abbildung 5). Mock-infizierte C57/WT MEF Zellen oder solche mit MP-12 infiziert nicht zu einer Erhöhung der Ebene der SEAP in Kulturüberstand im Vergleich zu mock-infizierten Zellen, während die Kulturüberstand C57/WT MEF-Zellen mit C13type infiziert enthielt eine erhöhteNiveau der SEAP von 14 Stunden nach der Infektion (hpi) (Abbildung 7). Diese Ergebnisse stimmen mit denen von Northern Blot unter Verwendung einer RNA-Sonde spezifisch für Maus ISG56 mRNA (Abbildung 8).
Abbildung 1. Genome Struktur RVFV
RVFV hat einen dreiseitigen negativen Sinn oder AmbiSense RNA-Genom mit dem Namen S-, M-und L-Segment. S-Segment kodiert N-und NSS-Gene in einem AmbiSense Weise. N-mRNA wird von viralen-sense (negative-sense) S-Segment synthetisiert, während NSs mRNA von anti-viralen-sense (positive-sense) S-Segment synthetisiert wird. M-Segment kodiert für ein einzelnes M mRNA ab und synthetisiert the78kD, NSM, Gn-oder GC-Proteine, die durch undichte Scannen von mehreren AUGs bei 5'region von M-mRNA, die durch ihre Co-translationale Abspaltung 22,23 folgten. L-Segment kodiert für die L-Proteins. Beide N und L-Proteine sind wichtig für die virale Transkription und Replikation, während Gn und Gc der viralen Hüllproteine sind. NSS und NSm Proteine sind strukturelle Proteine, die nicht in Viruspartikeln eingebaut werden.
Abbildung 2.. Design von Plasmid-DNA für die Gewinnung von rekombinanten RVFV MP-12-Stamm
Die cDNA in voller Länge anti-viral-sense S-, M-oder L-Segment sind cloneddownstream der T7-Promotor und vor Hepatitis Delta-Virus (HDV) Ribozymsequenzen, wie pProT7-S (+) gekennzeichnet, pProT7-M (+) oder pProT7-L (+) bzw. 2. T7-RNA-Polymerase in BHK/T7-9 Zellen exprimiert transkribiert die RNA-Kodierung in voller Länge S-, M-oder L-Segment mit präziser Genom 3'-Ende. Der offene Leserahmen (ORF) von N oder L-Proteine sind unter Encephalomyocarditisvirus (EMCV) interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES), die als pT7-IRES-VN oder pT7-IRES-vL bzw. gekennzeichnet sind, kloniert, um die uncapped ermöglichen T7-RNA-Transkript von Ribosomen in cap-unabhängige erkannt werdendent Weise. Die M ORF ist unter Hühnern b-Aktin-Promotor des pCAGGS Plasmid 24, die als pCAGGS-VG bezeichnet wird geklont, um die Synthese von 78kD, NSM, Gn und Gc-Proteine, die aus verschiedenen AUGs durch undichte Scannen 23 sind erzeugten ermöglichen. Beide N und L-Proteine sind für die Initiation der Transkription oder RNA-Replikation benötigt, während die pT7-IRES-vN und pT7-IRES-vL nicht für die Gewinnung von rekombinanten MP-12 2 wesentliche, wahrscheinlich wegen der mutmaßlichen undichten Ausdruck Pol- II-driven capped RNA Transkripte N-ORF und L-ORF aus pProT7-S (+) und pProT7-L (+) bzw..
Abbildung 3. Rückgewinnung von RVFV MP-12 von Plasmid-DNA
Transfektion von Zellen mit BHK/T7-9 pProT7-S (+), pProT7-M (+), pProT7-L (+), pT7-IRES-vN, pT7-IRES-vL und pCAGGS-VG Plasmide (Abb.1 ) erzeugt rekombinanter RVFV MP-12-Stamm in Kulturüberstands. Der Überstand an 5 Tage nach der Transfektion gesammelt und passagiert an die frische Vero E6-Zellen für die virale Verstärkung. In der Regel können mehr als 1 x 10 6 pfu / ml des Virus in 3 bis 4 Tage nach der Infektion wiederhergestellt werden. Die verstärkten Virus (E6P1 Virus) wird durch die Verwendung Plaque-Assay mit Vero E6-Zellen titriert und für Phänotyp-Analyse und Immunogenität Studien.
Abbildung 4. S-Segment der MP-12 und rMP12-C13type
Der Vergleich von MP-12 und rMP12-C13type (C13type) S-Segmenten. Im Vergleich zu NSs der MP-12-Stamm ist der NSS ORF C13type um 69% gekürzt, und ist identisch mit dem von Natur aus isolierten Klon 13 Dehnung 2,25.
Abbildung 5. Plaque-Assay für MP-12 (funktionale NSS) und C13type (nicht-funktionale NSS)
Die Monoschicht von Vero E6 Zellen in einer 6-Well-Platte ist für Plaque-Assay verwendet. Nach 3 Tagen Inkubation mit 0,6% Agar-Overlay, das zweite Agar-Overlay mit Neutralrot-Lösung versetzt. Dann werden Plaques am Tag 4 nach der Infektion gezählt. MP-12 bildet klare Plaques unterschiedlicher Größen, während C13type bildet große trübe Plaques (oder Brennpunkte). Die gut mit 10 bis 100 Plaques sollte zum Zählen verwendet werden.
Abbildung 6. Activation Weg der sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP) Reportergen in C57/WT MEF-Zellen
Interferon-beta Promotor umfasst die bindenden Sequenzen von AP-1, NF-kB und IRF-3. RVFV Replikation aktiviert AP-1, NF-kB und IRF-3 7,11. Allerdings hemmen NSs die Freisetzung von Repressor-Komplex aus der IFN-beta Promotors auch nach der Bindung von denen Transkriptionsfaktoren, damit die Unterdrückung der Synthese von IFN-beta mRNA 26. Darüber hinaus NSs sequesters TFIIH p44 subunits8 und einelso fördert Abbau von p62 TFIIH Untereinheiten 27, induzieren somit eine allgemeine Host-Transkription Unterdrückung einschließlich IFN-alpha-Gen und Gene unter die ISRE Promotor. C13type oder andere NSs Mutanten IFN-beta Unterdrückung Funktion induzieren IFN-beta-Synthese, die wiederum aktiviert die IFN-alpha-Promotor und der Interferon-sensitive Response-Element (ISRE) Promotor. IRF-7 wird dann transkriptionell hochreguliert durch IFN-alpha/beta Stimulation und weitere hochreguliert von IFN-alpha zur Unterstützung von IRF-3 28,29. In diesem Test kodieren C57/WT MEF-Zellen sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP) am stromabwärts eines künstlichen Bindesequenz von NF-kB, IRF-3 und IRF-7. So regulieren die NSS-Mutanten fehlt IFN-beta Unterdrückung Funktion SEAP, deren Sekret wird dann gemessen.
Abbildung 7. Induktion von SEAP durch C13type
C57/WT MEF-Zellen (InvivoGen) wurden mock-Infizierten oder infiziert mit MP-12 oder rMP12-C13type (C13type) bei moi von 3 (links) oder 0,01 (rechtes Bild). Kulturüberstände (50 ul) bei 14 hpi wurden mit 200 ul Quanti-Blue (InvivoGen)-Substrat in 96-Well-Platte und die OD-Werte bei 650 nm gemischt wurden nach 1 h Inkubation bei 37 ° C durch eine Platte Reader gemessen. Die relative Zunahme der SEAP zu Mock-infizierten Zellen gezeigt werden. Die Daten stellen den Mittelwert + / - Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Der Kulturüberstand von C13type-infizierten Zellen zeigt erhöhte SEAP deutet auf das Fehlen von Host-Transkription Unterdrückung von NSS.
Abbildung 8. Northern Blot mit DIG-markierten RNA-Sonde
Wild-Typ embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)-Zellen wurden mock-infizierten oder infiziert mit MP-12 oder rMP12-C13type (C13type) bei moi von 3. Gesamt-RNA wurde bei 7 hpi mit Trizol (Invitrogen) und Northern b gesammeltviel wurde mit Digoxigenin-markierten RNA-Sonde spezifisch für Maus endogenen ISG56 mRNA oder MP-12 N mRNA / anti-viral-sense S-Segment 2,30 durchgeführt. Zur Herstellung der Sonden für die Maus endogenen ISG56 mRNA oder RVFV N mRNA / anti-viral-sense S-Segment, die PCR-Fragmente durch die Primers von KpnmISG56F (GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG) und HindmISG56 gesetzt (TAC AAA GCT TAT GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG) für ISG56 mRNA oder KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA CAA TCA CTA AGA GCT TGC G) und HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG) für RVFV N mRNA / anti-viral-sense S-Segment wurden mit Kpn verdaut I und Hind III und ligiert pSPT18 Plasmid (Roche. Dann RNA-Sonden mit Digoxigenin wurden mit DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche synthetisiert, Cat # 1 175 025). Die 28S rRNA-Ebene der einzelnen Proben wird auch als Ladekontrolle gezeigt. Wildtyp-MEF-Zellen mit C13type induzierte ISG56 mRNA-Synthese infiziert, während diejenigen mit MP infiziert-12 Führte nicht zu er deutet auf das Fehlen von Host-Transkription Unterdrückung in C13type-infizierten Zellen. Die Daten stehen im Einklang mit den von SEAP-Assay in Abbildung 6 erhalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die reverse Genetik für RVFV wurden von mehreren Gruppen wurden durch den Einsatz T7-Promotor 2,4,5 oder Maus 3 oder menschliche 4 pol-I-Promotor entwickelt. In diesem Manuskript, beschreiben wir ein Protokoll zur rekombinanten RVFV MP-12-Stämme mit BHK/T7-9 Zellen 15, die stabil exprimieren, T7-RNA-Polymerase zu erzeugen. Die Effizienz der viralen Erholung variiert je nach Zustand des BHK/T7-9 Zellen, die Menge von Plasmiden, die Anzahl der transfizierten Zellen und so weiter. Wir haben immer verstärken die P0-Virus in Vero E6-Zellen zu hohen Titer Virusstocks für Experimente zu erhalten. Typ-I IFN-kompetenten Zellen wie menschlichen Lunge diploiden (MRC-5) Zellen könnten für die virale Verstärkung nur verwendet werden, wenn die NSS-Funktion eine effiziente Virusvermehrung durch Hemmung antivirale Aktivitäten wie Typ-I-IFN oder PKR unterstützt.
Ein Plaque-Assay ist eine ganz brauchbare Methode zur Titration von MP-12 und den NSS-Mutanten. Als allgemeine Vorsichtsmaßnahme für diePlaque-Assay sollten die Zellen sofort mit Overlay bei der geeigneten Temperatur nach der Entfernung des Virus Inokula hinzugefügt werden. Kristallviolettfärbung ist nicht geeignet für den Nachweis C13type Virus-Plaques, weil C13type Virus nicht stört die Monoschicht von Vero E6 Zellen 2. Auf der anderen Seite könnte neutral-Rot-Färbung erfolgreich erkennen Plaques durch C13type Virus gebildet. Die Stärke der zellulären Färbung mit Neutralrot wird durch die relative Aufnahme von neutralen roten Farbstoff in lebende Zellen bestimmt. So ist es wahrscheinlich, dass C13type-infizierten Zellen eine verminderte Stoffwechselaktivität, die zu einer verminderten Aufnahme von neutralen roten Farbstoff im Vergleich zu der nicht-infizierten Zellen führt haben, und die eine schwache Färbung zu konzentrieren. Die erforderliche Menge an Neutralrot hängt von der Menge Neutralrot-Lösung. Langfristige Speicherung von Neutralrot-Lösung generiert oft ausfällt. Aber es; Dies könnte durch die Hitze-Auflösung von Neutralrot-Lösung bei 55 ° C für 10 min verhindert werdenwirkt sich auf die Färbung von Zellen.
Es ist wichtig, um Viren mit genauen Virustiter in Experimenten verwenden. Der Titer in einem viralen Aktie könnte von den Medien mit pH unter 6,5 31, die durch gelbliche Farbe von Phenolrot in der viralen Lager, langfristige Lagerung, wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen und so weiter angezeigt wird verringert werden. So ist es wichtig, an die frische virale Lager für die Tier-Impfung Nutzung oder titriert die Aktie wieder kurz vor Experiment.
RVFV kodieren zwei strukturelle Proteine charakterisiert, NSS und NSM. Der RVFV fehlt NSS ist deutlich abgeschwächt bei Tieren 25,32, während der RVFV fehlt NSM ist immer noch sehr virulent in Ratten 33. So spielt NSs eine wichtige Rolle als Virulenzfaktor in der Pathogenese. NSS ist ein multifunktionelles Protein, welches 1) Unterdrückung von Host allgemeinen Transkriptionsfaktoren 8, 2 induziert) Unterdrückung der IFN-beta-mRNA-Synthese 26 und 3) Abbau von dsRNA-dependent Proteinkinase (PKR) 9,10. Die elterliche MP-12-Stamm könnte weiter abgeschwächt durch die Einführung Abschneiden oder Mutationen in NSS. Auf der anderen Seite ist es auch wichtig, um die Immunogenität eines solchen mutierten MP-12 zu erhalten. Typ-I IFN spielt eine Rolle für die Reifung von dendritischen Zellen, die wichtig für die Differenzierung von T-Zellen und B-Zellen 12-14. Verschiedene NSs Mutanten IFN-beta Unterdrückung Funktion, die vollständige oder teilweise NSs Funktionen aufrecht zu erhalten, sind nützlich, um die Auswirkungen der NSS-vermittelte IFN-beta Unterdrückung Funktion auf der Immunogenität und Sicherheit des Impfstoffkandidaten untersuchen. Es ist bekannt, dass Zellen mit RVFV wt ZH548 Stamm aktivieren NF-kB, IRF-3 und AP-1 (Abbildung 6), infiziert, während IFN-beta-mRNA-Synthese von NSS auf transkriptioneller Ebene 7 ist unterdrückt. So hemmt MP-12, die voll funktionsfähig NSS 3 drückt, die Synthese von NF-kB/IRF-3/7-inducible SEAP Reporter-Gen mRNA bei transcriptional Niveau, während rekombinante MP-12 fehlt NSs Funktionen wie C13type konnte induzieren die SEAP-mRNA-Synthese (Abbildung 7). Um richtig zu verstehen das Ergebnis der Immunogenität von solchen Mutanten sollte die Phänotypen weiter in Zellkultur-System charakterisiert werden. Zum Beispiel sollte die virale Replikation Kinetik in Typ-I-IFN kompetente Zellen wie menschlichen Lunge diploiden MRC-5-Zellen oder embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)-Zellen getestet werden. Die PKR Abbau Funktion kann durch Western-Blot mit Antikörpern, die spezifisch für die menschliche oder Maus PKR getestet werden. IFN-beta-mRNA-Induktion durch NSs Mutation sollte durch Northern Blot mit Digoxigenin-markierten RNA-Sonde spezifisch für Mensch oder Maus IFN-beta mRNA bestätigt werden. Host allgemeinen Transkriptionsfaktoren Unterdrückung kann durch die Analyse der Einbau eines analogen Uridin in naszierenden mRNA getestet werden. Schließlich sollte die Immunogenität und Sicherheit des Kandidaten MP-12 NSs Mutanten in Mäusen getestet werden. In der Regel 1 x 10 5 pfu der Candida-te Impfstoff in PBS verdünnt wird subkutan und bestimmten Seren aus der retro-orbitalen Sinus am Tag 30 (oder 42) und Tag 180 gesammelt werden auf das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern durch Plaque-Reduktion neutralisiert test (PRNT 80) und Gesamt-IgG gegen RVFV N getestet und Gn / Gc durch IgG ELISA mit rekombinantem viralen Proteinen beschichtet. Die Wirksamkeit von Impfstoff-Kandidaten können durch anspruchsvolle Mäusen 42 Tage nach der Immunisierung mit Wildtyp-ZH501 getestet (zB; ip, 1 x 10 3 pfu) bei Tier Biosicherheitsstufe (BSL) 4 Anlage oder verbesserte BSL3 + Anlage in den USA Der umgekehrte Genetik-Ansatz ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Gestaltung und generieren sicher und immunogen attenuierten RVFV Impfstoffe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Grant Number 5 U54 AI057156-07 durch Western Regional Center of Excellence (WRCE), 1 R01 AI08764301-A1 von National Institute of Allergy and Infectious Diseases, und eine interne Finanzierung von Sealy Center for Vaccine Development an der Universität finanziert Texas Medical Branch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR international | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma-Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | Invitrogen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | Invitrogen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | Invitrogen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
