Summary
Il sistema di genetica inversa per la Valle del virus della febbre della Rift MP-12 ceppo vaccinale è un utile strumento per la creazione di ulteriori MP-12 mutanti con attenuazione aumentata e l'immunogenicità. Noi descriviamo il protocollo per generare e caratterizzare NSS ceppi mutanti.
Abstract
Virus della febbre della Rift Valley (RVFV), che causa febbre emorragica, disturbi neurologici o cecità negli esseri umani, e un alto tasso di aborti e malformazioni fetali nei ruminanti 1, è stata classificata come HHS / USDA sovrapposizione agente di selezionare e di un gruppo di rischio 3 patogeno. Appartiene al genere Phlebovirus nel Bunyaviridae famiglia ed è uno dei membri più virulenta di questa famiglia. Diversi sistemi di genetica inversa per l'MP-12 RVFV ceppo del vaccino 2,3 così come wild-type ceppi RVFV 4-6, tra cui ZH548 e ZH501, sono state sviluppate dal 2006. La MP-12 ceppo (che è un gruppo di rischio 2 patogeno e un non-selezione agente) è fortemente attenuata da diverse mutazioni nel suo M-e L-segmenti, ma porta ancora virulento S-segmento RNA 3, che codifica per una virulenza funzionale fattore, NSS. Il rMP12-C13type (C13type) portando al 69% in-frame cancellazione di NSS ORF manca di tutte le funzioni NSS noto, mentre si replica come efficient così come MP-12 in VeroE6 cellule prive di tipo I IFN. NSS induce una chiusura di trascrizione ospitare tra cui l'interferone (IFN)-beta mRNA 7,8 e promuove la degradazione della doppia elica RNA-dipendente proteina chinasi (PKR) al post-traduzionali livello. 9,10 IFN-beta è trascrizionalmente sovraregolati per il fattore normativo interferone 3 (IRF-3), NF-kB e proteina attivatrice-1 (AP-1), e il legame di IFN-beta di IFN-alpha/beta recettore (IFNAR) stimola la trascrizione di IFN-alfa geni o altri geni dell'interferone stimolata (ISGs) 11, che induce ospitare attività antivirale, mentre la trascrizione soppressione ospiti ivi compresi IFN-beta gene NSS impedisce la upregulations gene di quelli ISGs in risposta alla replicazione virale nonostante IRF-3, NF-kB e attivatore proteina-1 (AP-1) può essere attivata RVFV7. . Così, NSS è un obiettivo eccellente per attenuare ulteriormente MP-12, e per migliorare la risposta immunitaria innata ospitare abolendo l'IFN-beta funzione di soppressione. Qui, Si descrive un protocollo per la generazione di un ricombinante MP-12 NSS codifica mutato, e fornire un esempio di un metodo di screening per identificare i mutanti NSS manca la funzione di sopprimere IFN-beta sintesi di mRNA. Oltre al suo ruolo essenziale nella dell'immunità innata, tipo I IFN è importante per la maturazione delle cellule dendritiche e l'induzione di una risposta immunitaria adattativa 12-14. Così, mutanti NSS indurre IFN di tipo I sono ulteriormente attenuati, ma allo stesso tempo sono più efficienti a stimolare le risposte immunitarie di ospitare wild-type MP-12, che li rende candidati ideali per gli approcci di vaccinazione.
Protocol
1. Recupero di mutazione ricombinante-12 MP codifica NSS (s) da plasmide DNA 2
- Diffusione renali di criceto neonato (BHK) / T7-9 celle 15, che esprimono stabilmente T7 RNA polimerasi, in 6 cm di piatti in Medium minimo (MEM)-alfa (Invitrogen, Cat # 32561037) contenente il 10% siero fetale bovino (FBS ), penicillina-streptomicina (Penicillina: 100 U / ml, streptomicina: 100 mcg / ml) (Invitrogen, Cat # 15140122), e 600 mg / ml di Hygromycin B (Cellgro, Cat # 30-240-CR).
* L'efficienza di recupero virale è superiore a 6 cm di piatti che in 35 mm piatti. BHK/T7-9 cellule con passaggio basso livello di supporto più alti tassi di recupero. In alternativa, le altre linee cellulari che esprimono stabilmente BHK T7 RNA polimerasi potrebbero essere utilizzati 4,5,16,17. - Quando le cellule hanno raggiunto il 70-80% di confluenza, sostituire il surnatante cultura con nuove alfa-MEM contenente 10% FBS e penicillina-streptomicina (non contenente Hygromycin B).
* Le cellule devono essere transfected entro 1 ora dopo la sostituzione del mezzo per evitare la perdita di espressione T7 RNA polimerasi. - Per il recupero di RVFV, una serie di plasmidi codifica virale RNA genomici per full-length espressione di RNA virale, e un secondo set di codifica virale open reading frames gene per l'espressione delle proteine virali (figure 1 e 2) sono obbligatori. Preparare una miscela di plasmids2 seguenti (Figura 2) in una provetta da 1,5 ml:
- pProT7-S (+) con mutazione (s) nel gene NSS (2 mg): Questo plasmide codifica per l'anti-virale-senso (positivo-senso) full-length RVFV MP-12 S-segmento affiancato dal promotore T7 e il virus dell'epatite delta (HDV) ribozima sequenza.
- pProT7-M (+) (2 mg): Questo plasmide codifica per l'anti-virale-senso (positivo-senso) full-length RVFV MP-12 M-segmento affiancato dal promotore T7 e la sequenza HDV ribozima.
- pProT7-L (+) (2 mg): Questo plasmide codifica anti-virale-senso (positivo-senso) full-length RVFV MP-12 L-segmento flanked dal promotore T7 e la sequenza HDV ribozima.
- PT7-IRES-VN (2 mg): Questo plasmide codifica il RVFV MP-12 N quadro di lettura aperta (ORF) a valle del promotore T7 e un virus dell'encefalomiocardite (EMCV) interno del sito di entrata ribosoma (IRES).
- PT7-IRES-VL (1 mg): Questo plasmide codifica il RVFV MP-12 L ORF a valle del promotore T7 e IRES EMCV.
- pCAGGS-VG (1 mg): Questo plasmide codifica RVFV MP-12 M ORF a valle del promotore pollo beta-actina.
* L'aggiunta di PT7-IRES-VN, PT7-IRES-VL e pCAGGS-VG non è essenziale per il recupero di MP-12, ma migliora l'efficienza del soccorso 2. Autori esperti espressione poveri di Gn / Gc utilizzando PT7-IRES plasmide, probabilmente a causa della mancanza di scansione che perde di AUGs dai ribosomi. Pertanto, abbiamo costruito pCAGGS-VG per cap-dipendente Gn / Gc espressione.
- Aggiungere 30 ml di transito-LT1 (Mirus, Cat # MIR2300) a 385 ml di Opti-MEM (Invitrogen, Cat # 31985070) in una provetta da 1,5 ml, e brevemente vortice.
- Dopo 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente, aggiungere lentamente la Opti-MEM contenente liposomi alla miscela plasmide dal passo 1,3 a mescolare, delicatamente pipettando e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere la miscela di liposomi e plasmidi al mezzo di coltura della BHK/T7-9 cellule a partire dal punto 1,2 goccia a goccia (Figura 3).
- Incubare le cellule transfettate a 37 ° C in un incubatore al 5% di CO 2 per 24 ore, e sostituire il surnatante cultura fresca MEM-alfa contenente 10% FBS e penicillina-streptomicina (non contenente Hygromycin B).
- Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore al 5% di CO 2 per 4 giorni aggiuntivi (incubare per 5 giorni in totale), e raccogliere il sovranatanti in una provetta da 15 ml.
* L'effetto citopatico (CPE) ha osservato qui non riflette necessariamente il risultato del successo virale di recupero, perché la trasfezioneinduce la morte cellulare che sembra simile a quello causato dal CPE di replicazione virale, RNA o la sintesi delle proteine virali. - Centrifugare il sovranatante a 2.200 xga 4 ° C per 5 min.
* Lo scopo di questa fase è quello di pellet giù i detriti cellulari da stock virali. Una tenuta di aerosol secchio centrifuga è consigliato per una maggiore sicurezza. - Trasferire il surnatante in tappo a vite cryotubes 5 ml, e archiviare il passaggio 0 (P0) magazzino virus a -80 ° C per un ulteriore uso.
2. Amplificazione di P0 virus
- Il P0 campioni contengono spesso insufficiente titolo virale per esperimenti a valle 2. Un passo di amplificazione in VeroE6 cellule, che è un clone di rene di scimmia verde africana (Vero), le cellule mancano i geni IFN-alpha/beta 18,19, titolo virale aumenta fino al livello massimo. In alternativa, altre cellule prive di tipo I IFN risposte come le cellule Hec1B 20 o cellule MEF da IFNAR1 topi knockout 21 might essere utilizzata in questa fase. Diffusione VeroE6 cellule in 10 cm di piatti Dulbecco modificato medio minimo indispensabile (DMEM) (Invitrogen, Cat # 11965092) contenente 10% FBS, penicillina-streptomicina (Penicillina: 100 U / ml, streptomicina: 100 mg / ml) e incubare a 37 ° C in un incubatore al 5% di CO 2 fino a raggiungere l'80% confluenza.
* Ricombinante MP-12 ceppi di codifica NSS mutanti spesso non riescono a replicare in modo efficiente in tipo I IFN-competente cellule. - Mescolare 300 ml di P0 campioni con 2,7 ml di DMEM con 10% FBS e penicillina-streptomicina. Togliere terreno di coltura dalle cellule VeroE6 da 2,1 passo e sostituire con il campione diluito P0. Incubare a 37 ° C per 1 h in un'incubatrice con il 5% di CO 2.
- Rimuovere il inoculi e aggiungere 10 ml di DMEM con 10% FBS e penicillina-streptomicina per ogni piatto.
- Incubare a 37 ° C per 3 o 4 giorni fino CPE di VeroE6 cellule diventa evidente.
* Interruzione di monostrato si verifica durante un'infezione MP-12, whilricombinante e MP-12 NSS mancano, come rMP12-C13type (C13type) (Figura 4), non disturbare il monostrato, ma un certo numero di cellule morte galleggianti appaiono 2 o 3 giorni dopo l'infezione. - Raccolto il surnatante da 3 a 4 dpi, come descritto nei paragrafi 1.9) e 1.10), e designare i campioni come E6P1.
3. Titolazione di ricombinante MP-12 con il saggio della placca
- Diffusione VeroE6 cellule in 6 pozzetti.
* Analisi duplicati per campione è più affidabile di singola analisi. - Quando le cellule VeroE6 sono cresciuti a 80% confluenza, preparare diluizioni seriali di 10 volte di campioni di virus in DMEM con 10% FBS e penicillina-streptomicina fino al 06/10 come segue:
- 10 ml di E6P1 campione + 990 ml di DMEM con 10% FBS e penicillina-streptomicina (10 -2 diluizione)
- 100 l di 10 -2 campione + 900 ml di DMEM con 10% FBS e penicillina-streptomicina (10 diluizione -3)
- 10010 -3 l di campione + 900 ml di DMEM con 10% FBS e penicillina-streptomicina (10 diluizione -4)
- 100 l di campione di 10 -4 + 900 ml di DMEM con 10% FBS e penicillina-streptomicina (10-5 diluizione)
- Aspirare il terreno dal 6 pozzetti dal punto 3.1 e aggiungere 400 ml di ogni diluizione (dal punto 3.2) nei pozzetti (Figura 3).
- Incubare a 37 ° C per 1 h in un'incubatrice con il 5% di CO 2.
- Durante l'incubazione, preparare due provette da 15 ml per l'agar-copertura come segue:
Un tubo (tenere in bagnomaria 42 ° C): 7 ml di 1,2% agar nobili (VWR, Cat # 101170-362) in acqua
Tubo B (tenere in acqua a 37 ° C vasca da bagno): 7 ml di Modified Aquila Medium (MEM 2x) (Invitrogen, Cat # 11935046) contenente 10% FBS, penicillina-streptomicina (Penicillina: 100 U / ml, streptomicina: 100 mg / ml), e il 10% Triptosio fosfato brodo (MP Biomedicals, Cat # 1682149). - Dopo 1 ore di incubazione, rimuovere il viraleinoculi, e subito aggiungere 2 ml per pozzetto di una miscela 1:1 di un tubo e tubo B (dal punto 3.5).
* Fare attenzione ad aggiungere l'overlay immediatamente come prosciugamento dei pozzi provoca la morte delle cellule non infette. - Incubare le piastre a 37 ° C per 3 giorni in una incubatrice con il 5% di CO 2.
- Preparare tubo A e B del tubo di nuovo come descritto al punto 3.5. Preparare anche 500 ml di soluzione 0,33% di rosso neutro (Sigma Aldrich, Cat # N2889-100ML) per piastra che è anche mantenuto a 37 ° C acqua bagno.
- Mix tubo A, B e tubo da 500 ml (conc finale. 0,011%) di soluzione di rosso neutro e aggiungere 2 ml di miscela per bene.
* La quantità di soluzione di rosso neutro da aggiungere varia a seconda del lotto di soluzione di rosso neutro, e l'ottimizzazione iniziale è richiesto. Conservazione a lungo termine di 0,33% di soluzione di rosso neutro provoca precipitazioni. In tali casi, il precipitato può essere completamente sciolto dal incubazione a 55 ° C per 10 minuti seguita da agitazione violenta. L'uso di precipitare r neutralesoluzione ed i risultati in una debole colorazione delle cellule, mentre ri-sciolto le macchie di rosso neutro soluzione cellule bene. - Incubare la piastra per 16 ore (o tutta la notte) a 37 ° C in un incubatore con il 5% di CO 2.
- Contare il numero di placche nel pozzo, che contiene 10-100 placche per pozzetto. Calcolare il numero di unità formanti placca / ml. Per esempio, se osserviamo 28 placche nei pozzetti inoculato con la diluizione 10 -5, 28 (# delle placche) x (1 ml/0.4 ml) x 10 5 (diluizione) = 7.0 x 10 6 unità che formano placche (pfu) / ml (Figure 5).
4. Lo screening di mutanti privi del NSS di tipo I la funzione di soppressione IFN
- Diffusione C57/WT cellule MEF (InvivoGen, Cat # mef-c57wt), che codifica un secreto embrionale fosfatasi alcalina (SEAP) inducibile gene NF-kB ed IRF-3 / 7 (Figura 6), in 12-pozzetti. Le cellule sono mantenute in DMEM con 10% FBS, penicillina-streptomicina (Penicillin: 100 U / ml, streptomicina: 100 mcg / ml), Blasticidin S (3 mg / ml), e Zeocin (100 mcg / ml).
- Quando le cellule diventano sub-confluenti (80%), le cellule sono mock-infetti o affetti da MP-12 o ricombinante MP-12 mutazioni codifica NSS a molteplicità di infezione (moi) di 3 o 0,1 (vedere paragrafi 2 e 3, la quantità di ogni inoculo dovrebbe essere 300 ul). A 1 h dopo l'infezione, rimuovere il inoculi, e aggiungere 1 ml per pozzetto di DMEM con 10% FBS, penicillina-streptomicina (Penicillina: 100 U / ml, streptomicina: 100 mcg / ml) (Blasticidin Zeocin e non vengono aggiunti a questo tempo).
- A 14 h dopo l'infezione, raccogliere surnatanti cultura. Aggiungere 200 ml di quan-Blue (InvivoGen, Cat # rep-QB1) e 50 ml di ciascun campione (in triplice copia) nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Seal e incubare la piastra a 37 ° C per 1 h.
* Sia MP-12 e ricombinante MP-12 NSS manca chiaramente indurre soppressione traslazionale ospite in cellule competenti, compresa IFN-alpha/beta 293 cellule, cellule MRC-5 e mouse embryonic fibroblasti (MEF), le cellule dopo 14 ore dopo l'infezione alle alte moi. D'altra parte, IFN-beta mRNA o ISG56 mRNA si accumula abbondantemente a 7-8 ore dopo l'infezione di tipo I IFN cellule competenti. Così, abbiamo scelto 14 ore dopo l'infezione per raccogliere il surnatante per vedere l'accumulo di SEAP indotte da risposte immunitarie innate. - Leggere i valori di OD a 650 nm usando un lettore di piastre (Figura 7).
* I risultati sono coerenti con i dati ottenuti da Northern blot utilizzando una sonda di RNA specifico per il mouse ISG56 mRNA, che mostra up-regolazione di ISG56 mRNA in assenza di espressione di NSS (Figura 8).
* Si ricorda che l'attività SEAP è determinata dalla ricchezza di proteine che potrebbero essere interessati da attività di accoglienza di traduzione. Un livello relativo del SEAP non potrebbe essere alto rispetto al livello maggiore di mRNA SEAP perché non può essere sintetizzato anche in presenza di mRNA se SEAP traduzione cellulare è suppressed. Northern blot è un test più semplice e un modo più preciso per valutare la quantità di mRNA indotta dalla mancanza di funzioni NSS nelle cellule infette che il saggio giornalista SEAP. Tuttavia, il sistema giornalista SEAP è più rapido rispetto Northern blot e, quindi, utile per lo screening rapido di mutanti NSS potenzialmente privo di trascrizione funzione host soppressione.
5. Rappresentante dei risultati:
Il sistema di genetica inversa costantemente generato praticabile ricombinante MP-12 virus con titoli superiori a 1 x 10 6 pfu / ml. Virus C13type mancano funzioni NSS formata torbido placche di grandi dimensioni, mentre MP-12 formato placche evidenti di varie dimensioni 2 (Figura 5). Mock-cellule infettate MEF C57/WT o persone affette da MP-12 non ha aumentato il livello di SEAP nel supernatante della coltura rispetto al mock-cellule infettate, mentre il surnatante cultura della C57/WT cellule MEF infettati con C13type conteneva un aumentolivello di SEAP da 14 ore dopo l'infezione (HPI) (Figura 7). Questi risultati sono coerenti con quelli ottenuti da Northern blot utilizzando una sonda di RNA specifico per il mouse ISG56 mRNA (Figura 8).
Figura 1. Struttura del genoma di RVFV
RVFV ha un tripartito negativo-senso o ambisense genoma RNA chiamato S, M e L-segmento. S-segmento codifica dei geni N e NSS in maniera ambisense. N mRNA è sintetizzato da virus-senso (negativo-senso) S-segmento, mentre l'mRNA NSS è sintetizzato da anti-virale-senso (positivo-senso) S-segmento. M-segmento codifica per un mRNA singolo M e sintetizza the78kD, NSM, Gn o proteine Gc mediante la scansione di AUGs che perde parecchie 5'region di mRNA M, seguito dal loro co-traduzionali scissione 22,23. L-segmento codifica per la proteina L. Entrambe le proteine N e L sono essenziali per la trascrizione e la replicazione virale, mentre Gn e Gc sono le proteine dell'involucro virale. NSS e proteine NSm sono proteine non strutturali, che non sono incorporati in particelle virali.
Figura 2.. Progettazione di DNA plasmidico per il recupero di ricombinante MP-12 RVFV ceppo
La codifica cDNA full-length anti-virale-senso S, M o L-segmento sono cloneddownstream di promotore T7 e monte del virus dell'epatite delta (HDV) sequenze di ribozimi, designato come pProT7-S (+), pProT7-M (+), o pProT7-L (+), rispettivamente 2. T7 RNA polimerasi espresso in cellule BHK/T7-9 trascrive l'RNA codifica full-length S, M o L-segmento con precise genoma 3 '. L'open reading frame (ORF) di N o proteine L vengono clonati in dell'encefalomiocardite virus (EMCV) interno del sito di entrata ribosoma (IRES), che sono designati come PT7-IRES-VN o PT7-IRES-VL, rispettivamente, per consentire al uncapped T7 trascrizione RNA di essere riconosciuti dai ribosomi in cap-indipendenteammaccatura modo. La ORF M è clonato sotto pollo b-actina promotore di pCAGGS plasmide 24, che è designato come pCAGGS-VG, per permettere la sintesi di 78kD, NSM, Gn Gc e proteine, che sono generati da diversi AUGs attraverso la scansione che perde 23. Entrambe le proteine N e L sono necessari per l'avvio o la replica di trascrizione dell'RNA, mentre la PT7-IRES-VN e PT7-IRES-VL non sono essenziali per il recupero dei ricombinanti MP-12 2, probabilmente a causa del presumibile che perde espressione di Pol- II-driven innevate RNA trascritto codifica N-ORF e L-ORF da pProT7-S (+) e pProT7-L (+), rispettivamente.
Figura 3. Recupero di RVFV MP-12 da DNA plasmidico
Trasfezione delle cellule con BHK/T7-9 pProT7-S (+), pProT7-M (+), pProT7-L (+), PT7-IRES-VN, PT7-IRES-VL e pCAGGS-VG plasmidi (Fig.1 ) genera infettive ricombinante RVFV MP-12 ceppo nel supernatante della colturas. Il surnatante a 5 giorni dopo la transfezione vengono raccolti, e diversi passaggi in fresco le cellule Vero E6 per l'amplificazione virale. Tipicamente, più di 1 x 10 6 pfu / ml di virus possono essere recuperati a 3-4 giorni dall'infezione. Il virus amplificato (E6P1 virus) è titolato utilizzando test placca con Vero E6 cellule e utilizzato per l'analisi del fenotipo e studi di immunogenicità.
Figura 4. S-segmento MP-12 e rMP12-C13type
Il confronto tra MP-12 e rMP12-C13type (C13type) S-segmenti. Rispetto al NSS del MP-12 ceppo, l'ORF di NSS C13type viene troncato del 69%, ed è identico a quello della natura isolato clone 13 ceppo 2,25.
Figura 5. Dosaggio placca per MP-12 (NSS funzionale) e C13type (non funzionale NSS)
Il monostrato di Vero E6 celle in un 6-pozzetti viene utilizzato per il dosaggio della placca. Dopo 3 giorni di incubazione, con sovrapposizione agar 0,6%, il secondo strato di agar contenente neutro soluzione rossa viene aggiunto. Poi, le targhe sono contati al giorno 4 l'infezione. MP-12 forme placche evidenti, di varie dimensioni, mentre C13type forme torbide placche di grandi dimensioni (o fuochi). Il pozzo da 10 a 100 targhe devono essere utilizzati per il conteggio.
Figura 6. Percorso di attivazione del secreto fosfatasi alcalina (SEAP) C57/WT gene reporter in cellule MEF
Interferone-beta promotore include le sequenze legame di AP-1, NF-kB ed IRF-3. Replica RVFV attiva AP-1, NF-kB ed IRF-3 7,11. Tuttavia, NSS inibire il rilascio del complesso repressore dal IFN-beta promotore anche dopo la vincolante di tali fattori di trascrizione, eliminando quindi la sintesi di IFN-beta mRNA 26. Inoltre, NSS sequestra TFIIH p44 subunits8 e unLSO promuove la degradazione della subunità p62 TFIIH 27, inducendo così una generale soppressione trascrizione ospiti ivi compresi IFN-alfa gene e geni sotto il promotore ISRE. Mutanti NSS C13type o altri mancano IFN-beta funzione di soppressione indurre IFN-beta sintesi, che a sua volta attiva l'IFN-alfa promotore e l'interferone-sensibile elemento di risposta (ISRE) promotore. IRF-7 è quindi trascrizionalmente upregulated dalla stimolazione IFN-alpha/beta e ulteriormente upregulated da IFN-alfa a sostegno di IRF-3 28,29. In questo saggio, C57/WT cellule MEF codificare secreto fosfatasi alcalina (SEAP) a valle di una sequenza artificiale legame di NF-kB, IRF-3 e IRF-7. Così, i mutanti NSS manca IFN-beta funzione di soppressione upregulate SEAP la cui secrezione è poi misurato.
Figura 7. Induzione della SEAP da C13type
C57/WT cellule MEF (InvivoGen) erano finte-Infetti o affetti da MP-12 o rMP12-C13type (C13type) a moi di 3 (pannello di sinistra) o 0,01 (pannello di destra). Sovranatanti (50 ml) a 14 HPI sono stati mescolati con 200 ml di quan-Blue (InvivoGen) substrato in 96 pozzetti e dei valori OD a 650 nm sono stati misurati dopo 1 ore di incubazione a 37 ° C da un lettore di piastre. L'aumento relativo del SEAP per deridere le cellule infettate sono mostrati. I dati rappresentano la media + / - deviazione standard di tre esperimenti indipendenti. Il supernatante della coltura da C13type cellule infettate mostra SEAP aumentato, suggerendo la mancanza di soppressione ospitare trascrizione da NSS.
Figura 8. Northern blot con DIG RNA marcata con sonda
Wild-type fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule sono state infettate o mock-infettati con MP-12 o rMP12-C13type (C13type) a moi di 3. L'RNA totale sono stati raccolti a 7 hpi utilizzando Trizol (Invitrogen) e del Nord blotto è stato effettuato utilizzando la sonda marcata con digossigenina-RNA specifico per il mouse endogena ISG56 mRNA o MP-12 mRNA N / anti-virale-senso S-segmento 2,30. Per fare le sonde per il mouse endogena ISG56 mRNA o RVFV N mRNA / anti-virale-senso S-segmento, i frammenti di PCR amplificato dal set di primer di KpnmISG56F (GGG TGG ACT TAC CGC TCC TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG) e HindmISG56 (TAC AAA GCT TAT GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG) per ISG56 mRNA o KpnNF (AGT GGA CAT TGG TAC CAA CTA TCA AGA GCT TGC G) e HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG) per RVFV mRNA N / anti-virale-senso S-segmento sono stati digeriti con Kpn I e Hind III, e legato in pSPT18 plasmide (Roche. Poi sonde RNA marcato con digossigenina sono stati sintetizzati utilizzando DIG RNA Labeling kit (SP6/T7) (Roche, Cat # 1 175 025). Il livello 28S rRNA di ogni campione è anche indicato come il caricamento di controllo. wild-type MEF cellule infettate con C13type indotta ISG56 sintesi di mRNA, mentre quelli infettati con MP-12 Non lo induce, suggerendo la mancanza di soppressione trascrizione ospitante C13type cellule infettate. I dati sono in linea con quelli ottenuti mediante test SEAP in Figura 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sistemi di genetica inversa per RVFV sono stati sviluppati da diversi gruppi utilizzando promotore T7 2,4,5 o mouse 3 o umano 4 pol-I promoter. In questo manoscritto, si descrive un protocollo per generare ricombinante RVFV MP-12 ceppi utilizzando BHK/T7-9 15 cellule che esprimono stabilmente T7 RNA polimerasi. L'efficienza di recupero virale varia a seconda delle condizioni di BHK/T7-9 cellule, la quantità di plasmidi, il numero di cellule transfettate e così via. Abbiamo sempre amplificare il virus P0 a Vero E6 cellule di ottenere alte riserve di virus titolo per gli esperimenti. Tipo I IFN-competenti quali le cellule del polmone diploidi umane (MRC-5) le cellule potrebbero essere utilizzati per l'amplificazione virale solo quando la funzione di NSS sostenuto un efficiente replicazione virale, inibendo le attività antivirali tra cui IFN di tipo I o PKR.
Un test della placca è un metodo molto utile per la titolazione MP-12 e NSS i mutanti. Come precauzione generale per laanalisi della placca, le cellule devono essere immediatamente aggiunto con sovrapposizione alla temperatura appropriata dopo la rimozione di inoculi virale. Colorazione viola cristallo non è adatto per la rilevazione di placche virus C13type, perché virus C13type non disturbare il monostrato di cellule Vero E6 2. D'altra parte, neutrale colorazione rossa potrebbe rilevare correttamente le placche formate da virus C13type. La forza di colorazione cellulare con rosso neutro è determinata dalla incorporazione relativo di neutro colorante rosso in cellule vive. Quindi, è probabile che C13type cellule infettate hanno una ridotta attività metabolica che porta alla costituzione diminuzione del colorante rosso neutro rispetto a quello delle cellule non infette, e che costituisce un focus debole colorazione. La quantità richiesta di rosso neutro varia a seconda del lotto di soluzione di rosso neutro. Conservazione a lungo termine della soluzione di rosso neutro genera spesso precipita. Questo potrebbe essere impedito da sciogliere al calore di soluzione di rosso neutro a 55 ° C per 10 minuti, tuttavia,influisce sulla colorazione delle cellule.
E 'importante usare virus con accurata titolo virale negli esperimenti. Il titolo in un magazzino virale potrebbe essere diminuito di media con pH inferiore a 6.5 31 che è indicato dal colore giallastro di rosso fenolo nel magazzino virale, deposito a lungo termine, ripetuti cicli gelo-disgelo e così via. Quindi, è importante utilizzare fresca magazzino virale per la vaccinazione animale o titolare lo stock di nuovo poco prima di esperimento.
RVFV codificano due proteine caratterizzate non strutturali; NSS e NSM. La NSS RVFV manca è significativamente attenuato negli animali 25,32, mentre il NSm RVFV manca è ancora altamente virulento nei ratti 33. Così, NSS svolge un ruolo importante come fattore di virulenza nella patogenesi. NSS è una proteina multifunzionale che induce 1) soppressione della trascrizione serie generale 8, 2) la degradazione soppressione di IFN-beta sintesi di mRNA 26 e 3) di dsRNA-dependent proteina chinasi (PKR) 9,10. I genitori MP-12 ceppo potrebbe essere ulteriormente attenuato con l'introduzione di troncamento o mutazioni in NSS. D'altra parte, è anche importante mantenere l'immunogenicità di questi mutanti MP-12. IFN di tipo I gioca un ruolo per la maturazione delle cellule dendritiche, che è importante per le differenziazioni delle cellule T e cellule B 12-14. NSS vari mutanti privi IFN-beta funzione di soppressione, che mantenere le funzioni NSS totale o parziale, sono utili per analizzare l'impatto del NSS-mediata IFN-beta funzione di soppressione sulla immunogenicità e la sicurezza del candidato vaccino. E 'noto che le cellule infettate con il ceppo wt ZH548 RVFV attivare NF-kB, IRF-3, e AP-1 (Figura 6), mentre IFN-beta sintesi di mRNA viene soppressa da NSS a livello trascrizionale 7. Quindi, MP-12, che esprime perfettamente funzionante NSS 3, inibisce la sintesi di mRNA SEAP NF-kB/IRF-3/7-inducible gene reporter transcrilivello ptional, mentre ricombinante MP-12 funzioni NSS manca come C13type potrebbe indurre la sintesi di mRNA SEAP (Figura 7). Per comprendere correttamente il risultato di immunogenicità di questi mutanti, i fenotipi dovrebbero essere ulteriormente caratterizzato nel sistema di coltura cellulare. Per esempio, la cinetica replicazione virale dovrebbero essere testati in cellule di tipo I IFN competente come polmone diploidi umani MRC-5 fibroblasti o cellule embrionali di topo (MEF) cellule. La funzione di degradazione PKR può essere provata mediante Western blot con anticorpi specifici per PKR umano o il mouse. IFN-beta induzione dell'mRNA per mutazione NSS dovrebbe essere confermata da Northern blot con marcati con digossigenina RNA sonda specifica per la salute umana o mouse IFN-beta mRNA. Soppressione della trascrizione Host generale può essere verificato analizzando l'incorporazione di un analogo uridina in mRNA nascente. Alla fine, l'immunogenicità e la sicurezza del candidato MP-12 mutanti NSS devono essere testati nei topi. Pfu Tipicamente, 1 x 10 5 della candidate vaccino diluito in PBS è somministrato per via sottocutanea e sieri raccolti dai retro-orbitale seno al giorno 30 (o 42) e giorno 180 sono testati per la presenza di anticorpi neutralizzanti con la riduzione della placca neutralizzando prova (PRNT 80) e totale IgG contro RVFV N e Gn / Gc di IgG ELISA rivestita di proteine virali ricombinanti purificate. L'efficacia del candidato vaccino può essere testati dai topi impegnativo a 42 giornate di immunizzazione post con wild-type ZH501 (ad esempio, ip, 1 x 10 3 pfu) in animali biosicurezza livello (BSL) 4 strutture o maggiore BSL3 impianto + negli USA il contrario approccio genetica è un potente strumento per progettare e generare sicuro e immunogenico vaccini vivi attenuati RVFV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato per numero di Grant 5 U54 AI057156-07 tramite Western Centro Regionale di Eccellenza (WRCE), 1 AI08764301 R01-A1 da Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive, e un finanziamento interno da Sealy Centro per lo sviluppo di vaccini presso l'Università di Texas Medical Branch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR international | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma-Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | Invitrogen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | Invitrogen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | Invitrogen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
