To typer analyser for Oppdage Frog Sperm Chemoattraction

Summary

Egg og den ekstracellulære belegg rundt egg ofte utgivelsen peptider, proteiner og små molekyler som kommuniserer med sperm for å veilede dem til egget og dermed fremme befruktning. Bruk frosk sperm vi beskrive og sammenligne to klasser av analyser brukes til å oppdage sperm chemoattraction - sperm akkumulering analyser og sperm sporing analyser.

Abstract

Sperm chemoattraction i virvelløse dyr kan være tilstrekkelig robust at man kan plassere en pipette inneholder attraktive peptid i en sperm suspensjon og mikroskopisk visualisere sperm opphopning rundt pipetten ^1. Sperm chemoattraction i virveldyr som frosker, gnagere og mennesker er vanskeligere å oppdage og krever kvantitative analyser. Slike analyser er av to hovedtyper - analyser som quantitate sperm bevegelsen til en kilde av chemoattractant, såkalte sperm akkumulering analyser, og analyser som faktisk spore svømming baner av individuelle sperm.

Sperm opphopning analysene er relativt rask slik at flere titalls eller hundrevis av analyser som skal gjøres på en enkelt dag, og dermed lar dose respons kurver og tid kurs som skal gjennomføres relativt raskt. Disse typer analyser har vært mye brukt for å karakterisere mange godt etablerte chemoattraction systemer - for eksempel nøytrofile chemotaxis til bacterial peptider og sperm chemotaxis til follikulær væske. Sperm tracking-analyser kan være mer arbeidsintensiv men tilby ytterligere data om hvordan chemoattractancts faktisk endrer svømming stier som sperm ta. Denne typen analyse er nødvendig for å demonstrere orientering sperm bevegelse i forhold til chemoattrractant gradient aksen og å visualisere karakteristiske svinger eller endringer i orientering som bringer sæden nærmere egget.

Her beskriver vi metodene som brukes for hver av disse to typer analyser. Sperm akkumulering analysen benyttet kalles en "to-kammer" analysen. Amfibier sperm er plassert i en vev kultur plate inn med et polykarbonat filter etasje har 12 mikrometer diameter porene. Innstikk med sperm blir plassert inn i vev kultur plate brønner som inneholder buffer og en chemoatttractant forsiktig pipetteres til bunnen godt der gulvet møter veggen (se fig. 1). Etter inkubasjon er toppen sett inneholder sperm reservoar nøye removed, og sperm i bunnen kammeret som har gått gjennom membranen fjernes, pellets og deretter telles ved hemocytometer eller strømningscytometer.

Sperm sporing assay bruker en Zigmond kammer opprinnelig utviklet for å observere nøytrofile chemotaxis og modifisert for observasjon av sperm fra Giojalas og kolleger ^2,3. Kammeret består av et tykt glass gli inn som to vertikale trau har vært maskinert. Disse er adskilt av en 1 mm bred observasjon plattform. Etter påføring av en cover glass, sperm er lastet inn i et trau, visualiserte chemoattractant agenten til den andre og bevegelse av individuelle sperm av video mikroskopi. Video opptakene blir deretter analysert ved hjelp av programvare for å identifisere to-dimensjonale celle bevegelser i xy planet som en funksjon av tid (xyt datasett) som danner banen hver sperm.

Protocol

1. Materialer og buffere brukes

1. Oocytten Ringer Buffer (1,5 x OR2) inneholder 124 mM NaCl, 3,75 mM KCl, 1.5 mM CaCl _2, 1,5 mM MgCl _2, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM Hepes, pH 7.8. Befruktning Buffer (F-1) inneholder 41.25 mM NaCl, 1,25 mM KCl, 0,25 mM CaCl _2, 0,06 mM MgCl _2, 0,5 mM Na ₂ HPO _4, 2.5 mM Hepes, pH 7,8.
2. Xenopus laevis egg vann er utarbeidet etter Sugiyama et al. ^4. Kort beskrevet, er friskt gytt jellied frosken egg swirled i et lite volum på F-en buffer i 30 minutter og den betingede medium fjernet av mikropipette. Dette mediet, kalt "egg vann", kan også brukes til å forberede renset allurin, den primære chemoattractant i denne gelé ekstrakt. Sperm er hentet fra kommersielt avlet Xenopus laevis eller Xenopus tropicalis.
3. Se Table of Materials for spesifikke elementer som trengs i than analysen.

2. En to-kammer analysen for frosk sperm chemotaxis

1. Anesthetize frosken ved nedsenking i vann som inneholder 0,07% benzocaine, halshogge bruke et par karborundum edged saks, og dobbelt marg for å sikre aktiv dødshjelp. Skjær vekk abdominal hud å avsløre muskel. Lag midtlinjen og laterale kutt i abdominal muskler og trekke. Forsiktig trekke tarmen og fett for å avsløre hvite, bønneformede testiklene. Trim vekk bindevev med en fin saks være forsiktig for å unngå blodkar. Fjerne en testikkel, vaske bort blod med 1,5 x OR2 buffer, deretter ruller testis på filteret papir for å fjerne overflødig buffer og små tilhenger blodårer, og plasser deretter testis i en plastikk Pitre rett i 0,2 ml av 1,5 x OR2 buffer. Fyll en 5 ml sprøyte med 2 ml 1,5 x OR2 buffer, forsiktig dytte 10-20 hull i testis over det meste av overflaten på den ene enden, stikk nålen i motsatt ende og forsiktig injisere buffer for å skylle ut sæd. Alternativt kan enkan injisere buffer mens poking avkjøringen hull for å skylle ut sæd. Overfør sperm suspensjonen med en mikropipette med en cut-off tip (unngå klipping av sædcellene) til en mikrosentrifuge rør og legg på is.
2. Anslå antall frosken sperm oppnås ved å fortynne sperm 1:100 i 1,5 x OR-2 og ta en 20 mL prøve av blandet sæd suspensjon og telle antall celler ved hjelp av en hemocytometer og den store 1 mm ² område. Bruke hemocytometer telle og prøvetaking ratio beregne sperm tetthet og det totale antall sædceller høstes. Dette total er vanligvis 2 - 6 x 10 ⁷ sperm i et volum på ca 2 ml når begge testiklene blir brukt. Fortynn aksjen sperm suspensjonen med 1,5 x OR2 buffer for å få en sperm tetthet på 2 x 10 ⁷ / ml. Bruk sperm for analysen innen 2 til 3 timer forberedelse. Vurdere sperm motilitet ved å fortynne 5 mL av sæd 1:10 med F-1 buffer og visualisere bevegelser bruker fasekontrast optikk. Minst 40% til 50% av spermbør motile. Selv egnet forberedelsene vil inneholde et stort antall immotile sperm der de fleste er umodne.
3. Klargjør en ny 24-vel plast vev kultur plate av micropipetting 700 mL av F1 buffer i hver brønn. Hver brønn bør være ca 15 mm i diameter nederst.
4. Start en serie analyser ved å fortynne 100 mL av sæd fjæring med 900 mL av F1 buffer ved romtemperatur (ca 21 til 23 ° C) i et mikrosentrifuge tube for å aktivere sperm motilitet av osmotisk sjokk. Hver gang ferskt sperm er aktivert på denne måten, må sædcellene brukes innen 1-2 minutter.
5. Plasser en 12 mikrometer porøsitet sette (12 mm OD) i en buffer-fylt godt, sørg for innsatsen emisjonen er off-senter forlate en plass til en side. Umiddelbart overføre 400 mL av motilitet aktivert sperm inn i brønnen med en mikropipette ha en cut-off spissen. Påfør sperm suspensjonen til veggen av filter inn og la den kjøre ned på filteret nederst the sett, den sperm suspensjonen bør ikke pipetteres direkte på filteret.
6. Nøye mikropipette 50 mL av chemoattractant agenten i brønnen i mellomrommet mellom brønnen og off-senteret filter sett. Man må være forsiktig med å deponere droppe der siden og bunnen av brønnen møtes og trekke pipetten med ingen forstyrrelser i systemet. Spesifikt bør stempelet på mikropipette bli presset bare til første stopp, slik som å fullstendig løse prøven men ingen luftbobler.
7. Gjenta trinn 2.5 og 2.6 ovenfor for å starte så mange analyser etter behov, så Inkuber platen før den første analysen startet har inkubert 50 minutter. Vanligvis kan man starte en analyse hvert 45. til 60 sekunder. Merk at analysen kan være strømlinjeformet av en erfaren person eller av to personer som arbeider sammen. I dette tilfellet kan en eller to rekker av analyser initieres med et større lager av aktive sædceller og raskere pipettere forutsatt at sperm alltid brukes innen 1 til 2 minutteraktivering.
8. Stopp hver analyse i sekvensen startet. Først forsiktig jevn filteret inn med en hånd og med den andre forsiktig fjerne de fleste eller alle av sperm suspensjon i det øvre kammeret ved mikropipette eller sug med et Pasteur pipette. Umiddelbart, ved hjelp av en fin pinsett, trekk ut filteret inn og kast. Care må brukes på dette trinnet, minst de resterende sæden bli feid gjennom filteret artifactually øke verdiene for sperm passasje.
9. Fra hver plate godt, overføre hele sperm suspensjonen til en mikrosentrifuge tube. Det er viktig å blande sæd suspensjon i brønnen før uttak da sperm tendens til å bosette seg til bunnen. Tilsett 15 mL 25% formaldehyd til en endelig konsentrasjon på 0,5% v / v og avkjøl hvis sperm teller ikke er gjort samme dag.
10. Pellet sperm i hvert rør med en 10 sekunders trykknapp spinne på et personlig mikrosentrifuge ha en maksimal hastighet på 2000 x g. Fjern alle men 100 mL av supernatmaur fra hver tube, så resuspender pelleten i det volumet. Ta 20 mL av sæd suspensjon, fortynnes 1:10 med destillert vann, og telle sperm på et hemocytometer med en 40x objektiv på en oppreist mikroskop. Bruk teller og fortynning faktorer for å beregne det totale antallet sædceller som passerte gjennom filteret i hver analyse.

3. Frog sperm sporing analysen ved hjelp av en Zigmond kammer

1. Klargjør invertert mikroskop arbeidsstasjon for videoopptak. Vi bruker et Nikon Elipse TE300 invertert mikroskop utstyrt med enten en Sony DXC-390 3-chip farge analogt videokamera eller et Hamamatsu ORCA-03G monokrom digitalkamera. Den Zigmond kammeret skyve må hvile på scenen up-side-ned med en tilstrekkelig åpning i scenen plate å huse en 22x40 mm cover glass. Denne ordningen er nødvendiggjort av at frosken sperm ikke klarer å svømme mot tyngdekraften. Focus enten en 4x eller 10x objektiv på observasjon plattformen kjører mellom de totrau.
2. Test for å sørge for at kameraet er fokusert og sentrert på observasjon plattformen. Hvis Sony kamera er brukt, er det utgang sendes til en videomonitor og til en A / D-konverter (ramme grabben) i stand til å digitalisere 7 bilder per sekund fra videosignalet. Den digitale strømmen blir behandlet ved hjelp av en datamaskin som kjører på 3 GHz eller større helst med 4 Gb RAM eller mer. Selv om vi bruker Scion Bilde programvare (en tilpasset Windows-versjonen av NIH Image) styrer en Scion CG-7 ramme grabben, disse produktene er ikke lenger tilgjengelig. En aktuell løsning er å bruke Image J programvare med en VirtualDub Plug-in for analogt videokamera fanger. Hvis Hamamatsu kamera er brukt, er dens digital utgang behandlet av Olympus cellSens programvare og vises på dataskjermen. I begge tilfeller er dataene lagret på enten en intern eller ekstern harddisk som et 8-bit tiff stack. Bruk av Scion Bilde programvaren krever konvertering av Tiff bildesekvensen til en stabel ved hjelp av Image J.
3. Klargjør chemoattractant ved en passende konsentrasjon i F1 buffer. Forbered Xenopus laevis sperm som beskrevet tidligere og lagre i 1,5 x OR2 buffer på is inntil de skal brukes.
4. Monter Zigmond kammeret. Start med et tørt kammer. Bruke en mikropipette plassere en linje av silikonolje (4 mL) ca 5 mm fra og parallelt med den ytre kanten av hvert gjennom. Plasser en 22x40 mm cover glass inn i kammeret slik at silikon oljen jevnt spre seg til ytterkanten av hvert gjennom. Dersom foreløpige forsøk viser at sperm stikker er et problem, kan man behov for å belegge dekke glasset med nitrocellulose som foreslått av Fabro et al. ^3. Alternatively kan inkludere protein i buffere som brukes (f.eks 1% BSA) også redusere sperm stikker.
5. Vend i kammeret og plasser over sirkulære cutout i mikroskopet scenen være forsiktig at dekselet glass gjør ikke kontakt med scenen. Denne omvendte konfigurasjonen er nødvendig for å bringe Xenopus sperm fra bunnen på plattformen. I motsetning til pattedyr sperm, Xenopus sperm ikke er sterke nok til å svømme mot tyngdekraften for å nå plattformen.
6. Aktiver 20 mL av Xenopus sperm i 1,5 x OR2 buffer ved å blande 1:10 med F1 buffer ved romtemperatur. Bruke en mikropipette med et kutt spissen, umiddelbart overføre 70 mL av motilitet-aktivert sperm i vannkaret. Dette oppnås ved å holde mikropipette til en lav vinkel og plassere tuppen på siden åpningen av bunnen. Den cellesuspensjon utløst fyller bunnen og bro ved kapillærkraft. Neste, fyll det motsatte gjennom på samme måte ved hjelp av en chemoatttractant løsning.
7. Begynn videoopptak innen 3 minutter (Xenopus sperm har en begrenset motilitet levetid) og fortsetter i 5 minutter. På slutten av videoopptak, demontere kammeret og vaske trau og observasjon plattform med en trykksatt strøm av vann og etanol fra en skvett flaske. Ta silikon olje fra øvre flatene med papirhåndklær være forsiktig for ikke å forurense observasjon plattformen og trau.
8. Ved behov, konvertere video data fanget til en TIFF-bilde sekvens eller stable ved hjelp av Image J programvare. Deretter åpner du filen i Image J og i de første 21 frames (3 sekunder) velge inntil 50 sperm for å bli sporet. For å unngå bias, valgte sperm fra alle regioner i observasjon feltet og uten kunnskap om deres bane data. Capture to-dimensjonale celle baner i xy planet som en funksjon av tid (xyt datasett) for hvert sperm ved å peke og klikke med musen bruker MtrackJ plug-in-modul for bilde J. Visualiser baner og beregne banenavstander, akse komponenter og hastigheter innen MtrackJ. Alternativt kan utføre disse operasjonene og videre numerisk analyse (f.eks retningen, chemotaxis parametere og parameter histogrammer) ved å importere xyt datasett inn i Microsoft Excel.
9. Plot baner for hver sperm i Excel for å oppdage generelle bevegelsesmønstre inkludert lineære, krumlinjet, og sirkulære mønstre så vel som funksjoner som svinger. Utnytte xyt datasett for å beregne gjennomsnittlig krumlinjet hastighet, netto reise langs X (gradient) - og Y-aksen, og orientering parametere som gjennomsnittlig vinkel på reise i forhold til gradient aksen.

Fire. Representant Resultater:

Viktige tekniske parametere i de to kammer analysen er størrelsen og formen på kammeret, porøsitet av membranen, og lengden på inkubering. Størrelsen på det øvre kammeret som holder sperm bør ikke være så store i diameter som å kreve et stort volum av sperm (preferably 0,5 ml eller mindre) eller bør det øvre kammeret være så dypt som å skape en høy kolonne av cellesuspensjon (<1 cm). Volumet av nedre kammeret buffer rundt det øvre kammeret sett bør nøyaktig matche nivået på cellesuspensjonen i innsatsen for ikke å skape en transmembrane hydrostatiske trykket som ville artifactually tvinge spermiene gjennom membranen. Plassering av tomt sette inn i bunnen godt først, etterfulgt av sperm lasting resulterer i en innledende oppover hydrostatiske trykket som hindrer sædcellene fra å gå gjennom membranen under lasting. Valg av membran pore størrelse bestemmes av størrelsen på sperm, og den kommersielle tilgjengeligheten av porøs membran inserts. Vi finner at analyser med frosken sperm kan benytte enten 8 eller 12 mikrometer diameter porene selv 12 mikrometer pore sørge for passering av høyere antall spermier slik at mer nøyaktig telling. Pore ​​størrelser større enn 12 mikrometer synes ikke å være kommersielt tilgjengelig. Et alternativ til å bruke tissue kultur inserts er bruken av Neuroprobe membraner konstruert for chemotaxis analyser i 96-brønn plater. Disse tilbyr en potensielt større gjennomstrømning og et bredere spekter av pore diameter. Selv om større pattedyr sperm synes å kreve en større pore diameter, har vi lykkes analysert mus sperm chemotaxis bruker innstikk med 12 mikrometer porer (Burnett, upubliserte observasjoner). I kontrast, kan mindre porestørrelser være tilstrekkelig for mindre sperm (f.eks kråkebolle) selv om vi ennå ikke har testet denne muligheten.

En ulempe av de to-kammer analysen beskrives er at sperm er plassert i den øverste kammeret dermed uunngåelig resulterer i noen sperm passasje av tyngdekraften, og dermed redusere signal til bakgrunnen ratio. Dette er nødvendiggjort av at Xenopus sperm ikke er kraftig nok i motilitet sine å svømme mot tyngdekraften som er pattedyr sperm. En annen vanskelighet i analysere Xenopus sperm er det faktum at deres motilitet life tiden er kort - 5 til 15 minutter etter aktivering. Denne begrensningen er grunnlaget for å måtte aktivere en ny gruppe med sperm hver 2 til 3 minutter ved gjennomføring av flere analyser. Som et resultat har tid selvsagt studier vist at de fleste sædceller passasjen skjer innen de første 20 minuttene av analysen ^5. Selv om vi bruker en 50 minutters inkubasjonstid, kan denne perioden trolig være kortsluttet til 20 eller 30 minutter. I motsetning til mus sperm som fortsatt motile i timevis, har vi brukt opp til en 2 timers periode av analysen med gode resultater (Burnett, upubliserte observasjoner).

I de to-kammer analysen bruker frosk sæd, er det totale antallet sædceller som passerer gjennom den porøse membranen typisk 10-20000 eller ca 1 til 2% av sædcellene plassert i det øvre kammeret innsatsen. Tilstedeværelse av en chemoattractant gradient i nedre kammer kan øke sperm passasje like mye som 4 til 10 ganger. Figur 2 illustrerer en typisk dose respons kurve utført med denne analysen. En olje-og gassutvhandling av Xenopus egg gelé ("egg vann") som inneholder de kjente chemoattractant protein allurin (røde sirkler), ble plassert i den nederste kammer ved en rekke fortynninger. Den totale eggevannet protein som finnes i hver analyse er gitt i mikrogram / analysen - beløpet levert i den opprinnelige 50 mL volum. Siden protein levert vil danne en diffusjon gradient, er den faktiske konsentrasjonen spekter av protein som sperm reagerer ikke kjent, men kan anslås til å være 5 til 10 ganger lavere enn protein konsentrasjonen av dråpen levert. Av denne grunn betegne vi mengden av protein innført, ikke konsentrasjonen. Vanligvis er vi utfører duplikat eller tredoble analyser for hver dose og gjennomsnittlig resultat, vi så gjenskape hele eksperimentet 3 eller 4 ganger med sperm fra ulike menn i hvert forsøk. Middelverdien og standard feil av gjennomsnittet er beregnet for hver dose med standardfeilen for gjennomsnittet er typisk 5 til 10% av gjennomsnittet. Merk at proteiner uten known chemoattractant aktivitet som bovint serum albumin (åpne sirkler, fig. 2) kan gi et lavt nivå, ikke-spesifikk økning i sperm passasje gjennom membranen. En interessant observasjon er at dose respons kurve for egg vann er multiphasic - en stigende fase og en avtagende fase. Denne typen multiphasic forhold er vanlig for sperm chemoattractants, responsen av menneskelige sædceller å follikulær væske viser en lignende bifasisk forhold ⁶ som antas være nyttige i at høye konsentrasjoner av chemoattractant funnet i nærheten av et egg kan tjene til å redusere ytterligere søker svar på den delen av sperm.

Noen ganger finner vi at kontroll verdier for denne analysen er høyere enn normalt, og dermed redusere dobling produsert av en chemoattractant. Vanligvis kan dette spores tilbake til mekanisk forstyrrelse av filter sett under analysen. Derfor er det viktig at innstikk ikke blir forstyrret under innlasting av sperm eller chemoattractant under analysen inkubering eller når innsatsen er fjernet. Spesielt viktig er at sædcellene reservoaret i innsatsen er fjernet av mikropipette eller suge før løfting innsatsen ut av brønnen. Dette sikrer at sædcellene ikke feide gjennom den porøse membranen i bunnen kammer som innsatsen er fjernet.

Viktige tekniske parametre i Zigmond kammeret analysen inkluderer avstanden mellom coverglass og observasjon plattform, forstørrelse av videoen observasjon, type optikk brukt, og bildefrekvens. Avstand mellom observasjon plattformen er typisk 10-15 mikrometer men denne avstanden kan varieres med mengden av silikon olje brukt til grensesnittet mellom dekke glass og kammeret skyv - jo mer olje, jo større avstanden. En tynn planet av væske øker mengden av tid som trengs for en gradient å danne samt lang av gradient gang dannet. En tykkere flyet av væske gir en raskere gradient dannelsen men gradient har en kortere levetid og mindre stabilitet. Dynamikken i gradient dannelse kan visualiseres ved hjelp av et fluorescerende fargestoff eller et fluorescerende dekstran i chemoattractant godt og bruke fluorescens mikroskopi for å se dynamikken. Testen reagens bør matches i molekylvekt til chemoattractant som brukes og dynamikken bestemt brukt til å bedømme hvor mange minutter bør være tillatt for gradient dannelse og opptak av sperm bevegelser.

Forstørrelse som brukes bør være lav samlet (4x eller 10x objektiv) hvis hele observasjon plattformen er å bli visualisert som i analysen forholdene vi har beskrevet. På den annen side kan høyere forstørrelse (40x eller 63x objektiv) være nyttig hvis man har til hensikt å overvåke relativt kort bane segmenter eller ønsker å løse flagellar bevegelser. Sporing kan utføres enten ved semi-manuelle metoder som beskrevet i denne artikkelen eller ved automatisert sporing som praktiseres i flere SOPhisticated programvarepakker som MetaMorph eller Imaris Track. I begge tilfeller er lette å spore svært avhengig av kontrasten i bildet enten det er av operatøren eller av programvare-assistert objekt anerkjennelse. Selv lyse feltet optikk kan brukes i noen tilfeller, bruk av fasekontrast optikk eller mørkefelt optikk er vanligvis nødvendig. Til slutt, avhenger bildefrekvens på tidsoppløsning ønsket i sporing. Hvis semi-manuelle metoder brukes som i prosedyren vår, er en trolig begrenset til relativt lav bildefrekvens - 4 til 8 bilder per sekund - på grunn av den arbeidsintensive natur innspilling data. På den annen side kan video sats observasjoner være nødvendig for rask respons som flagellar bølge former. Ofte er eksperimentelle målene best tjent ved å gjøre langsommere bildefrekvens eksperimenter og raskere bildefrekvens eksperimenter separat ettersom man også ønsker å endre andre parametere som forstørrelse, optikk, eller digital bildebehandling.

Typiske resultater for ZigmOND kammer sporing analysen består av et sett med baner som de sett for femti frosk sperm i videoklippet av Movie 1. Mot et bilde av observasjon plattform, er det baner av individuelle spermier spores i rødt for en kontroll eksperimentet (ingen chemoattractant gradient tilstede). De to-dimensjonale celle baner i xy planet som en funksjon av tid for hver sperm kan plottes og logget ved MtrackJ og importert til Microsoft Excel. For banen analyse, utpeke vi chemoattractant gradient aksen som X-aksen og Y-aksen som den ortogonale aksen, i samsvar med konvensjonen opprinnelig utviklet av Fabro et al. ^3. Som vist i diagrammet i figur 3, er den faktiske banen tatt består av skritt, summen av hvis lengde tilsvarer krumlinjet distanse på bane (blå / gull piler). Netto avstand og orientering av reiser hver sperm er en vektor forbinder den første og siste punktet i banen (rød diagonal pil). Detnet reise kan deles inn i sin X-aksen komponent og Y-aksen komponent (rød stiplete piler, også kalt netto delta X og netto deltaet Y, henholdsvis).

Fordi chemotaxis i virveldyr sperm kan innebære relativt subtile forskyvninger i kjøreretningen, store mengder sperm (100 til 300), tilfeldig valgt, er vanligvis analyseres for hver tilstand som ofte krever samlet data 4-6 uavhengige eksperimenter. Ment som illustrasjon, men vi vil bruke data fra bare femti frosk sperm. Tabell 1 illustrerer vanlige parametre brukt til å påvise endringer i sperm reise. Gjennomsnittlig netto reise langs X-aksen vil øke betraktelig hvis, i nærvær av en chemoattractant, følger sperm befolkningen som helhet baner som nærmere justeres med gradient. I vårt eksempel, økte gjennomsnittlig netto X-aksen reise over tre ganger i nærvær av egg vann. Man kan også plotte en histogram av netto X-aksen reise for sperm befolkningen som har fortrinn Tage at mindre subpopulasjoner av responsive sperm kan påvises. To parametre er utviklet av Fabro et al. ³ kan også bidra til å oppdage slike bestander. Både prosentandelen av sperm som viser positive netto X-aksen reise (% ΔX> 0) og andelen av sperm som viser netto lineær reise ikke større enn 45 grader fra gradienten aksen (% ΔX / | ΔY |> 1) kan øke dramatisk hvis hele sperm befolkningen er følsomme for chemoattractant eller mindre, men fortsatt betydelige mengder hvis subpopulasjoner av sæd er sensitive. Vårt eksempel i tabell 1 viser økninger i begge parametrene for femti frosk sperm utsatt for et egg vann gradient. Merk at tilfeldig non-orientert bevegelse vil gi ikke-null verdier for begge disse parametrene på 50% og 25% henholdsvis; kontroll verdier høyere enn dette (for eksempel i tabell 1) representerer en bakgrunn på grunn av enten et lavt prøve nummer eller til en skjevhet i sperm orientering særlig for den eksperimentelle design.

innhold "> Direksjonalitet av sædceller reise i respons til chemoattractant agenter kan bli direkte vurdert av theta, vinkelen mellom vektoren av netto reise for hver sperm og gradient (X)-aksen. Vårt eksempel i tabell 1 viser at gjennomsnittlig theta redusert for sædcellene å svømme i et egg vann gradient som tyder på at sperm baner som befolkningen var bedre linje med gradient. likhet med netto X-aksen reise (se ovenfor), kan thetas for sperm befolkningen uttrykkes som en fordeling, en tilnærming også sensitive til subpopulasjoner av responsive sperm og en som nylig ble studert av Gakamsky et al ^7.

Endelig kan krumlinjet og momentant hastigheter for individuelle sperm også være hentet fra data som beskriver to-dimensjonale celle baner i xy planet som en funksjon av tid. Man kan finne at det er en økning i hastighet, så vel som et skifte i retning av reiser, og dermed tyder på en chemokinetic respons samten kjemotaktisk respons.

Disse dataene representerer et utgangspunkt for analyse av sperm baner. Videre analyser kan omfatte målinger av banen linearitet og kurvatur på et øyeblikk til øyeblikk grunnlag som utføres av Bøhmer et al. ⁸ og Shiba et al. ^9, automatisert deteksjon av vendinger som utføres av Burnett et al. ^10, og linearitet som gauged av fraktal analyse ^11,12. Forutsatt at sædceller svømmer disse baner er overvåket ved høyere forstørrelse, kunne man også bilde flagellar bevegelser og sanntids kalsium signaler som utføres av flere laboratorier ^{8,9,13,14,15,16.} Slike studier har vist at både virvelløse og pattedyr sperm svare chemoattractants ved skarpe svinger av sperm opp gradient mot chemoattractant kilden. Disse svinger er ledsaget av flagellar bøyer som endrer sperm orientering mye som et ror ville, bend som ser ut til initiert av definerte, bølge like kalsium signaler forplanter gjennom flagellum. Dermed er det endelige målet med sperm sporing for å korrelere signalanlegget dynamikk med endringer i flagellar fremdriftssystemer som tjener som grunnlag for sperm orientering i en kjemotaktisk gradient. Disse målene har ennå ikke nådd i Xenopus sperm som reiser i en spiralformede bevegelse ^17, viser lav krumning i sine baner ^10, og hvis kalsium signaler er ennå ikke overvåkes.

Selv om vi har fokusert her på detaljering analysemetoder vi bruker for Xenopus laevis sperm, begge de to kammer sperm akkumulering analysen og Zigmond kammer sporing analysen kan brukes for pattedyr sperm dersom visse modifikasjoner er gjort. Begge analyser kan utføres ved 37 ° C hvis ønskelig, ved bruk av et lysbilde varmere, og i Zigmond kammer analysen, et mikroskop scene varmere. Vanligvis vil pattedyr sperm bli isolert, capacitated og ruges bruke egnede mammalske buffere end chemoattractants, men data analyse vil være lik det som er beskrevet her for amfibier. Ett ytterligere forskjell er at Zigmond kammeret er vanligvis plassert stående på scenen av en oppreist mikroskop siden pattedyr sperm, i motsetning Xenopus sperm kan svømme opp på observasjon plattform. Som likevel utestet, kan disse to analysene se søknad til sperm av en rekke arter i fremtidig arbeid.

Figur 1. Skjematisk diagram av de to-kammer analysen. Sperm er plassert i et innstikk bunnen av som er en polykarbonat filter med 12 mikrometer porer. En chemoattractant løsning er nøye pipetteres til brønnen for å initiere dannelsen av en konsentrasjonsgradient.

Figur 2. Representative data for frosk sperm med de to-kammer sperm chemotaxier analysen. Egg vann forberedt fra X. laevis egg viser en flerfase dose-aktivitet kurven som er karakteristisk for sperm chemoattractants. Bovine serum albumin øker sperm passage bare litt - en uspesifikk effekt av protein. Figur modifisert fra Al-Anzi & Chandler ^5.

Movie 1. Et videoklipp viser frosk sperm baner plottet i rødt på observasjon plattformen i en Zigmond kammer. Bredden på plattformen er 1 mm. Klikk her for å se videoklippet.

Figur 3. Axis konvensjoner, en sædcelle krumlinjet bane og en vektor for netto lineære reise er plottet på Zigmond kammeret observasjon plattform. Data er av tre typer. Først kan sperm baner selv (blå / gull piler) avslører bestemte mønstre sulm som sirkler og svinger (stjerne). Krumlinjet avstand og krumlinjet hastigheter kan måles for banen banen. Second, netto luftlinje reiste over hele banen, netto X (gradient) aksen komponent av reiser, kan netto Y-aksen komponent av reiser og vinkelen theta mellom X-aksen og vektoren av netto reise beregnes for hver bane og sammenlignes som en fordeling over all sperm spores. Tredje, øyeblikkelig endringer i hastighet og kjøreretning for segmenter innenfor de enkelte baner kan studeres enten individuelt eller som en populasjon. Ovenfor, er en side-visning av kammeret presentert i et diagram.

Tabell 1. Parametere brukes ofte i å analysere data fra Zigmond kammeret.

Discussion

Chemotaxis av celler flytte enten amoeboid bevegelse eller flageller-drevet svømming finnes i mange biologiske sammenhenger og studier av dette fenomenet krever tilgjengelighet av praktiske og pålitelige analyser. Noen eksempler på fenomenet, som tiltrekning av sæd til en kråkebolle egg eller samling av slim mugg celler til å danne en fruiting kropp, har umiddelbar visuell effekt. Kvantifisering av dette fenomenet har vært foretatt i en rekke måter som beskrevet av Eisenbach ^{18 år.} Disse analyser inkluderer bruk av chemoattractant fylt kapillærer å tiltrekke sperm, bruk av kapillærer bli reservoarene for å lage en gradient og bruk av et Makler kammer ha brønner for sædceller og chemoattractant. Dette notatet beskriver to "andre generasjon"-analyser som nå brukes oftere. Selv om disse analysene fortsatt stole på behovet for å lage en gradient de innlemme flere nye funksjoner. Først har de to kammer analysen den fordelen at mange membran porene SAMPle sperm passasje over gradient heller enn en kapillær åpning slik at mer sperm å teste gradient i en enkelt analyse.

Patterns of rettet celle bevegelse er en viktig funksjon i chemotaxis og det er naturlig at nye formater for sporing av celler som har blitt utviklet. Et nytt format, er den tre-dimensjonale skanning av sæd baner som de nærmer seg et egg. Ved hjelp av en bevegelig flyet av infrarødt lys for å oppdage sperm posisjoner, har Zimmer og kolleger gitt sperm bane data i et kammer med egg sentrert - en enhet som bruker den naturlige chemoattractant kilden og har relativt fjerne vegger som ellers kan forstyrre naturlig sperm bevegelse ^19. Alternativt Corkidi et al. utviklet et system som kombinerer raske bevegelser på en lang arbeidsavstand objektiv med høy bildefrekvens å fange tre-dimensjonale baner ^20. Analyse av sperm bevegelser i slike enheter har nylig blitt lettere ved bruk av polar samordningTES ²¹ og Guerrero et al. har nylig understreket behovet for tredimensjonale observasjoner av sperm chemotaxis i fremtidige studier ^13.

I kontrast, er bruk av kartesiske koordinater tilrettelagt av Zigmond kammer, en enhet som ble utviklet av Sally Zigmond for studier av nøytrofile orientering og chemotaxis og første gang vist å være nyttig i studiet av sperm chemotaxis ved Giojalas og kolleger ^2,3. Bruk av en lineær trau chemoattractant heller enn et punkt kilde til chemoattractant tillater en kjemisk gradient settes opp i en XY koordinatsystem snarere enn en radial koordinatsystem. Giojalas har søkt denne analysen til studiet av chemotaxis i sperm av mennesker, mus, kaniner og styrer og bekreftet det faktum at væske fra eggstokkfollikler inneholder en chemoattractant ^2,3,22. Mer nylig har Giojalas og Eisenbach viste at progesteron som avgis av cumulus celler som omgir egget ogsåfungerer som en sperm chemoattractant ^23-26. Har faktisk progesteron nylig vist seg å utløse åpningen av Catsper kanaler i sperm for å starte kalsium signalene tenkt å modifisere sperm flagellar bøying og dermed retning av sperm svømming ^27,28.

Den Zigmond kammeret har både fordeler og ulemper. En fordel er optisk enkelhet i at sæd er opprettholdt i et sett fokalplan og ingen skanning av Z dimensjon er nødvendig. En annen fordel er bruk av kartesiske koordinater som er mer kjent for de fleste etterforskere og oppmuntre til testing av nye parametre utformet med relativt vanlig matematikk. På den annen side skaper Zigmond kammer en situasjon ulikt det som finnes i naturen. Sperm er laget for å svømme mellom to vegger på nært hold som sannsynligvis påvirker deres repertoar av flagellar wave former samt utfallet av resulterende krefter. Likeledes er chemoattractant brukes vanligvis kjemiskog spredt annerledes enn det som ville oppstå fra et egg. Endelig er sperm stikker til vegger et potensielt problem som ikke ville være til stede i en tre-dimensjonal kammer.

Mens noen etterforskere tyder på at sperm sporing er den eneste pålitelige måten å studere sperm chemotaxis, kan disse analysene være arbeidsintensiv både på eksperimentelle og dataanalyse faser hvis semi-manuell fremfor automatiserte metoder benyttes. Av denne grunn, beskrev analyser som de to-kammer analysen her har blitt brukt til å gi kvantitative og reproduserbare data som kan gi bevis for chemotaxis. Denne typen analysen oppsto med Boyden kammer, der en nøytrofile suspensjon ble satt i kontakt med overflaten av en porøs filter barriere ^29. En chemoattractant Løsningen ble satt i kontakt med motsatt side av filter slik at en kjemisk gradient for å danne innenfor filteret selv. Celler inn i filteret matrisen kan enten være farget og telles microscopically eller, hvis merket radioaktivt, telles i en scintillation teller. Denne tilnærmingen ble videreutviklet ved bruk av store porer polykarbonat filtre gjennom som chemotaxing cellene faktisk kunne passere som i de to kammer analysen beskrives her ^5.

Tidligere har vi validert to-kammer analysen som et mål på frosk sperm chemotaxis. Først bruker egg vann som tiltrekkende, har vi vist at stimulering av sperm passasje gjennom filteret krever at en konsentrasjonsgradient være skapt av deponering av en eneste dråpe chemoattractant i bunnen kammeret. Hvis chemoattractant er spredt over hele den nederste kammeret buffer ved å blande, er sædcellene bevegelsen ikke stimulert ^5. Second, opprettelse av en "omvendt gradient" med tillegg av chemoattractant til toppen kammer stimulerer ikke passasje av sædceller. Til slutt finner vi at i sperm spore eksperimenter i Zigmond kammer, sperm motilitet og hastighet erikke redusert eller endret uansett retning av sperm reise i forhold til gradient (Burnett, upubliserte observasjoner). Denne siste observasjonen er viktig fordi det har blitt påpekt at hemmere av sperm motilitet kan faktisk forsinke eller stoppe sædceller nær kjemiske kilden dermed presentere en artifactual opphopning av sædceller som kan forveksles som chemotaxis ^{18 år.}

Til tross for disse begrensninger, har sperm akkumulering analyser slik de to-kammer analysen viste seg å være svært nyttig arbeidsbesparende verktøy som har vært medvirkende i å karakterisere nøytrofile chemotaxis til bakteriell peptider ^29,30, i den første oppdagelsen av pattedyr sperm chemoattraction til follikulær væske og progesteron ^6,31,32, og i rensing og karakterisering av frosken sperm chemoattractant allurin ^4,5,33.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	BD Biosciences	35/1147
12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane	EMD Millipore	PIXP01250	We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued
Zigmond chamber	Neuroprobe	Z02
Silicone oil	GE Healthcare	SF1154	Equivalent to Dow Corning 550 Fluid
Image J software	Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health	Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
MtrackJ software	Biomedical Imaging Group	Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
Virtual Dub software	GNU General Public Licensed	Free download via http://www.virtualdub.org/index.html	Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only
cellSens software	Olympus Corporation	See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070	Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability