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Immunology and Infection

रिवर्स आनुवंशिकी का उपयोग करने के लिए दरार घाटी बुखार वायरस सांसद 12 वैक्सीन सुरक्षा और प्रभावकारिता में सुधार तनाव के एनएसएस जीन हेरफेर

Published: November 1, 2011 doi: 10.3791/3400
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Texas Medical Branch

Summary

रिवर्स आनुवंशिकी प्रणाली दरार घाटी बुखार वायरस सांसद 12 टीका तनाव के लिए बढ़ क्षीणन और प्रतिरक्षाजनकता साथ अतिरिक्त सांसद 12 म्यूटेंट बनाने के लिए एक उपयोगी उपकरण है. हम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए पैदा करते हैं और एनएसएस उत्परिवर्ती उपभेदों विशेषताएँ.

Protocol

1. पुनः संयोजक सांसद 12 एन्कोडिंग एनएसएस उत्परिवर्तन (ओं) के प्लाज्मिड DNAs 2 से रिकवरी

  1. बिखरा हुआ बच्चा हम्सटर गुर्दे (BHK) / T7 9 15 कोशिकाओं, जो stably व्यक्त T7 शाही सेना पोलीमरेज़, न्यूनतम आवश्यक मध्यम में 6 सेमी व्यंजन में (सदस्य) अल्फा (Invitrogen, 32561037 # कैट) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS युक्त ), (पेनिसिलीन पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन: 100 / यू मिलीलीटर, स्ट्रेप्टोमाइसिन: 100 μg / एमएल) (Invitrogen, 15140122 # बिल्ली), और 600 μg / hygromycin बी के मिलीलीटर (Cellgro, 30-240-सीआर # बिल्ली).
    * वायरल वसूली की क्षमता 35 मिमी व्यंजनों में से 6 सेमी व्यंजन में अधिक है. कम बीतने के स्तर के साथ BHK/T7-9 कोशिकाओं वसूली की उच्च दर का समर्थन करते हैं. वैकल्पिक रूप से, अन्य BHK सेल लाइनों है कि stably व्यक्त T7 शाही सेना पोलीमरेज़ 4,5,16,17 इस्तेमाल किया जा सकता है .
  2. जब कोशिकाओं को 70-80 confluency% तक पहुँच चुके हैं, ताजा सदस्य अल्फा 10% FBS और पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (युक्त hygromycin बी) से युक्त. संस्कृति सतह पर तैरनेवाला की जगह

    * कक्ष transfecte होना चाहिएमध्यम जगह T7 शाही सेना पोलीमरेज़ अभिव्यक्ति की हानि से बचने के बाद एक घंटे के भीतर.
  3. RVFV, पूर्ण लंबाई वायरल शाही सेना अभिव्यक्ति के लिए वायरल जीनोमिक RNAs एन्कोडिंग plasmids के एक सेट है, और एक दूसरे वायरल प्रोटीन अभिव्यक्ति (आंकड़े 1 और 2) के लिए वायरल जीन खुला पढ़ने फ्रेम एन्कोडिंग सेट की वसूली के लिए आवश्यक हैं. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में निम्नलिखित plasmids2 (चित्रा 2) का एक मिश्रण तैयार:
    1. एनएसएस (2 मिलीग्राम) जीन में उत्परिवर्तन (ओं) (+) के साथ pProT7 - एस: यह प्लाज्मिड भावना विरोधी वायरल (सकारात्मक भावना) encodes पूर्ण लंबाई RVFV सांसद 12 T7 प्रमोटर द्वारा flanked और एस खंड हेपेटाइटिस डेल्टा वायरस (HDV) ribozyme अनुक्रम.
    2. pProT7 - एम (+) (2 मिलीग्राम): यह प्लाज्मिड वायरल विरोधी भावना (सकारात्मक भावना) पूर्ण लंबाई RVFV सांसद 12-T7 प्रमोटर और HDV ribozyme अनुक्रम द्वारा flanked एम खंड encodes
    3. pProT7 - एल (+) (2 मिलीग्राम): इस प्लाज्मिड विरोधी वायरल भावना encodes (सकारात्मक भावना) पूर्ण लंबाई MP-12 fla RVFV एल - खंडT7 प्रमोटर और HDV ribozyme अनुक्रम द्वारा nked.
    4. (2 मिलीग्राम) pT7 IRES - VN: इस प्लाज्मिड RVFV सांसद 12-पढ़ने एन खुला (ओआरएफ) फ्रेम T7 प्रमोटर और एक मस्तिष्क एवं हृद् - पेशी का शोथ वायरस (EMCV) आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट (IRES) के बहाव के encodes.
    5. (1 मिलीग्राम) pT7 - IRES-VL: यह प्लाज्मिड encodes RVFV सांसद 12-एल ओआरएफ T7 प्रमोटर और एक EMCV IRES के बहाव.
    6. (1 मिलीग्राम) pCAGGS VG: यह प्लाज्मिड RVFV सांसद 12 एम ओआरएफ बहाव चिकन प्रमोटर बीटा - actin के encodes.
      * PT7 - IRES - VN, pT7 IRES-VL और pCAGGS VG के अलावा सांसद-12 की वसूली के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन यह 2 बचाव की क्षमता को बढ़ाता है. लेखक प्लाज्मिड, शायद ribosomes द्वारा AUGs के टपकाया स्कैनिंग की कमी के कारण pT7 - IRES का उपयोग करके Gn / जीसी के गरीब अभिव्यक्ति का अनुभव. इसलिए, हम टोपी पर निर्भर अभिव्यक्ति / Gn जीसी के लिए pCAGGS VG निर्माण.

  4. Opti-सदस्य के 385 मिलीलीटर (Invitroge ट्रांजिट-LT1 के 30 मिलीलीटर (Mirus, बिल्ली MIR2300 #) जोड़ेंn, बिल्ली, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 31,985,070), और भंवर संक्षिप्त.
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट ऊष्मायन के बाद, धीरे धीरे जोड़ने के लिए प्लाज्मिड मिश्रण 1.3 कदम से liposomes युक्त Opti-सदस्य, pipetting द्वारा धीरे मिश्रण और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  6. कदम 1.2 ड्रॉप द्वारा ड्रॉप (चित्रा 3) से BHK/T7-9 कोशिकाओं की संस्कृति के माध्यम से liposome और plasmids के मिश्रण जोड़ें .
  7. 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक मशीन में 37 में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं ° सी, सेते हैं और साथ संस्कृति सतह पर तैरनेवाला जगह ताजा सदस्य अल्फा 10% FBS और पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (युक्त hygromycin बी) से युक्त.
  8. 37 में कोशिकाओं सेते ° सी एक इनक्यूबेटर में 4 अतिरिक्त (कुल 5 दिनों के लिए सेते हैं) दिन, और एक 15 मिलीलीटर की ट्यूब में संस्कृति supernatants इकट्ठा के लिए 5% सीओ 2 के साथ.

    * यहाँ कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (CPE) मनाया जरूरी सफल वायरल वसूली के परिणाम को प्रतिबिंबित नहीं करता, क्योंकि अभिकर्मकजो वायरल शाही सेना प्रतिकृति या वायरल प्रोटीन संश्लेषण द्वारा कारण CPE के समान प्रतीत होता है कोशिका मृत्यु लाती है.
  9. अपकेंद्रित्र supernatants २२०० XG में 4 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए.

    * इस कदम का उद्देश्य वायरल स्टॉक से सेलुलर मलबे के नीचे गोली है. एक अपकेंद्रित्र एयरोसोल तंग बाल्टी वृद्धि की सुरक्षा के लिए सिफारिश की है.
  10. पेंच टोपी 5 मिलीलीटर cryotubes में supernatants स्थानांतरण, और बीतने के 0 (P0) -80 डिग्री सेल्सियस आगे उपयोग के लिए वायरस शेयर की दुकान.

2. P0 वायरस के प्रवर्धन

  1. P0 नमूने अक्सर बहाव 2 प्रयोगों के लिए अपर्याप्त वायरल अनुमापांक होते हैं. VeroE6 कोशिकाओं में एक प्रवर्धन कदम है, जो अफ्रीकी हरी बंदर गुर्दा (वेरो) IFN-alpha/beta जीन 18,19 कमी कोशिकाओं के एक क्लोन है अधिकतम स्तर पर वायरल अनुमापांक बढ़ जाती है. वैकल्पिक रूप से, अन्य कक्षों IFNAR1 - पीटकर 21 चूहों migh से Hec1B 20 कक्षों या MEF कोशिकाओं जैसे प्रकार मैं IFN प्रतिक्रियाओं की कमीइस कदम के लिए इस्तेमाल किया जा. है Dulbecco संशोधित न्यूनतम आवश्यक मध्यम (DMEM) (Invitrogen, 11965092 # बिल्ली) में 10 - सेमी व्यंजन जिसमें 10% FBS में VeroE6 कोशिकाओं फैलाओ, पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनिसिलीन: 100 / यू मिलीलीटर, स्ट्रेप्टोमाइसिन: 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर) सेते हैं, और 37 डिग्री सेल्सियस एक इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ, जब तक वे 80% confluency तक पहुँचने .
    * पुनः संयोजक सांसद 12-उत्परिवर्ती एनएसएस एन्कोडिंग उपभेदों अक्सर प्रकार मैं IFN-सक्षम कोशिकाओं में कुशलता को दोहराने में विफल है.
  2. 10% FBS और पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ 2.7 मिलीलीटर DMEM के साथ P0 नमूनों की 300 मिलीलीटर का मिश्रण. कदम 2.1 से VeroE6 कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम से निकालें और पतला P0 नमूना के साथ बदलें. 5% सीओ 2 के साथ डिग्री सेल्सियस एक इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए 37 सेते हैं.
  3. Inocula निकालें और 10% FBS और पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ प्रत्येक पकवान DMEM के 10 मिलीलीटर जोड़ने.
  4. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस के लिए 3 से 4 दिन है जब तक VeroE6 कोशिकाओं के CPE स्पष्ट हो जाता है.
    * Monolayer के विघटन सांसद 12 संक्रमण, whil के दौरान होता है हैई पुनः संयोजक सांसद 12 (C13type) rMP12 C13type (चित्रा 4) के रूप में कमी एनएसएस, monolayer को बाधित नहीं करता, लेकिन मृत अस्थायी कोशिकाओं की एक संख्या के संक्रमण के बाद 2 से 3 दिनों दिखाई देते हैं.
  5. 3 से 4 डीपीआई पर सतह पर तैरनेवाला है, के रूप में 1.9 वर्गों) और 1.10 में वर्णित), हार्वेस्ट और E6P1 के रूप में नमूने नामित.

3. पट्टिका परख द्वारा पुनः संयोजक सांसद-12 के अनुमापन

  1. 6 अच्छी तरह प्लेटें में VeroE6 कोशिकाओं बिखरा हुआ है.
    * नमूना प्रति डुप्लिकेट विश्लेषण ही विश्लेषण की तुलना में अधिक विश्वसनीय है.
  2. जब VeroE6 कोशिकाओं 80 confluency% हो गई है, 10% FBS और पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन 10-6 करने के लिए साथ DMEM में वायरस के नमूने के 10 गुना धारावाहिक dilutions के रूप में इस प्रकार तैयार:
    • E6P1 नमूने के 10 μl + 990 DMEM के 10% FBS और पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ मिलीलीटर (10 -2 मन्दन )
    • 10 -2 नमूने के 100 μl + 10% FBS और पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (10 -3 कमजोर पड़ने) के साथ 900 मिलीलीटर DMEM की
    • 10010 -3 नमूना + 10% FBS और पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (10 -4 कमजोर पड़ने) के साथ 900 मिलीलीटर DMEM के के μl
    • 10 -4 नमूने के 100 μl + 10% FBS और पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ 900 DMEM के मिलीलीटर (कमजोर पड़ने 05/10 )
  3. 3.1 कदम से 6 अच्छी तरह से थाली से मध्यम महाप्राण (व्यंजन) और कुओं (चित्रा 3) में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 400 μl (3.2 कदम से) जोड़ें.
  4. 5% सीओ 2 के साथ डिग्री सेल्सियस एक इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए 37 सेते हैं.
  5. ऊष्मायन के दौरान निम्नानुसार अगर उपरिशायी के लिए दो 15 मिलीलीटर ट्यूबों तैयार:
    ट्यूब एक (42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान रखने के लिए): 1.2% महान अगर पानी में 7 मिलीलीटर (VWR, बिल्ली 101170-362 #)
    ट्यूब (37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखने) बी: संशोधित ईगल मीडियम के 7 मिलीग्राम (2x सदस्य) (Invitrogen, # बिल्ली 11935046) 10% FBS युक्त, पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनिसिलीन: 100 यू / मिलीलीटर, स्ट्रेप्टोमाइसिन: 100 μg / मिलीलीटर), और 10% Tryptose फॉस्फेट शोरबा (सांसद Biomedicals, # बिल्ली 1682149).
  6. 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, वायरल हटायेंinocula, और तुरंत दो मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से एक और बी (3.5 कदम से) ट्यूब ट्यूब के एक 1:1 मिश्रण जोड़ने.
    * ध्यान रखना उपरिशायी तुरंत जोड़ने के रूप में कुओं के सूख असंक्रमित कोशिकाओं की मौत का कारण बनता है.
  7. 37 ° C पर प्लेटें 5% सीओ 2 के साथ एक मशीन में 3 दिनों के लिए सेते हैं .
  8. ट्यूब तैयार एक और ट्यूब फिर से के रूप में 3.5 चरण में वर्णित बी. भी 0.33% की थाली जो भी 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर रखा है प्रति तटस्थ लाल समाधान (सिग्मा Aldrich, बिल्ली # N2889-100ml) के 500 μl तैयार.
  9. मिक्स एक ट्यूब, ट्यूब बी और तटस्थ लाल समाधान के 500 मिलीलीटर (अंतिम सान्द्र 0.011%) और अच्छी तरह से प्रति मिश्रण के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
    * तटस्थ लाल समाधान के बहुत से तटस्थ लाल जोड़ा जा समाधान की राशि बदलता है, और प्रारंभिक अनुकूलन की आवश्यकता है. 0.33% तटस्थ लाल समाधान के लंबी अवधि के भंडारण वर्षा का कारण बनता है. ऐसे मामलों में, वेग 55 में पूरी तरह से किया जा सकता है ऊष्मायन द्वारा भंग ° सी 10 मिनट के लिए जोरदार झटकों से पीछा. उपजी तटस्थ आर के उपयोगएड कोशिकाओं के कमजोर धुंधला समाधान में परिणाम है, जबकि पुनः - भंग तटस्थ लाल समाधान दाग ही कोशिकाओं.
  10. 16 के लिए थाली सेते में 37 घंटे (या रात) ° 5% सीओ 2 के साथ एक इनक्यूबेटर में सी .
  11. अच्छी तरह से है जो अच्छी तरह से 10 से 100 प्रति सजीले टुकड़े हैं सजीले टुकड़े की संख्या की गणना. पट्टिका गठन इकाइयों / मिलीलीटर की संख्या की गणना. उदाहरण के लिए, अगर हम 10 dilutions -5, 28 (# सजीले टुकड़े के) x (1 ml/0.4 मिलीलीटर) 5 x 10 (मन्दन) = 7.0 x 10 6 पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) के साथ inoculated कुओं में 28 सजीले टुकड़े निरीक्षण / एमएल (5 आंकड़े).

4. एनएसएस म्यूटेंट की स्क्रीनिंग प्रकार मैं IFN दमन समारोह की कमी

  1. बिखरा हुआ C57/WT MEF (InvivoGen, बिल्ली # MEF - c57wt) कोशिकाओं है, जो 12 अच्छी तरह प्लेटों में एक secreted भ्रूण क्षारीय (SEAP) NF-kB और IRF-3 / 7 (चित्रा 6) द्वारा फॉस्फेट जीन inducible सांकेतिक शब्दों में बदलना. कोशिकाओं DMEM में 10% FBS, पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (Penici के साथ रखा जाता है100 / यू मिलीलीटर, स्ट्रेप्टोमाइसिन:: 100 μg / एमएल), Blasticidin एस (3 मिलीग्राम / एमएल), और Zeocin (100 μg / एमएल) llin.
  2. जब कोशिकाओं के उप - सहधारा (80%) हो जाते हैं, कोशिकाओं नकली संक्रमित या MP-12 या पुनः संयोजक सांसद 12 संक्रमण के 3 या 0.1 (moi) बहुलता (2 और 3 वर्गों देखें, राशि का एन्कोडिंग एनएसएस म्यूटेशनों से संक्रमित हैं प्रत्येक inoculum 300 μl होना चाहिए). 1 घंटे पोस्ट संक्रमण, inocula निकालने के लिए, और 10% FBS, पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनिसिलीन: 100 / यू मिलीलीटर, स्ट्रेप्टोमाइसिन: 100 μg / एमएल) के साथ एक प्रति अच्छी तरह से DMEM के मिलीलीटर जोड़ने (Blasticidin और Zeocin इस पर नहीं जोड़ रहे हैं समय).
  3. 14 घंटे पोस्ट संक्रमण, संस्कृति supernatants इकट्ठा. Quanti ब्लू के 200 μl (InvivoGen, बिल्ली # प्रतिनिधि qb1) और प्रत्येक नमूना के 50 μl (तीन प्रतियों में) एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं जोड़ें. सील और एच. 1 के लिए 37 पर थाली ° सी सेते
    * दोनों सांसद-12 और पुनः संयोजक सांसद 12 कमी एनएसएस IFN-alpha/beta 293 कोशिकाओं, MRC -5 कोशिकाओं और माउस embr सहित सक्षम कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से मेजबान translational दमन प्रेरितउच्च moi पर 14 घंटे बाद संक्रमण के बाद yonic fibroblast कोशिकाओं (MEF). दूसरी ओर, IFN-बीटा mRNA या ISG56 mRNA 7 बजे 8 घंटे पोस्ट संक्रमण बहुतायत में जम जाता है प्रकार मैं सक्षम कोशिकाओं IFN. इस प्रकार, हम 14 घंटे के बाद संक्रमण चुना supernatants इकट्ठा करने के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से प्रेरित SEAP के संचय.
  4. 650 एनएम पर एक प्लेट रीडर (चित्रा 7) का उपयोग कर आयुध डिपो मूल्यों पढ़ें.
    * परिणाम उत्तरी दाग का उपयोग कर एक शाही सेना माउस ISG56 mRNA, जो विनियमन ISG56 mRNA की एनएसएस अभिव्यक्ति के अभाव (8 चित्रा) में दिखाता है के लिए विशिष्ट जांच द्वारा प्राप्त आंकड़ों के साथ संगत कर रहे हैं.
    * यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि SEAP गतिविधि जो मेजबान अनुवाद गतिविधि के द्वारा प्रभावित किया जा सकता है है प्रोटीन की बहुतायत से निर्धारित होता है. SEAP के एक रिश्तेदार स्तर mRNA की वृद्धि हुई स्तर की तुलना में अधिक नहीं हो सकता है क्योंकि SEAP SEAP mRNA की उपस्थिति में भी नहीं संश्लेषित कर सकते हैं अगर सेलुलर अनुवाद suppr है हो सकता हैessed. उत्तरी दाग ​​एक और अधिक सरल परख और SEAP संवाददाता परख की तुलना में संक्रमित कोशिकाओं में एनएसएस कार्यों की कमी से प्रेरित mRNA की राशि का मूल्यांकन करने के लिए एक और अधिक सटीक तरीका है. हालांकि, SEAP संवाददाता प्रणाली उत्तरी दाग ​​से अधिक तेजी से और इसलिए एनएसएस संभावित मेजबान प्रतिलेखन दमन समारोह की कमी म्यूटेंट की तेजी से जांच के लिए उपयोगी है.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

रिवर्स आनुवंशिकी प्रणाली की तुलना में उच्च titers 1 एक्स 10 6 pfu / मिलीलीटर के साथ लगातार व्यवहार्य पुनः संयोजक सांसद 12 वायरस उत्पन्न . C13type एनएसएस कार्यों की कमी वायरस बड़े turbid सजीले टुकड़े का गठन किया है, जबकि सांसद-12 विभिन्न आकार 2 (चित्रा 5) स्पष्ट सजीले टुकड़े का गठन किया. मॉक संक्रमित C57/WT MEF कोशिकाओं या सांसद 12 से संक्रमित लोगों में SEAP की संस्कृति सतह पर तैरनेवाला नकली संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में स्तर में वृद्धि नहीं था, जबकि C57/WT MEF C13type साथ संक्रमित कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला संस्कृति एक वृद्धि की निहितSEAP के 14 घंटे के बाद (hpi) संक्रमण (चित्रा 7) द्वारा स्तर. इन परिणामों उत्तरी दाग ​​का उपयोग कर एक शाही सेना माउस ISG56 mRNA (चित्रा 8) के लिए विशिष्ट जांच द्वारा प्राप्त उन लोगों के साथ संगत कर रहे हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 RVFV के जीनोम संरचना
RVFV एक त्रिपक्षीय नकारात्मक भावना या ambisense आरएनए जीनोम नाम एस, एम, और एल - खंड. एस - खंड एक ambisense तरीके से एन और एनएसएस जीन encodes. एन mRNA (नकारात्मक भावना) वायरल एस खंड भावना से संश्लेषित है, जबकि एनएसएस mRNA (सकारात्मक भावना) विरोधी वायरल एस खंड भावना से संश्लेषित है. एम - खंड एक एकल एम mRNA encodes और एम mRNA की 5'region पर कई AUGs, उनके सह translational 22,23 दरार द्वारा पीछा के टपकाया स्कैनिंग द्वारा the78kD, NSM, Gn या जीसी प्रोटीन synthesizes. एल खंड एल प्रोटीन encodes. दोनों और एन एल प्रोटीन वायरल प्रतिलेखन और प्रतिकृति के लिए आवश्यक हैं, जबकि Gn और जीसी वायरल लिफाफा प्रोटीन होते हैं. एनएसएस और NSM प्रोटीन nonstructural प्रोटीन है, जो वायरस कणों में शामिल कर रहे हैं नहीं कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्लास्मिड डीएनए पुनः संयोजक RVFV सांसद 12 तनाव की वसूली के लिए डिजाइन
सीडीएनए एन्कोडिंग पूर्ण लंबाई विरोधी वायरल भावना एस, एम, एल या खंड T7 प्रमोटर के cloneddownstream और हैपेटाइटिस डेल्टा वायरस (HDV) के ऊपर ribozyme दृश्यों, pProT7-एस (+) के रूप में नामित, pProT7 एम (+), या (+) pProT7-एल, क्रमशः 2. T7 शाही सेना BHK/T7-9 कोशिकाओं में व्यक्त पोलीमरेज़ आरएनए एन्कोडिंग transcribes पूर्ण लंबाई एस, एम, या सटीक जीनोम 3 'अंत के साथ एल - खंड. N या ​​एल प्रोटीन का खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) मस्तिष्क एवं हृद् - पेशी का शोथ (EMCV) आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट वायरस (IRES), जो pT7 - IRES - VN या pT7 IRES-VL, क्रमशः के रूप में नामित कर रहे हैं के तहत क्लोन कर रहे हैं uncapped की अनुमति T7 शाही सेना प्रतिलेख टोपी आजादी में ribosomes द्वारा मान्यता प्राप्त करने के लिएसेंध तरीके. एम ओआरएफ चिकन प्लाज्मिड pCAGGS 24 है, जो pCAGGS-VG के रूप में नामित है के प्रमोटर बी actin के तहत क्लोन है, 78kD, NSM के संश्लेषण, Gn और जीसी प्रोटीन, जो विभिन्न AUGs से टपका हुआ 23 स्कैनिंग के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं की अनुमति है. दोनों और एन एल प्रोटीन प्रतिलेखन या शाही सेना प्रतिकृति की शुरुआत करने के लिए आवश्यक हैं, जबकि pT7 IRES - VN और pT7 IRES-VL पुनः संयोजक सांसद 12 2 की वसूली के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं, शायद के संभाव्य टपका हुआ अभिव्यक्ति के कारण पोल द्वितीय संचालित छाया शाही सेना टेप एन ओआरएफ एन्कोडिंग और एल ओआरएफ pProT7 - एस (+) और pProT7-एल (+) से क्रमशः.

चित्रा 3
चित्रा 3 प्लास्मिड डीएनए से सांसद 12 RVFV की रिकवरी.
PProT7-एस (+) के साथ BHK/T7-9 कोशिकाओं, pProT7 - एम (+), pProT7-एल (+), pT7 - IRES - VN pT7 - IRES-VL और pCAGGS VG प्लास्मिड (Fig.1 के अभिकर्मक ) संक्रामक संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में पुनः संयोजक RVFV सांसद 12 तनाव उत्पन्नएस 5 दिन के बाद अभिकर्मक में सतह पर तैरनेवाला एकत्र की है, और ताजा वायरल प्रवर्धन के लिए वेरो कोशिकाओं E6 में passaged. आमतौर पर, अधिक से अधिक 1 x 10 6 pfu / वायरस के मिलीलीटर 3 से 4 दिनों के बाद संक्रमण पर बरामद किया जा सकता है . प्रवर्धित वायरस (वायरस E6P1) के वेरो E6 कोशिकाओं के साथ पट्टिका परख का उपयोग करके titrated है और phenotype विश्लेषण और प्रतिरक्षाजनकता अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया.

चित्रा 4
चित्रा 4 सांसद के एस-12 खंड और rMP12 - C13type.
सांसद-12 की तुलना और (C13type) rMP12 C13type एस खंडों. C13type की एनएसएस ओआरएफ सांसद 12-तनाव के एनएसएस के लिए तुलना में, 69% से छोटा है, और स्वाभाविक रूप से अलग क्लोन 13 2,25 तनाव की है कि समान है.

चित्रा 5
चित्रा 5 सांसद 12 (कार्यात्मक एनएसएस) और C13type (गैर कार्यात्मक एनएसएस) के लिए फलक परख.
वेरो ई के monolayer6 अच्छी तरह से एक थाली में 6 कोशिकाओं पट्टिका परख के लिए प्रयोग किया जाता है. 0.6% अगर उपरिशायी, दूसरा अगर तटस्थ लाल समाधान युक्त ओवरले के साथ 3 ऊष्मायन दिनों के बाद जोड़ा है. फिर, सजीले टुकड़े दिन 4 पोस्ट संक्रमण में गिने जाते हैं. सांसद 12 विभिन्न आकारों की स्पष्ट सजीले टुकड़े रूपों, जबकि C13type रूपों बड़े turbid सजीले टुकड़े (या foci). 10 से 100 सजीले टुकड़े के साथ अच्छी तरह से गणना के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

चित्रा 6
चित्रा 6 secreted alkaline फॉस्फेट (SEAP) C57/WT MEF कोशिकाओं में रिपोर्टर जीन के सक्रियकरण मार्ग.
इंटरफेरॉन बीटा प्रमोटर AP-1, NF-kB और IRF-3 के बंधन दृश्यों शामिल है. RVFV प्रतिकृति एपी-1, NF-kB और 7,11 IRF-3 सक्रिय. हालांकि, एनएसएस के बाद भी उन प्रतिलेखन कारकों के बंधन IFN-बीटा प्रमोटर से repressor जटिल की रिहाई, इस तरह दबा IFN-बीटा 26 mRNA की संश्लेषण को बाधित . इसके अलावा, एनएसएस sequesters TFIIH p44 subunits8 और एकlso TFIIH p62 27 सब यूनिटों की गिरावट को बढ़ावा देता है, इस प्रकार IFN-अल्फा जीन और ISRE प्रमोटर के तहत जीन सहित एक सामान्य मेजबान प्रतिलेखन दमन उत्प्रेरण. C13type या अन्य एनएसएस IFN-बीटा दमन समारोह की कमी म्यूटेंट IFN-बीटा संश्लेषण है, जो बारी में प्रमोटर IFN-अल्फा और प्रतिक्रिया इंटरफेरॉन के प्रति संवेदनशील तत्व प्रमोटर (ISRE) सक्रिय प्रेरित. 7 - IRF तो IFN-alpha/beta उत्तेजना और IFN-अल्फा द्वारा 28,29 IRF-3 के समर्थन में आगे upregulated द्वारा transcriptionally upregulated है. इस परख में, C57/WT MEF कोशिकाओं NF-kB, IRF-3 और IRF-7 की एक कृत्रिम बाध्यकारी अनुक्रम के बहाव पर secreted alkaline फॉस्फेट (SEAP) सांकेतिक शब्दों में बदलना. इस प्रकार, एनएसएस IFN-बीटा दमन समारोह की कमी म्यूटेंट SEAP जिसका स्राव तो मापा upregulate.

7 चित्रा
7 चित्रा C13type द्वारा SEAP की प्रेरण.
C57/WT MEF कोशिकाओं (InvivoGen) नकली थेसंक्रमित या MP-12 या 3 (बाएं पैनल) या 0.01 (राइट पैनल) के moi पर rMP12 C13type (C13type) से संक्रमित है. Hpi 14 में संस्कृति supernatants (50 μl) quanti ब्लू (InvivoGen) 96 अच्छी तरह से थाली और 650 एनएम आयुध डिपो मूल्यों में सब्सट्रेट के 200 μl के साथ मिलाया गया 1 37 घंटे ऊष्मायन ° एक प्लेट रीडर द्वारा सी के बाद मापा गया. नकली संक्रमित कोशिकाओं को SEAP के रिश्तेदार वृद्धि दिखाए जाते हैं. तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मानक विचलन - डेटा मतलब + / प्रतिनिधित्व करते हैं. संस्कृति C13type संक्रमित कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला वृद्धि हुई SEAP से पता चलता है, एनएसएस द्वारा मेजबान प्रतिलेखन दमन की कमी का सुझाव दे.

8 चित्रा
8 चित्रा डीआईजी लेबल शाही सेना जांच के साथ उत्तरी धब्बा .
जंगली प्रकार माउस भ्रूण fibroblast कोशिकाओं (MEF) नकली संक्रमित या MP-12 या 3 के moi पर rMP12 C13type (C13type) से संक्रमित थे. कुल शाही सेना 7 hpi Trizol (Invitrogen), और उत्तरी ख का उपयोग करके एकत्र किया गया थाबहुत digoxigenin लेबल शाही सेना जांच माउस अंतर्जात ISG56 mRNA या सांसद-12 N mRNA / विरोधी वायरल भावना 2,30 एस - खंड के लिए विशिष्ट का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया था. माउस अंतर्जात mRNA ISG56 या RVFV N mRNA / विरोधी वायरल भावना एस खंड के लिए जांच करने के लिए, पीसीआर टुकड़े प्राइमर द्वारा प्रवर्धित KpnmISG56F (GGG TGG टीएसी CGC टीसीसी अधिनियम टीटीसी आगा जीसीसी टीटीसी GCA आग सीएजी) और HindmISG56 का सेट (टीएसी एएए GCT जैसे GGG आगा GAA TGC TGA TGG TGA सीसीए GG) ISG56 mRNA या KpnNF (AGT TGG टीएसी कैट GGA CAA CTA TCA आगा GCT TGC जी) और RVFV के लिए HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT आग) के लिए एन mRNA / KPN विरोधी वायरल एस खंड भावना के साथ पचा थे और मैं हिंद III, और में ligated pSPT18 प्लाज्मिड (Roche. तो शाही सेना digoxigenin के साथ लेबल जांच डीआईजी आरएनए लेबल (SP6/T7) किट (रॉश का उपयोग करके संश्लेषित थे, # 025 175 1) बिल्ली प्रत्येक नमूने के 28S rRNA स्तर भी नियंत्रण लोड हो रहा है के रूप में दिखाया गया है जंगली प्रकार MEF C13type प्रेरित ISG56 mRNA संश्लेषण के साथ संक्रमित कोशिकाओं, जबकि उन सांसद से संक्रमित-12 प्रेरित नहीं था, मेजबान C13type संक्रमित कोशिकाओं में प्रतिलेखन दमन की कमी का सुझाव दे. डेटा चित्रा 6 में SEAP परख द्वारा प्राप्त उन लोगों के साथ संगत है.

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Discussion

RVFV के लिए आनुवंशिकी सिस्टम उल्टा T7 प्रमोटर 2,4,5 या 3 माउस या मानव 4 प्रमोटर नीति मैं का उपयोग करके कई समूहों द्वारा विकसित किया गया है . इस पांडुलिपि में, हम BHK/T7-9 15 कि stably व्यक्त T7 शाही सेना पोलीमरेज़ कोशिकाओं का उपयोग करके पुनः संयोजक RVFV सांसद 12 उपभेदों उत्पन्न प्रोटोकॉल का वर्णन . वायरल वसूली की दक्षता BHK/T7-9 कोशिकाओं की शर्त पर निर्भर करता है विविध, plasmids की राशि, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं और इतने पर की संख्या. हम हमेशा के वेरो E6 कोशिकाओं में प्रयोगों के लिए उच्च टिटर वायरस शेयरों प्राप्त P0 वायरस बढ़ाना. प्रकार मैं मानव फेफड़ों (MRC 5) द्विगुणित कोशिकाओं जैसे IFN-सक्षम कोशिकाओं वायरल प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है केवल जब एनएसएस प्रकार मैं IFN या PKR सहित बाधा antiviral गतिविधियों द्वारा एक कुशल वायरल प्रतिकृति का समर्थन समारोह.

एक पट्टिका परख MP-12 और एनएसएस म्यूटेंट titrating के लिए काफी उपयोगी विधि है. के लिए एक सामान्य एहतियात के रूप मेंपट्टिका परख, कोशिकाओं तुरंत वायरल inocula के हटाने के बाद उचित तापमान पर उपरिशायी के साथ जोड़ा जाना चाहिए. क्रिस्टल बैंगनी धुंधला C13type वायरस सजीले टुकड़े का पता लगाने के लिए उपयुक्त नहीं है, क्योंकि C13type वायरस वेरो E6 2 कोशिकाओं के monolayer को बाधित नहीं करता . दूसरी ओर, तटस्थ लाल धुंधला सफलतापूर्वक C13type वायरस द्वारा गठित सजीले टुकड़े का पता लगाने सकता है. तटस्थ लाल के साथ सेलुलर धुंधला की ताकत जीवित कोशिकाओं में तटस्थ लाल रंग के रिश्तेदार निगमन द्वारा निर्धारित किया जाता है. इस प्रकार, यह संभावना है कि C13type संक्रमित कोशिकाओं को एक कम चयापचय गतिविधि है जो कम तटस्थ लाल रंग के असंक्रमित कोशिकाओं की है कि तुलना में समावेश होता है, और जो एक कमजोर धुंधला ध्यान केंद्रित रूपों. तटस्थ लाल के लिए आवश्यक राशि तटस्थ लाल समाधान के बहुत से भिन्न होता है. तटस्थ लाल समाधान की लंबी अवधि के भंडारण अक्सर precipitates उत्पन्न करता है. लेकिन यह, यह गर्मी 55 में तटस्थ लाल समाधान ° सी 10 मिनट के लिए भंग द्वारा रोका जा सकता हैकक्षों की धुंधला को प्रभावित करता है.

यह प्रयोगों में सटीक वायरल अनुमापांक के साथ वायरस का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक वायरल शेयर में अनुमापांक जो वायरल स्टॉक में phenol लाल पीले रंग, लंबी अवधि के भंडारण, दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र और इतने पर ने संकेत दिया है 6.5 31 के नीचे पीएच के साथ मीडिया के द्वारा कम किया जा सकता है . इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है पशु टीकाकरण के लिए ताजा वायरल स्टॉक का उपयोग करें या शेयर प्रयोग से पहले ही फिर से टाइट्रेट.

एनएसएस और NSM; RVFV दो विशेषता nonstructural प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना. RVFV कमी एनएसएस काफी 25,32 पशुओं में तनु है, जबकि RVFV कमी NSM अभी भी 33 चूहों में अत्यधिक विषमय. इस प्रकार, एनएसएस रोगजनन में विषैलापन कारक के रूप में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. एनएसएस एक multifunctional प्रोटीन है जो 1) मेजबान सामान्य प्रतिलेखन 8, 2 के दमन लाती है) dsRNA - रवानगी के IFN-बीटा mRNA 26 संश्लेषण और 3 के दमन) गिरावटendent प्रोटीन kinase (PKR) 9,10. माता पिता के सांसद 12 तनाव एनएसएस में truncation या परिवर्तन शुरू करने से आगे तनु हो सकता है. दूसरी ओर, यह भी महत्वपूर्ण है ऐसे उत्परिवर्ती MP-12 के प्रतिरक्षाजनकता बनाए रखने. मैं IFN-प्रकार वृक्ष के समान कोशिकाओं है, जो टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं 12-14 differentiations के लिए महत्वपूर्ण है की परिपक्वता के लिए एक भूमिका निभाता है. विभिन्न एनएसएस IFN-बीटा दमन समारोह की कमी म्यूटेंट, जो पूर्ण या आंशिक एनएसएस कार्यों को बनाए रखने प्रतिरक्षाजनकता और वैक्सीन उम्मीदवारों की सुरक्षा पर एनएसएस - मध्यस्थता दमन IFN-बीटा समारोह के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी होते हैं. यह ज्ञात है कि RVFV wt ZH548 तनाव NF-kB सक्रिय करते हैं, IRF-3, और एपी -1 (चित्रा 6) से संक्रमित कोशिकाओं जबकि IFN-बीटा mRNA संश्लेषण transcriptional 7 स्तर पर एनएसएस द्वारा दबा दिया है. इस प्रकार, 12-सांसद, जो पूरी तरह कार्यात्मक 3 एनएसएस व्यक्त transcri NF-kB/IRF-3/7-inducible SEAP रिपोर्टर जीन mRNA की संश्लेषण रोकताptional स्तर, जबकि पुनः संयोजक सांसद-12 C13type जैसे एनएसएस कमी कार्यों SEAP mRNA संश्लेषण (चित्रा 7) उत्पन्न कर सकता है . सही ढंग से ऐसे म्यूटेंट की प्रतिरक्षाजनकता के परिणाम को समझने के लिए, phenotypes आगे सेल संस्कृति प्रणाली में विशेषता किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, वायरल प्रतिकृति कैनेटीक्स प्रकार मैं जैसे मानव फेफड़ों द्विगुणित MRC-5 कोशिकाओं या माउस भ्रूण fibroblast कोशिकाओं (MEF) IFN सक्षम कोशिकाओं में परीक्षण किया जाना चाहिए. PKR गिरावट समारोह में मानव या माउस PKR विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. IFN-बीटा एनएसएस उत्परिवर्तन द्वारा mRNA प्रेरण digoxigenin लेबल शाही सेना जांच मानव या माउस IFN-बीटा mRNA के लिए विशिष्ट के साथ उत्तरी धब्बा द्वारा पुष्टि किया जाना चाहिए. होस्ट सामान्य प्रतिलेखन दमन नवजात mRNA में एक uridine अनुरूप के समावेश का विश्लेषण करके परीक्षण किया जा सकता है. आखिरकार, और उम्मीदवार सांसद 12 एनएसएस म्यूटेंट की सुरक्षा प्रतिरक्षाजनकता चूहों में परीक्षण किया जाना चाहिए. Candida के आमतौर पर, 5 x 10 1 pfuपीबीएस में पतला ते टीका subcutaneously दिया है और सीरा 30 दिन (या 42) और 180 दिन में रेट्रो कक्षीय साइनस से एकत्र कर रहे हैं एंटीबॉडी neutralizing के RVFV एन के खिलाफ पट्टिका परीक्षण निष्क्रिय कमी (80 PRNT) और कुल आईजीजी से उपस्थिति के लिए परीक्षण किया और जीसी / आईजीजी एलिसा द्वारा Gn शुद्ध पुनः संयोजक वायरल प्रोटीन के साथ लेपित है. वैक्सीन उम्मीदवारों की प्रभावकारिता चुनौतीपूर्ण चूहों द्वारा 42 पोस्ट प्रतिरक्षण दिनों में परीक्षण किया जा सकता है (जैसे, आईपी, 1 x 10 3 pfu) के ZH501 जंगली प्रकार के साथ पशु जैव सुरक्षा (BSL) स्तर 4 सुविधा या बढ़ाया BSL3 + सुविधा पर रिवर्स संयुक्त राज्य अमेरिका में आनुवंशिकी दृष्टिकोण एक शक्तिशाली उपकरण के डिजाइन और सुरक्षित और immunogenic रहते तनु RVFV टीके उत्पन्न है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम अनुदान 5 नंबर U54-07 उत्कृष्टता के पश्चिमी क्षेत्रीय केंद्र (WRCE) के माध्यम से AI057156, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोगों से 1 AI08764301 - A1 R01, और विश्वविद्यालय में एक टीके के विकास के लिए Sealy केंद्र से आंतरिक धन के द्वारा वित्त पोषित किया गया था टेक्सास चिकित्सा शाखा है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium (MEM)-alpha Invitrogen 32561037
Dulbecco’s modified minimum essential medium Invitrogen 11965092
Modified Eagle Medium (MEM 2x) Invitrogen 11935046
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Hygromycin B Cellgro 30-240-CR
Tryptose phosphate broth MP Biomedicals 1682149
Noble agar VWR international 101170-362
TransIT-LT1 Mirus Bio LLC MIR2300
Opti-MEM Invitrogen 31985070
Aerosol tight lid Eppendorf C-2223-25
0.33% neutral red solution Sigma-Aldrich N2889-100ML
C57/WT MEF cells Invitrogen mef-c57wt
Blasticidin S Invitrogen Ant-bl-1
Zeocin Invitrogen ant-zn-1
QUANTI-Blue Invitrogen rep-qb1
BHK/T7-9 cells15 Gifu university, Japan
Vero E6 cells ATCC CRL-1586

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References

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Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Ikegami, T. Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy. J. Vis. Exp. (57), e3400, doi:10.3791/3400 (2011).

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