Summary
Spin-trapping spectroscopie RPE a été utilisée pour étudier l'effet des antioxydants végétaux lycopène, Pycnogenol et l'extrait de pépin de raisin sur le piégeage en phase gazeuse des radicaux libres dans la fumée de cigarette.
Abstract
Le tabagisme est associé à des cancers humains. Il a été rapporté que la plupart des décès par cancer du poumon sont causés par la cigarette 5,6,7,12. Bien que les goudrons du tabac et des produits connexes dans la phase particulaire de la fumée de cigarette sont les principales causes des maladies cancérigènes et mutagènes connexes, la fumée de cigarette contient des quantités significatives de radicaux libres qui sont aussi considérées comme un groupe important de substances cancérogènes 9,10. Les radicaux libres attaquent les constituants cellulaires par la structure des protéines nuisibles, des lipides et des séquences d'ADN et d'augmenter les risques de développer divers types de cancers. Radicaux inhalation de produire des adduits qui contribuent à de nombreux effets négatifs sur la santé de la fumée de tabac dans le poumon 3. Des études ont été menées pour réduire les radicaux libres dans la fumée de cigarette diminue les risques de dommages causé par la cigarette. Il a été rapporté que l'hémoglobine et l'hème composés contenant pourrait partiellement récupérer l'oxyde nitrique, réactifoxydants et cancérigènes nitrosocompounds volatile de 4 fumée de cigarette. Une «bio-filtre» se composait de carbone activé hémoglobine et a été utilisé pour piéger les radicaux libres et d'éliminer jusqu'à 90% des radicaux libres à partir de 14 fumée de cigarette. Toutefois, en raison du coût-inefficacité, il n'a pas été commercialisée avec succès. Une autre étude a montré une bonne efficacité du nettoyage des shikonine, une composante de la phytothérapie chinoise 8. Dans la présente étude, nous présentons un protocole pour l'introduction commune extraits antioxydant naturel dans le filtre à cigarette pour les radicaux libres en phase gazeuse de la fumée de cigarette et de mesure de l'effet de piéger sur les radicaux libres en phase gazeuse de la fumée primaire de cigarette (MCS) en utilisant spin-trapping résonance de spin électronique (ESR) Spectroscopie 1,2,14. Nous avons montré une grande capacité de balayage du lycopène et de l'extrait de pépins de raisin qui pourraient pointer vers leur application future de filtres de cigarettes. Un avantage important de ces prospective des charognards, c'est qu'ils peuvent être obtenus dans de grandes quantités de sous-produits de l'industrie de la tomate ou de vin, respectivement 11,13
Protocol
1. Matériaux
Tous les solvants utilisés dans ce travail étaient de qualité réactif. Le piège de spin, dont la N-tert-butyl-α-phénylnitrone (NEA) et le label de spin standard 2,2,6,6-tétraméthyl-1-piperinyoxyl (TEMPO) ont été obtenus auprès de Sigma et ont été utilisés tels que fournis. Les antioxydants végétaux ont été obtenus dans le commerce chez Swanson, Inc Etats-Unis.
2. Préparation de la fumée de cigarette et de l'analyse des radicaux libres
- Pour introduire des antioxydants dans le filtre, le Pycnogenol antioxydants et d'extrait de pépins de raisin ont été d'abord dissous dans l'éthanol à 95%, tandis que le lycopène a été dissous dans l'acétone. Les volumes de solvant ont été différentes selon la solubilité antioxydant.
- La quantité d'antioxydants de 0,4 mg / filtre a été utilisé. Ils ont ensuite été revêtues avec 10 mg de charbon actif. A cet effet, le carbone activé a été agité pendant ~ 12 h avec la solution anti-oxydant dans des conditions anaérobies, filtré et séché sous vide. Les antioxydants ont ensuite été introduites dans le filtre d'acétate conventionnelle (AC filtre). A cet effet, le filtre a été coupé en deux morceaux. L'usine de revêtement anti-oxydants ont été insérés entre deux pièces du filtre et enveloppé d'un morceau de ruban adhésif pour former un filtre - filtre anti-oxydant sandwich (fig. 1A). Ce filtre a été ensuite combinées attachés à des tiges de cigarettes contenant du tabac. Le contrôle du filtre a été faite de la même manière que le filtre anti-oxydant, sauf aucun antioxydant a été ajouté.
- Avant la simulation de fumer, les cigarettes de recherche ont été déballés et conservé dans un environnement à humidité constante (20 ° C, humidité relative 60%) en utilisant une solution de NaBr saturée pour un minimum de 2 jours.
- Fumer de simulation pour l'analyse de routine a été effectué à température ambiante en utilisant un dispositif de fumer à port unique qui, comme indiqué dans la Fig.1, se compose d'un aspirateur à eau ou pompe à vide GAST DOA-P104-BN / Compresseur d'air (Benton Harbor, Michigan) connecté à l'spin-trappingAssemblée grâce à une jonction en T avec une extrémité ouverte. Puffs ont été effectuées en branchant l'extrémité ouverte, qui est resté ouvert entre deux bouffées. Le flux de gaz a été vérifiée par un débitmètre et réglé à ~ 2,2 SCFH = 17,5 mL / s en ajustant une vanne placée entre la pompe et l'évent.
- Les cigarettes de recherche ont été fumées dans l'état de volume de bouffée de 35 mL pour une durée de 2 secondes répétées toutes les 60 secondes, semblable à une. Simulation de fumer pour l'estimation quantitative de la phase gazeuse des radicaux libres a été réalisée en collaboration avec le système de piégeage de spin, comme indiqué dans la Fig. 1.
- Dix bouffées intenses (35 ml / bouffée) ont été prises pour chaque cigarette. En phase gazeuse les radicaux libres ont été recueillies par le passage de la MCS à travers un tampon Cambridge filtre et ensuite introduit dans la solution de piégeage de spin (0,05 M PBN dans le benzène, le 2,0 mL).
- Après la dernière bouffée, la solution de piégeage barbotage a été réajusté à son volume initial (2,0 ml) avec le benzène mêmes. Une aliquote a été transféré dans un 25 ~0 mm de long, 3 tube de verre mm ID scellé à une extrémité.
- La solution de piégeage a été désoxygéné en utilisant une procédure de gel-dégel pompe. Il a été congelé dans l'azote liquide, et un vide a été appliqué. Ensuite, il a été décongelé sous atmosphère d'argon, permettant à des bulles de gaz de s'échapper, et congelés à nouveau. Après ce cycle a été répété trois fois, le tube a été scellées à la flamme sous vide et utilisé dans d'autres mesures ESR. Cette étape est nécessaire parce que l'oxygène, ce qui est bien soluble dans le benzène, élargit lignes ESR de radicaux organiques. Désoxygénation améliore considérablement le rapport signal-bruit.
- X-Band ESR spectres ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker EMX à une fréquence de 9,34 GHz dans des conditions standard. Les réglages du spectromètre utilisé dans la plupart des expériences ont été: centre du champ 3312.5G, largeur de balayage 80G, modulation d'amplitude 0,5 G, la constante de temps 82 microsecondes, temps de cycle 40 sec.
- Les adduits piège de spin sont relativement stables dans les conditions de l'expérience, qui dans certains cas, required 25 accumulations, qui sont généralement pris ~ 20 min. Cependant, après 12 heures de l'intensité des signaux ESR dans une solution de benzène a diminué d'un facteur ~ 5.
- Afin de quantifier la concentration de l'adduit piégeage, son spectre initial ESR première dérivée a été intégré. Le spectre d'absorption résultant montre un fond singulet large, probablement dû à la suie / tar produits contenus dans la fumée.
Après soustraction de cette toile de fond le triplet séparés de l'adduit piégeage a été intégrée une fois de plus (Fig. 2).
3. Les résultats représentatifs
La plupart des radicaux libres dans la combustion de cigarettes fumées produites (phase gazeuse) sont instantanés et instable. Afin d'observer ces radicaux une technique piège spin est employée. Il capture en phase gazeuse des radicaux libres en les transformant en un adduit spin qui est plus stable et peut être détecté par ESR (Fig.1). Dans la présente étude, la solution spin-trap de 0,05M NEA a été utilisé pour recueillir le gaz de fumée phase de radicaux libres, qui sont un mélange de radicaux d'oxygène et de carbone-centré, qui sont difficiles à séparer 15. Dans notre cas, cependant, les constantes observées transition hyperfine A = N 13.7G et H = 1.95g sont très similaires aux valeurs correspondantes pour le piégeage des adduits de alcoxyle radicaux libres (Ro) 2, ce qui suggère qu'ils sont le produit principal. Nous avons montré que les signaux faibles ESR et faible reproductibilité observée dans nos mesures initiales (Fig. 2) étaient dus à l'humidité dans le flux de fumée. Pour résoudre ce problème, nous avons ajouté un azote liquide (LN2) piège entre le filtre Cambridge et la solution piège spin. Le piège de LN 2 retiré de l'eau à partir du flux MCS par congélation rapide et de la capturer sur la paroi interne du tube de verre. Cela a grandement amélioré les signaux ESR et ont permis des résultats très reproductibles (fig. 3).
Le montant de radicaux libres piégés a été déterminée en utilisant unéchantillon de référence. Pour les échantillons de contrôle sans antioxydants, la concentration en benzène adduit typiques estimé par comparaison de son spectre intégrale double avec un spectre à double intégrale pour la concentration connue de TEMPO était de 1,24 uM (Fig.2). Puisque la quantité d'air traversé chaque cigarette pendant le fumage a été ~ 350 ml, ce qui donne une estimation de la concentration des radicaux libres dans la phase gazeuse du MCS de ~ 7.1X10 -9 M, et un nombre total de radicaux piégés par la phase gazeuse d'une cigarette entière de ~ 1.5x10 15. Une estimation du montant total de radicaux libres dans la fumée d'une cigarette entière, y compris à la fois du gaz et la phase particulaire, a été ~ 10 16 radicaux libres 9.
Différents niveaux de l'effet de balayage des antioxydants végétaux sur la phase gazeuse des radicaux libres dans la fumée de cigarette principaux flux ont été observées. Leur taux de balayage ont été présentés dans la Fig. 4. Le lycopène et l'extrait de pépins de raisin a montré le plus fort taux tout en basTaux ER a été observée pour Pycnogenol (Fig.4).
Figure 1. Un schéma de conception de simulation de fumer améliorées pour la collecte en phase gazeuse des radicaux libres dans la fumée de cigarette dominante (MCS) en utilisant piège spin. MCS a été dessiné par un aspirateur d'eau grâce à CA filtre, puis Cambridge filtre (filtre jaune) et passé à travers un piège à azote liquide pour éliminer H 2 O. Les produits en phase gazeuse finalement allé à tourner piège et barboter dans la solution piège spin. Antioxydante des végétaux a été placé entre deux morceaux de filtres en acétate conventionnelle (élargie au cercle A) attaché à cigarette pour éliminer les radicaux libres dans le MCS.
Figure 2. Une estimation quantitative de la concentration d'adduits spin-trapping dans le benzène nécessite soustrayant un signal de fond de la vaste intégration premièreL spectre. Les paramètres de la transition hyperfine de l'adduit spin-trapping sont un H = 1,95 G, A = N 13.7G.
Figure 3. Passant par LN2 piège améliore sensiblement la qualité des signaux ESR obtenues par spin-trapping du MCS.
Figure 4. Effet d'antioxydants naturels sur la concentration des radicaux libres dans le MCS. Les intensités de signal relatif sont: le contrôle - à 100%, Pycnogenol - 55%, extrait de pépins de raisin - 12%, le lycopène - 10%.
Discussion
Une estimation fiable de l'effet de différents anti-radicaux libres dans la fumée de tabac nécessite une technique reproductible pour la détection quantitative des radicaux libres. Auparavant 1, il a été démontré que de faibles volumes de solutions de concentration supérieure piège de spin dans les solvants non polaires sont les plus efficaces pour piéger les radicaux libres de la fumée de tabac. La fumée de cigarette contient toujours la vapeur d'eau provenant de la combustion de composés organiques et l'humidité résiduelle dans le tabac qui peut se retrouver dans le solvant de piégeage. Ce mélange de l'eau dans la solution NEA piège tour diminue considérablement la durée de vie des adduits piégeage de spin et l'intensité de leurs signaux ESR. La suppression de cette humidité par simple MCS passant par un tube en U refroidi à l'azote liquide a considérablement amélioré la qualité des spectres ESR dans nos expériences, même si une certaine fraction de la phase gazeuse peut être aussi radicaux piégés sur la surface gelée.
Utiliser tsa technique, nous avons comparé l'efficacité relative des différentes antiradicalaire composés naturels introduits dans les filtres à cigarettes. Nous avons constaté que le lycopène et d'extrait de pépins de raisin immédiatement après incorporation dans les filtres à cigarettes sont capables de piéger jusqu'à 90% de radicaux libres de la MSC en phase gazeuse. Cette capacité de haute classe ces charognards bon aisément disponibles composés naturels parmi les plus efficaces rapporté sans protecteurs radicaux comme l'hémoglobine et shikonine 8,14. Pourtant, dans nos expériences les filtres à cigarettes chargé avec des antioxydants naturels étudiés perdu une partie notable de leur capacité de désactivation après une semaine de stockage à température ambiante. Résoudre ce problème peut stimuler l'application future de lycopène et d'extrait de pépins de raisin dans les filtres de cigarettes commerciales.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health, NIH Grant No. / NCRR P41-RR 016 292 (pour ACERT).
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