Summary
犁鼻器（VNO）检测种内的化学信号，传达社会和生殖信息。我们已经进行钙离子成像实验，利用转基因小鼠犁鼻组织中表达的G - CaMP2。这种方法可以让我们来分析复杂的犁鼻器神经元的反应模式，以大量的信息素的刺激。
Abstract
犁鼻器（VNO）检测，化学感应信号在同一物种的1,2个人的社会，性和生殖状态信息。这些种内的信号，信息素，以及来自一些食肉动物3的信号，激活高水平的特异性和灵敏度 4犁鼻感觉神经元（VSNS） 。 G蛋白偶联受体V1R，V2R和FPR 5-14，至少有三个不同的家庭表示在犁鼻神经元的调解检测的化学感应线索。为了了解信息素的信息是如何编码的VNO，它是分析个人VSNS响应各种刺激，并确定这些反应的特异性受体介导的关键。
VNO neuroepithelia括在一对犁骨头。 VNO半盲管状结构有一个开口端（犁鼻管）连接到鼻腔。 VSNS延长树突的犁鼻器信息素线索接触表达的受体在树突状旋钮管腔部分。 VSNS的细胞体的形式与V1R和V2R伪分层表示层分别6-8在根尖和基底层。几项技术已被用于监察VSNS 4,12,15-19感官刺激的反应。急性切片准备在这些技术中，有几个优点。首先，3,17分离VSNS相比，切片的筹备工作保持在其原生形态和细胞树突的神经元保持相对完好。二，VSNS胞体很容易在冠状片的VNO访问，允许电生理研究和成像实验相比，整个上皮细胞和整个安装准备工作 12,20 。第三，这种方法可以结合分子克隆技术，让受体识别。
感官刺激会引起强烈的Ca 2 + VSNS涌入，表明受体激活 4,21 。因此，我们开发的转基因小鼠的嗅感觉神经元，其中包括VSNS 15,22表达的G - CaMP2。探针的灵敏度和遗传性，极大地促进钙离子成像实验。这种方法消除了染料4,21以前的研究中使用的加载过程。我们还采用了配体传递系统，可应用各种刺激的VNO片。这两种技术的结合使我们能够监测多个神经元，同时响应大量的刺激。最后，我们已经建立了一个半自动化分析的管道，以协助图像处理。
Protocol
1。溶液的配制
- 根据下表，准备R1的10X，10X的R2和10X R3的解决方案。
R1化学品 兆瓦（克/摩尔） 毫米（1X） 10倍的股票（G / L） 氯化钠 58.44 125 73.05 氯化钾 74.55 2.5 1.86 MgCl 2的 1中号股票 1 10毫升 氯化钙2 · 2H 2 O 147.02 2 2.94 的NaH 2 PO 4 · H 2 O 137.99 1.25 1.72
R2的化学 兆瓦（克/摩尔） 毫米（1X） 10倍的股票（G / L） 碳酸氢钠3 84.01 25 21
R3化学品 兆瓦（克/摩尔） 毫米（1X） 10倍的股票（G / L） 氯化钠 58.44 125 73.05 氯化钾 74.55 2.5 1.86 MgCl 2的 1中号股票 2 20毫升 氯化钙2 · 2H 2 O 147.02 2 2.94 HEPES 1中号股票 5 50毫升 - 实验当天混合双蒸水（DDW）和广告10X R1和10X R2的100毫升100毫升1升鼠标人工脑脊髓液（mACSF）ð 1.8克葡萄糖（最后10毫米）。这种制备方法可以防止在高pH值的碳酸钙沉淀。 mACSF渗透压约为310-315 mOsm / L。如果有必要的葡萄糖或水调整渗透压。充气前至少30分钟，溶液的pH值调整到7.2-7.4 Carboxygen气体（95％的氧气和5％的二氧化碳）的解决方案。
- 实验当天，1公升的林格氏液混合10X R2和DDW 10X R3的100毫升100毫升，并添加葡萄糖1.8克（10毫米）。林格氏液渗透压和pH值应该是类似的mACSF。曝气Carboxygen气体的解决方案。
- 准备mACSF或林格氏液在4％的低熔点琼脂糖（LMA）。分装在Eppendorf管熔化琼脂糖和储存于4 ° C，直到使用。 LMA，这是纯化的多糖组成，流体保持在37 ° C，并迅速巩固了在温度低于25 ° C。这些特性使其理想嵌入VNO和活组织生理。如琼脂，其他不纯的材料，不应该选择活组织实验未知的组件可能会干扰神经元的反应。
- 准备林格氏液中的信息素刺激。对于鼠标尿，1:100稀释会产生强大的反应。
2。 VNO片的制备
- 牺牲的动物之前，把一个加热块两管喉罩和设定温度> 60 ° C至融化琼脂糖。一旦凝胶液化，管转移到37℃的热块。
- 杀头一个G - CaMP2鼠标下面的CO 2安乐死。用剪刀剪的下颌骨骨去除下颌。剥落的山脊上腭组织暴露鼻腔（ 图1A）。分隔两个前门牙之间插入一个手术刀片的颚骨。小心取出颚骨暴露VNO。在这一点上，可以举起整个VNO从NASAL腔尾骨（ 图1B）控股。转让的VNO冷含氧mACSF解决方案。
- 根据清扫范围，使用提示＃5镊子轻轻滑动沿鼻中隔骨（ 图1C）壁分开的两个VNOS。剥离的犁骨包绕VNO组织。轻轻抬起整个VNO组织从骨腔。在此步骤中，应采取特别小心，不损伤神经上皮。小骨组织表面上留下的碎片，必须完全删除之前嵌入。组织上留下的碎片可能会陷入切割刀片，拉的琼脂糖块组织。
- 使用镊子举行的VNO组织后，轻轻地浸入到融化的琼脂糖（ 图1D） 。在冰上迅速冷却管，巩固琼脂糖。嵌入和冷却过程中应采取少于2分钟。
- VF300组织切片机（Precisionary INSTRuments，格林维尔，NC）是用来使部分。切琼脂糖块形状和胶水组织持有人（图1E和F）的VNO。插入金属圆柱体组织持有人，并填写余下额外LMA室。一旦LMA冰巩固，立即进行切片。供应切片室冷含氧mACSF，并开始在180-200微米厚度每片切割。调整的推进速度和振动频率，使该组织是在切片和VNO不属于琼脂糖压缩。收集和转移切片切片mACSF孵化室（ 图2A）。片是可行的含氧mACSF在室温下6-8小时。 图2B和C DIC和双光子图像显示一个G - CaMP2 VNO片，分别。
3。成像商会成立
- VNO片放置在中间的灌注室（锡斯基尤，资助通行证），并与片切片锚（华纳仪器，哈姆登，CT）（ 图3A）。锚线程应该只压片的喉罩的一部分，但不是VNO组织。含氧mACSF交付灌注腔通过进气口〜100μL/秒，并通过出油口的吸针排出的液体是通过提供了一个新鲜mACSF 的连续流（图 3A和B）。
- 填写林格氏液30毫升的注射器和钳注射泵（新时代的热泵系统，明代，纽约州）。 300-600μL/ min的设置泵的转速，提供一个连续流片（ 图3C）林格氏液。
- 林格到HPLC注射液循环（Chromtech，苹果谷，MN）（ 图3D）连接插座。交付量的精确控制，可以选择不同的循环大小。我们使用在O 20μL循环UR实验。注射闭环控制两个流路线（ 图3E）。在“负载”的位置，样品可以装入样品环与汉密尔顿精密注射器。退出多余的样品通过排污口的样品循环。林格氏液注射泵注入绕过样品循环和直接出线，这是连接到灌注头（ 图3A和E）。在“注水”的位置，流经样品循环泵解决方案，并推入插座 （图3E）的刺激。成像实验之前，应气泡赶出灌注液，以确保畅通。其他商业或自定义的喷射系统，也可以刺激交付实施。
- 调整灌注下的5倍或10倍镜头提示，使针尖远离VNO片约1毫米。
- 当一个新的灌注系统设置，最好是测量样品的延迟时间和durATION与荧光染料。 0.1％罗丹明6G染料装入样品循环和开关阀注入后5秒的图像采集开始的位置（图3F） 。检测到荧光信号是10-30秒之间。荧光信号的平滑曲线还表明，有一点倾斜镜头和有足够的灌注含氧mACSF达到切片下产生的湍流。
4。时间的推移成像
- 我们用一个时间的推移成像10X或20X水浸渍镜头蔡司AxioSkope FS2显微镜。标准GFP带通滤波器（450 - 490nm处）是用于G - CaMP2信号。啶图像是由CCD相机（蔡司人力资源管理）收购与1X1或2x2分级根据的G - CaMP2的表达水平。
- 设置采集速度每秒1张。调整光的强度，以尽量减少漂白的G - CaMP2信号和光损伤的细胞。对于每个前实验中，我们通常获得60帧图像堆栈（约60-70秒）。切换阀注入的位置，一个实验，在所有试验中获得一致的时间延迟在一个特定的时间点（ 例如，在图3F 5秒）。
- 执行测试运行使用林格氏液的刺激。重新调整灌注设置，如果进样期间推出运动神器。
- 执行积极的控制林格氏液在1:100稀释的小鼠尿液运行。典型的最大价值的G - CaMP2响应鼠标尿ΔF/ F 20-40％左右。如果需要，可以确认提供林格10毫米氯化钾刺激在实验结束时的片片的可行性。
- 林格氏液洗至少三次加载后一个刺激汉密尔顿注射器。洗与林格氏液至少有三个不同的刺激之间的时间样本循环。这些步骤之间differe防止交叉污染NT样本。
- 等待4-10分钟VSNS恢复，然后再应用下一个刺激。
5。数据分析
- 执行图像从一个切片获得的图像登记。我们AxioVision（卡尔蔡司，北美）使用自定义编写的VBA脚本来自动完成这一过程。同样的实验范围内的所有图像帧注册对付共同的选择与弹性登记（ 图 4A）的参照系。弹性又称非线性登记，注册，是一类强调目标图像的改造非硬性参考图像的图像配准技术。在这里，我们用从AxioVision实施。
这个参照系是任意选择的图像堆栈。 - 执行图像减法来确定响应细胞。我们使用ImageJ v1.42定制编写的宏（ http://rsb.info.nih.gov/ij/ ，国立卫生研究院马里兰州贝塞斯达）自动完成这一过程。每个堆栈产生一个最小的投影图像。回应细胞后出现的最小投影是从原料栈（ 图4B）减去。
- 减去堆栈确定感兴趣区域（ROI），并取得使用ImageJ多测量插件的ROI坐标。所有堆栈为一个实验处理，并保存所有的投资回报率的坐标在投资回报率的主列表（ 图4C） 。
- 使用ROI主列表来衡量，从自定义编写的宏观和多测量插件ImageJ（图 4D）的原始图像栈的细胞反应。积响应曲线，并在Matlab中的热图（MathWorks公司，Natick郡，马）。
6。代表性的成果
使用从四个独立的小鼠收集的尿液样本的VNO成像实验的一个例子是如图 5所示。切片响应尿液刺激与不同的patterns激活。约80细胞识别至少一个尿液的刺激，他们的反应ΔF/ F值绘制热图（ 图5A）。绘制在图5B显示尿液刺激的时间当然激活细胞1，2和3的反应痕迹。单元1显示了两个女的尿液样本，但不是男性样本，而细胞2显示激活相反的模式和响应都只有男性的样本。单元3被激活个人的男性和女性样本。细胞1和2显示了典型反应性的具体线索，尿液中的15。
图1 VNO清扫过程示意图。A. VNO在鼠标头部的解剖位置。头一个G - CaMP2鼠标已解剖，并奠定了软吨倒挂从腭揭露VNO删除的问题。入口荧光图像显示了相同的图片。 neuroepithelia的VNO是明亮的绿色。B.犁骨（上）和相同的VNO（底部）的荧光图像，是在封闭的隔离VNO 侧视图 。C.一个VNO和解剖冠状的过程。一个VNO是分开的隔，然后可以拆下来摆脱的神经上皮和犁骨 D. VNO是嵌入到LMA。大肠杆菌嵌入式块粘切片组织持有。组织持有人是在180-200每片推铁桶琼脂糖块切片微米先进。切割刀片的定位密切的铁桶。F. VF300组织切片机系统的侧视图。 BV的血管。东北，神经上皮。
图3插图灌注系统设置。 答：典型的灌注腔入口和出口。 VNO片被定位在室中心和按用纸巾锚。中间的线程将被删除组织的锚，使VNO组织未按 。灌注腔放在显微镜下阶段下浸渍目标。 mACSF入口，吸风口和灌注头表示，单管注射泵提供通过灌注尖端林格氏液的连续流。D.高效液相色谱法仁济ction闭环系统是通过刺激方便样品装载和注射。E.示意图插图装载和注射位置的方向。林格氏液，绿色。刺激的样本，洋红色。箭头指示流向。F.延迟和洗掉灌注系统的时间测量。罗丹明6G荧光染料装入样品循环和阀切换到5秒，这是一个箭头表示的注射位置。荧光信号的变化是在10-30秒之间，减少事后检测。
图4图像处理流水线。A.一个切片图像帧注册对一个参照系。B.从原始帧堆栈的最小投影减法。后加减响应细胞变得突出。 三 ř机会性感染选择编译成主列表和它们的坐标。D.响应使用的投资回报率从原材料栈主列表细胞测量。
图5代表的G - CaMP2 VNO成像实验与个别男性和女性的尿液刺激了切片答 ：ΔF/ F响应热图。收集尿液样本是从个体雄性和雌性小鼠。 X轴，响应从切片确定的细胞。 Y轴，实验中所用的尿液样本。彩条表示ΔF/ F值。B. A中箭头标记的3个有代表性的细胞响应时间当然表明刺激应用程序的时间。 F - FVB，女性FVB的F - CBA，CBA的女性，M - FVB，雄性FVB，M - BL6，雄性C57BL / 6。
特定的试剂和设备表：
| 名称试剂 | 公司 | 目录编号 | 评论（可选） |
| 灌注腔 | 锡斯基尤 | PC - H | 水平 |
| 切片按住向下 | 华纳仪器 | SHD - 22CL | |
| 灌注端口持有人 | ALA的科学，公司 | MPIOH - S | |
| 注射泵 | 新时代的泵系统，公司 | NE - 300 | |
| 低压注射阀 | Chromtech | V - 451 | |
| PEEK管 | Chromtech | 1531 | 1 / 16“OD，0.25毫米ID |
| 聚醚醚酮样品回路 | Chromtech | 1803 | 20微升 |
| 汉密尔顿注射器 | Chromtech | 80630 | 加入100μL |
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Discussion
大多数的犁鼻器受体（VRS）保持作为，因为他们发现由杜拉克和Axel 5的孤儿受体。这些化学感应受体和他们在调解动物行为中的作用的信息素配体不能很好地理解。到现在为止，只有一对配体/受体，ESP1肽及其受体，Vmn2r116（V2Rp5），已确定并传达特定的社会信息，19,23。另一个受体，V1rb2，已被证明回应2 -庚酮，这大概是从雌性小鼠24尿液丰富。然而，此配体所传达的具体信息尚不清楚。此处我们所开发的的方法，使犁鼻器神经元的反应，以大量的刺激和激活模式的分析表征。通过使用这种方法，我们发现，细胞显示男性或女性尿液中的具体反应和细胞有可能是专门运作承认具体性信息素线索15。这些细胞表达的自愿退休尚未确定。这里描述的影像处理方法，不仅可以使尿液中的信息素配体的筛选，也便于识别的特异性受体，应对信息素线索。
钙传感器的G - CAMP的家人一直在各种动物和它们的信号已被证明与钙瞬变 25-28以及关联。使用基因编码的传感器提供了敏感的神经元的反应的读数，并允许在有针对性的组织和细胞类型的传感器的具体体现。基因编码的传感器也有可能使慢性成像在活的动物。传统上，合成钙染料已被用于监测钙的反应。染料的加载程序都不可避免地侵入并经常组织造成损害。负载不均衡和有限的染料渗透在TISSUE也显著影响钙信号的检测。
在我们的实验使用的G - CaMP2小鼠中，我们发现的反应幅度看齐，或者比片制剂，钙染料加载方法更好。 VNO片可以保持在一个小时的健康状况，从而允许在一个实验中，刺激大量的分析后切片。然而，基因编码的传感器通常含有蛋白质域，可能与细胞成分相互作用，从而改变反应模式，甚至影响有机体的正常发展。一个一定要谨慎，当一个新的传感器系统介绍。仔细检查有针对性的组织是必需的。在我们以前的研究中，我们已经研究了其与生俱来的行为，犁鼻器神经元的电生理特性和嗅感觉神经元的投影模式的G - CaMP2小鼠。这些方面都没有受到影响，在G -CaMP2小鼠。然而，利用转基因动物，动物维修和基因分型招致的额外费用。此外，实验是有限生成的可用行。这些设计实验时，需要考虑的因素。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢安德烈莫兰连同实验动物服务设施（LASF）的成员，他们对畜牧业和技术服务的优秀支持在斯托瓦斯研究所。这项工作是支持，从斯托瓦斯研究所和国立卫生研究院（NIDCD 008003）资金，哭了。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立耳聋与其他交流障碍研究所或国立卫生研究院的官方意见。美国正在申请专利的斯托瓦斯研究所，哭和LM的tetO - G CaMP2小鼠。
References
- Birch, M. C. Pheromones. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).
- Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).
- Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141, 692-703 (2010).
- Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
- Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
- Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
- Ryba, N. J., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Neuron. 19, 371-379 (1997).
- Pantages, E., Dulac, C. A novel family of candidate pheromone receptors in mammals. Neuron. 28, 835-845 (2000).
- Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies. Genomics. 83, 802-811 (2004).
- Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
- Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors. Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).
- He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ. Science. 320, 535-538 (2008).
- Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
- Chamero, P. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450, 899-902 (2007).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437, 898-901 (2005).
- Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
- Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
- He, J. Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).
- Haga, S. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466, 118-122 (2010).
- Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).
- Hendel, T. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in. 28, 7399-7411 (2008).
- Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators. J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).
- Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
