Summary
스핀 - 트래핑 ESR 분광법은 공장 산화 억제제 lycopene, pycnogenol와 담배 연기의 가스 상에게 자유 래디 칼을 청소에 포도 종자 추출물의 효과를 연구하는 데 사용되었다.
Abstract
흡연은 인간의 암와 관련된 것입니다. 이것은 폐암 사망자의 대부분은 흡연 5,6,7,12로 인해 발생하는 것이보고되었습니다. 담배 연기의 입자 단계에서 담배 tars 및 관련 제품이 발암성 및 mutagenic 관련 질병의 주요 원인이지만, 담배 연기도 9,10 물질들의 중요한 그룹으로 간주됩니다 자유 래디 칼의 상당 금액을 포함하고 있습니다. 자유 래디 칼은 손상 단백질 구조, lipids과 DNA 시퀀스에 의해 세포 성분을 공격하고 암 다양한 형태의 개발의 위험을 증가시킵니다. 흡입 급진파는 폐 3 담배 연기의 부정적인 건강 효과를 많은 기여 부가물을 생산합니다. 연구는 흡연 유발 손상의 위험을 감소하기 위해 담배 연기에 자유 래디 칼을 줄이기 위해 실시되었습니다. 이것은 헤모글로빈과 헴이 함유 화합물 것은 부분적으로 질산 산화, 반응을 청소 수있는 것으로보고되었습니다oxidants와 담배 연기의 4 발암성 휘발성 nitrosocompounds. 헤모글로빈과 활성탄은 자유 래디 칼을 청소하고 담배 연기 14에서 자유 래디 칼의 90 %까지 제거하는 데 사용된의 '바이오 필터'는 구성된. 그러나, 비용 비효율로 인해, 그것은 성공적으로 상용화되지 않았습니다. 또 다른 연구는 shikonin, 중국 한방 의학 8 구성 요소의 좋은 청소 효율을 보여주었다. 현재 연구에서는, 우리는 스핀 - 트래핑을 사용하여 주류 담배 연기에 가스상 자유 래디 칼의 청소 효과 (MCS)의 담배 연기 및 측정의 가스상 자유 래디 칼을 청소에 대한 담배 필터에 일반 자연 항산화 추출물을 도입을위한 프로토콜을보고 전자 스핀 공명 (ESR) 분광학 1,2,14. 우리는 lycopene과 담배 필터에 자신의 미래의 응용 프로그램을 가리킨 수있는 포도 종자 추출물의 높은 청소 능력을 보여주었다. 이 프로의 중요한 이점pective 청소부들은 각각 토마토 또는 와인 산업의 부산물 11,13에서 대량으로 얻을 수있다는 것입니다
Protocol
1. 자료
이 작품에 사용된 모든 용매는 시약 등급 있었다. 스핀 N - tert - 부틸 - α - phenylnitrone (PBN)와 표준 스핀 라벨을 포함하여 트랩, 2,2,6,6 - tetramethyl - 1 - piperinyoxyl이 (템포) 시그마에서 얻은되었고 공급으로 사용되었습니다. 공장 산화 억제제는 Swanson, 주식 회사 미국에서 상업적으로 획득했다.
2. 자유 래디 칼의 담배 연기 및 분석의 준비
- lycopene은 아세톤에 녹아있는 동안 필터에 산화 억제제를 소개하려면, 산화 억제제의 pycnogenol과 포도 종자 추출물 먼저, 95 % 에탄올에 용해되었다. 솔벤트 볼륨 항산화 용해도에 따라 달랐다.
- 0.4의 산화 억제제의 양은 MG / 필터가 사용되었습니다. 그들은 다음 활성탄의 10 MG로 코팅했다. 이런 목적을 위해 활성 탄소 필터와 진공 하에서 건조 무산소 조건에서 항산화 솔루션 ~ 12 시간을 위해 흔들되었다. 산화 억제제는 다음 종래의 아세테이트 필터 (CA 필터)에 도입되었습니다. 이를 위해 필터를 두 조각으로 절단되었다. 항산화 필터 샌드위치 (그림 1A) - 코팅 공장 산화 억제제는 필터를 형성하기 위해 필터와 테이프의 조각으로 싼 두 조각 사이에 삽입되었습니다. 이 결합된 필터는 이후에 담배를 포함하는 담배 막대에 붙어 있 었지. 필터가없이 항산화 제외 항산화 필터와 같은 방식으로 만들어진 컨트롤이 추가되었습니다.
- 전에 흡연 시뮬레이션하는 연구 담배는 압축을 푼 2 일 최소 포화 NaBr 솔루션을 사용하여 일정한 습도 환경 (20 ° C, 60 % 상대 습도)에 보관되었다.
- 일상적인 분석을 위해 흡연 시뮬레이션이로 Fig.1과 같이 단일 포트 흡연 장치를 사용하여 주위 온도에서 공연되었다, 물 흡인기 또는 GAST DOA - P104 - BN의 진공 펌프 / 공기 압축기 (벤톤 하버, Mich) 연결로 구성되어 있습니다 스핀 - 트래핑하기오픈 한 쪽 끝에있는 T - 교차점을 통해 조립. 퍼프는 퍼프 사이에 열어 두었던 오픈 엔드를 연결해에 의해 수행되었다. 가스 흐름이 유량계에 의해 체크 ~ 2.2에 설정된 SCFH = 17.5 펌프와 통풍구 사이에 위치 밸브를 조정하여 ML / s의.
- 연구 담배는 1과 비슷한 60 초마다 반복 이초의 기간 동안 35 ML의 퍼프 볼륨의 상태에 따라 훈제했다. 가스 상 자유 래디 칼의 양적 추정을위한 흡연 시뮬레이션으로 그림에 표시된 스핀 트래핑 시스템과 연계하여 수행되었다. 1.
- 열 강한 퍼프 (35 ML / 퐁퐁)은 각 담배에 대한 촬영했다. 가스 상 자유 래디 칼은 캠브리지 필터 패드를 통해 MCS를 전달하여 수집된 후 스핀 트래핑 솔루션 (벤젠, 2.0 ML에서 0.05 M PBN)에 도입되었습니다.
- 마지막 퍼프 후, 부풀어 오른 트래핑 솔루션은 동일한 벤젠과 초기 볼륨 (2.0 ML)로 재조정했다. 나누어지는는 ~ 25 안으로 옮겨졌 다가길이 0mm, 한쪽 끝에 봉인 3mm의 ID 유리관.
- 트래핑 솔루션은 냉동 펌프 - 해동 절차를 사용 deoxygenated되었습니다. 그것은 액체 질소에 따라 냉동었고, 진공이 적용되었습니다. 그렇다면 그것은 함정에 가스 거품이 탈출 수 있도록, 아르곤 분위기 하에서 해동되었고, 다시 냉동. 이 사이클은 세 번 반복 후, 튜브했습니다 불꽃 - 밀봉 진공하에 추가적인 ESR 측정에 사용. 벤젠에 잘 용해됩니다 산소, 유기 래디 칼의 ESR 라인을 넓혀 때문에이 단계가 필요합니다. 탈산소 반응은 극적으로 신호 대 잡음 비율을 향상시킵니다.
- X - 밴드 ESR 스펙트럼은 표준 조건에서 9.34 GHz의 주파수에서 Bruker EMX 분광계에 기록되었다. 대부분의 실험에 사용되는 분광계 설정되었습니다 : 센터 현장 3312.5G, 스캔 폭 80G, 변조 진폭 0.5G, 시간 상수 82 마이크로초, 검사 시간 40 초.
- 스핀 트랩 부가물 어떤 경우에는 req 실험 조건에서 비교적 안정일반적으로 ~ 20 분 데려 25 쌓일, uired. 그러나, 12 시간 이후 벤젠 용액의 ESR 신호의 강도가 ~ 5 요소에 의해 감소.
- 트래핑 adduct의 농도를 정량하기 위해 초기 처음 유도체 ESR 스펙트럼이 통합되었습니다. 그 결과 흡수 스펙트럼의 연기에 포함된 검댕 / 타르 제품에 따라 가능성이 가장 광범위한 일중 배경을 보여줍니다.
뺄셈 후에이 배경의 트래핑 adduct의 분리 삼인승는 한 번 더 (그림 2) 통합되었습니다.
3. 대표 결과
담배 생산 연기 (기상)를 굽기에있는 자유 래디 칼의 대부분은 즉시하고 불안정하고 있습니다. 이러한 래디 칼을 관찰하기 위해 스핀 트랩 기술을 채용합니다. 그것은보다 안정되고 ESR (Fig.1)에 의해 감지 수있는 스핀 adduct로 그들을 변환하여 가스 상 자유 래디 칼을 캡처합니다. 0.05의 현재 연구에서 스핀 - 트랩 솔루션M PBN 15을 구분하기가 어렵습니다 산소와 탄소 중심의 래디 칼의 혼합 아르 자유 래디 칼, 위상 연기 가스를 수집하기 위해 사용되었다. 우리의 경우에는, 그러나, 관찰 초미세 분리 상수 N = 13.7G와 H = 1.95G들이 주요 제품에 것을 제안, alkoxyl 자유 래디 칼 (RO.) 2 부가물를 트래핑에 해당하는 값이 매우 유사합니다. 우리는 연기의 흐름에 습기로 인해 있다고 약한 ESR 신호 (그림 2) 초기 측정에서 관찰 낮은 재현성을 보여주었다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 캠브리지 필터와 스핀 트랩 솔루션 사이에 액체 질소 (LN2) 트랩을 추가했습니다. 에선이 함정 급속 냉동하여 MCS 흐름에서 물을 제거하고 유리관의 내벽에 캡처. 이것은 크게 ESR 신호를 개선하고 높은 재현성 결과를 (그림 3) 허용.
함정 자유 래디 칼의 금액을 사용하여 결정되었다참고 샘플. 컨트롤 샘플 산화 억제제없이, 템포 알려진 농도의 이중 적분 스펙트럼과의 이중 적분 스펙트럼의 비교에 의해 예상 벤젠의 전형적인 adduct 농도는 1.24 μm의 (Fig.2)되었습니다. 공기의 양이 흡연하는 동안 각각의 담배 통과 이후 ~ 350 ML, 이것은 ~ 7.1X10 -9 M의 MCS의 가스 단계에서 자유 라디칼 농도에 대한 견적을 제공하고, 래디 칼의 총 숫자는 가스 단계에서 덫에 걸렸다 ~ 1.5X10 15 전체 담배. 가스 및 미립자 단계 모두 포함한 전체 담배의 연기에 자유 래디 칼의 총 금액에 대한 견적은 16 ~ 10 자유 래디 칼 9했습니다.
메인 스트림 담배 연기의 가스 단계 자유 래디 칼에 식물 산화 억제제의 청소 효과의 다른 수준이 관찰되었다. 그들의 청소 요금은 그림에서 소개되었습니다. 4. Lycopene과 포도 씨앗 추출물은 가장 높은 속도를 보여주 낮은 반면어 속도는 pycnogenol (Fig.4)에 대한 관찰되었다.
그림 1. 스핀 트랩을 사용하여 주류 담배 연기 (MCS)에서 가스 위상 자유 래디 칼을 수집에 대한 개선 흡연 시뮬레이션 설계의 도표. MCS는 다음 CA 필터, 캠브리지 필터 (노란색 필터)를 통해 물 흡인기에 의해 그려진 및 H 2 O.을 제거하는 액체 질소 트랩 통과되었다 가스 상 제품은 마침내 함정을 스핀에 가서 스핀 트랩 솔루션을 통해 부풀어 오른 모양이었다. 식물 항산화는 MCS의 자유 래디 칼을 청소하기 위해 담배에 부착 (동그라미로 확대) 종래의 아세테이트 필터의 두 가지 사이에 위치했다.
그림 2. 벤젠의 스핀 - 트래핑의 adduct 농도에 대한 양적 평가는 첫 번째 integra에서 광범위한 배경 신호를 빼서 필요내 스펙트럼. 스핀 - 트래핑의 adduct에 대한 초미세 분리 매개 변수 H = 1.95 G, N = 13.7G입니다.
그림 3. LN2 트랩을 통해 전달이 상당히 MCS의 스핀 - 트래핑 얻은 ESR 신호의 품질을 향상시킵니다.
그림 4. MCS의 자유 래디 칼의 농도에 자연 산화 억제제의 효과. 상대 신호 농도는 다음과 같습니다 제어 - pycnogenol 100 % - 55 %, 포도 종자 추출물 - 12 %, lycopene - 10 %.
Discussion
담배 연기에있는 다른 자유 라디칼 청소부의 효과의 신뢰성 추정은 자유 래디 칼의 양적 검출을위한 기술을 재현할 수 있어야합니다. 이전 1, 그것은 비 극성 용매에서 높은 농도 스핀 트랩 솔루션의 작은 볼륨이 담배 연기에서 자유 래디 칼을 트래핑에 가장 효과적인 것으로 나타났습니다. 담배 연기는 항상 유기 화합물의 연소 및 트래핑 용매에 끝날 수있는 담배의 잔류 수분에서 수증기가 포함되어 있습니다. PBN의 스핀 트랩 용액에 물이 혼합물은 크게 스핀 트래핑 부가물의 수명과 ESR 신호의 강도를 감소시킵니다. 가스 상 래디 칼의 일부 분율도 얼어붙은 표면에 갇혀있을 경우에도 액체 질소로 냉각 U 자형 튜브를 통하여 간단하게 통과 MCS하여 수분을 제거하면 크게, 우리의 실험에서 ESR 스펙트럼의 품질을 개선.
t를 사용그의 기술은 우리가 담배 필터에 도입된 천연 화합물을 다른 급진 - 소기의 상대적 효율성을 비교. 우리는 lycopene과 포도 씨앗 담배 필터로 통합 후 기상 MSC에서 자유 래디 칼의 90 %까지 청소하실 수 있습니다 즉시 추출 것으로 나타났습니다. 이러한 높은 청소 능력은 헤모글로빈과 shikonine 8,14 같은 가장 효율적인보고 자유 라디칼 프로텍터 중에서이 저렴한 즉시 사용 가능한 천연 화합물을 차지한다. 그러나, 공부 천연 산화 억제제와 함께 로드된 실험의 담배 필터에 실온에서 스토리지 일주일 후 그들의 소기 용량의 눈에 띄는 부분을 잃었습니다. 이 문제를 해결하는 것은 lycopene과 상업 담배 필터의 포도 종자 추출물 미래의 애플 리케이션을 자극 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국립 연구소 부여 번호 NIH / NCRR P41 - RR 016,292 (ACERT에 대한)에 의해 지원되었다.
References
- Baum, S. L., Anderson, I. G. M., Baker, R. R., Murphy, D. M., Rowlands, C. C. Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure. Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).
- Bluhm, A. L., Weinstein, J., Sousa, J. A. Free radicals in tobacco smoke. Nature. 229, 500-500 (1971).
- Church, D. F., Pryor, W. A. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).
- Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J. C. Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents. Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).
- Hecht, S. S. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).
- Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., Akimoto, H. Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer. Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).
- Nair, A. K., Brandt, E. N. Effects of smoking on health care costs. Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).
- Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., Niwano, Y. Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment. Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).
- Pryor, W. A. Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis. Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).
- Pryor, W. A. Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity. Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).
- Rozzi, N. I., Singh, R. K., Vierling, R. A., Watkins, B. A. Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts. J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).
- Shopland, D. R. Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking. Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).
- Shrikhandle, A. J. Wine products with health benefits. Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).
- Valavanidis, A., Haralambous, E. A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'. Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K. Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).
