Summary
안달 기반 기자 점점 라이브 세포 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 여기 대상 인산화에서 세포주기 종속 변화를 평가하기 위해 안달 기반의 기자를 사용하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.
Abstract
포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 기반 기자 1 살아있는 세포의 내생 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동의 평가를 허용합니다. 이러한 프로브는 일반적으로 phosphorylatable 시퀀스와 phospho - 바인딩 도메인 방해 CFP 및 YFP의 변종의 구성됩니다. 인산화되면 변화로 이어지는 CFP와 YFP 사이의 거리 또는 방향의 변경 결과 프로브 변경 형태는 (그림 1) 효율성을 무서워. 몇몇 프로브는 PKA 2, PKB 3, PKC 4, PKD 5, ERK 6, JNK 7, CDK 18, 오로라 B 9 기자와 Plk1 구 등의 여러 kinases와 phosphatases의 활동 균형을, 모니터링, 지난 10 동안 공개되었습니다 . 모듈형 설계 감안할 때, 추가 프로브는 향후 10 등장할 가능성이있다.
세포주기를 통해 진행은 스트레스 signali에 의해 영향을받습니다NG 11 경로. 특히, 세포주기는 세포가 스트레스를 12 회복하는 경우에 비해 성장을 교란되지 않은 동안 다르게 규제입니다. 세포주기를 통해 세포의 시간 경과 이미징 따라서 특별한주의가 필요합니다. ratiometric 이미징을 채용 특히 잡음 비율 높은 신호를 두 개의 이미지가 정확하게 결과를 해석하는 데 필요한 때문에 이것은 문제가된다. Ratiometric는 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동에 세포주기에 의존 변경 이미징이 predominately 세포주기 8,9,13,14의 하위 섹션에 제한되었습니다 무서워.
여기, 우리는 인간의 세포주기에 걸쳐 ratiometric 이미징을 사용하여 걱정 기반 프로브를 모니터링하는 방법을 논의합니다. 방법은 생명 과학의 많은 연구자에게 제공하고 현미경이나 영상 처리의 전문 지식을 필요로하지 않는 장비에 의존합니다.
Protocol
1. 세포에 프로브를 소개합니다
- 안달 기반 프로브 및 플라스미드 부여 저항 공동 transfect 세포. 관심의 셀 타입에 효율적입니다 transfection 방법을 선택합니다. U2OS 전지, 표준 칼슘 인산염 transfection 방법은 적절한 결과 15 줄.
- 적어도 7 일 동안 적절한 항생제의 세포를 선택합니다. 프로브 및 제한 심각하게 세포주기에 영향을 미칠 독성 표현 수준이나 표현 수준과 세포의 크기를 표현하는 세포의이 풍요롭게의 금액입니다.
- (선택 사항) 안정적인 클론을 선택하십시오.
- 고정 또는 라이브 세포를 사용, CFP 및 YFP 모두 거의 같은 비율로 모든 세포에 존재하는지 확인합니다.
- 일부 세포는 CFP 또는 YFP를 포함하는 경우에는 재조합 가능성이 높습 발생했습니다. 재조합은 박테리아 성장하는 동안 또는 프로브의 transfection 후 중 발생할 수 있으며, 후자의 경우에는 플라스미드 품질에 따라 달라질 수 있습니다. 플라스미드 P를 반복배상하고 문제가 지속되면 transfection하기 전에 플라스미드를 linearize.
2. 모니터링 ratiometric이 무서워
- 챔버의 장착을위한 유리 바닥 요리, 또는 커버 전표에 씨앗 세포. 요리 / 커버 전표가 더 1.5 (170 μm의 두께)입니다 없는지 확인합니다.
- 37 ° C. 설정 온도 제어와 동력 epifluorescence 현미경에 페놀 붉은없이 성장 매체 전지를 탑재 중 CO 2 또는 2 독립 미디어 등 Liebowitz - 15 CO를 사용하여 미디어의 산도 조절을 보장합니다.
- 전송 조명을 사용하여 세포에 초점. 형광등을 사용하는 전지를 보지 마라.
- YFP 여기 (YFPex)와 YFP 방출 (YFPem) 필터 및 적절한 이색성 거울을 사용하여 12 또는 16 비트 이미지를 획득하여 시작합니다. 여전히 필요한 subcellular 해상도를 허용 가능한 최대한의 binning을 사용합니다. 노출 시간이나 강도를 감소 높은 binning을 사용하면 phototoxicity을 피하기 위해 중요합니다.
- 나를asure 또는 셀 찾아볼 수없는 영역에서 최소 거친 평균 및 최대 픽셀 값을 측정 또는 추정하여 배경 강도와 대략적인 소음을 예상하고있다. 변경 노출 시간 및 중성 밀도 필터 때문에 세포의 평균 신호는 약 배경 강도 플러스 5-10 회 맥스와 분 배경 농도 차이입니다.
- 포화되지 가까이하지 않는 이미지를 확인합니다. 이미지의 최대 강도는 세포가 유사 분열을 입력하면 강도 차이 있도록 동적 범위 (12 비트 이미지에서 예를 들어 최대 2000)의 절반 미만이어야한다.
- CFP의 여기와 YFP 방출 필터 및 적절한 이색성 거울을 사용하여 단계 2.4-2.6를 반복합니다.
- 2.7 점 2.4에 사용되는 지역 제외, transfected 세포 여러 영역을 선택하고 최대 강도를 보장은 모든 세포의 다이나믹 레인지의 절반 이상이 적습니다.
- 두 이미지 모두 4 획득 시간 경과 실험을 시작합니다YFPex를 사용하여 5 분 - YFPem 및 CFPex - YFPem 필터 설정합니다.
3. 조건을 확인하고 최적화
- 획득한 이미지를 열고 유사 분열에서 transfected 프로브를 표현하는 세포 유사 분열하는 세포주기 시간을 모니터링합니다.
- 사용되는 세포 유형에 게시된 데이터에 측정된 세포주기 시간을 비교합니다. 또한, 영화가 참조 셀 사이클 시간을 얻을에만 전송 빛의 하나의 이미지 (예 : DIC 또는 위상 대조) 매 시간을 인수함으로써 세포를 untransfected.
- 유사 분열에서 유사 분열하는 시간이 세포주기의 타이밍을 참조에 해당하는 경우에는 4 단계로 진행합니다. 또는 더 노출을 사용하여 다시 취득 이미지, 더 많은 시간을 포인트 또는 여러 개의 Z - 레벨과 단계를 반복합니다 3.
- 세포주기의 타이밍을 참조에 해당하지 않는 유사 분열에서 유사 분열하는 시간 경우에는, 영화는 결국에서만 전송 빛의 하나의 이미지 (예 : DIC 또는 위상 대조) 하나의 이미지 뒤에 매 시간을 인수함으로써 세포를 transfectedtransfected 세포를 식별하는 실험.
- transfected 세포가 아직 이상 세포주기 시간을 보여주면, 1 단계를 반복하지만 적은 프로브를 transfect 또는 탐침의 매우 낮은 금액을 포함하는 안정적인 클론을 선택하십시오.
- transfected 세포가 형광 불빛이없는 정상적인 세포주기 시간을 표시하는 경우, 이미지 사이의 binning, 중성 밀도 필터, 노출 시간 및 시간을 수정하여 2 단계지만, 낮은 노출을 반복합니다.
4. 초조 Analysing
- 분석은 현미경 전용 대부분의 소프트웨어로 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 프리웨어 ImageJ (사용 분석 수행하는 방법을 설명합니다 http://rsb.info.nih.gov/ij을 플러그인 비율 플러스 (활용) http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus를 . HTML ).
- ImageJ에서 이미지를 엽니다. 경우에는 귀하의 이미지는 여러 가지 빛깔의의 stac의 형식에K (예 Deltavision) 먼저 hyperstack로 변환하여 각 채널을 별도 : hyperstack에 이미지 hyperstack - 스택과 이후를 사용하여 단일 채널 스택에 분할 : 차원을 이미지 hyperstack - 줄이기
- 그것만이 비율이 0과 1 사이의 범위에하지 않는함으로써 이미지의 시각적 선명도를 증가하기위한 것일 뿐이므로이 단계는 선택 사항입니다 프로세스 수학 곱하기 : 3 이용한 YFPem 스택 - YFPex을 곱하면됩니다.
- YFPex에 - YFPem 스택, 세포의 결여된하는 지역에 관심을 (ROI)의 영역을 그리지만, 그 측정이 될 수있는 세포에서도 가까운 거리에 있습니다. 배경 및 신호 강도가 모두 일반적으로 이미지의 중앙에 강력한는 같은 이미지의 다른 세포가 다른 지역을 요구할 수 있습니다.
- 투자 수익 (ROI) 관리자에게 투자 수익 (ROI)를 추가 분석 - 도구 - 투자 수익 (ROI) 관리자.
- 분석 - 측정 : - YFPem와 CFPex - YFPem 스택 YFPex 모두 투자 수익 (ROI)의 평균 강도를 측정
- 여러 timepoints에서 반복하고 관심 세포에 가까운 배경 농도가 영화 전반에 걸쳐 유사 확인합니다.
- 분석 - 설정 측정 - 최소 및 최대 회색 값 : 최소한의 강도를 포함하는 측정을 설정합니다.
- 세포의 대부분을 다루는 관심 영역을 그려과 YFPex 모두 최소 농도 측정 - YFPem와 CFPex - YFPem 스택을. 4.6에서 측정한 최소 강도와 배경 강도의 차이를 가지고 두하여 나눕니다. 이것은 클리핑의 가치에 대한 시작을 예측할 수 있습니다.
- 오픈 비율 플러스. YFPem 및 CFPex - - YFPem 스택 YFPex을 선택합니다. 비율을 선택 CFPex 걱정 위해 - 스택 1로 YFPem - 스택 1로 YFPem을 거꾸로가 인산화시 효율 저하를 걱정 프로브 선택 YFPex를 시각화 비율을 걱정하십시오.
- 측정된 배경 농도 및 클리핑 값을 넣습니다.
- 결과 비율 스택의 배율을 설정하고 적당한 모양의 U를 적용비율 변화를 시각화하는 P 테이블 (LUT).
5. 대표 결과
Plk1 활동은 유사 분열 동안 G2 단계와 봉우리의 핵에서 처음 볼 수 있습니다. 그림 3은 제 2에서 설명한대로 최소한 phototoxicity 설정을 사용하여 실험을 보여줍니다. 이것은 대표적인 초기 결과주의와 이미지 사이의 노출 조건이나 시간이 잡음 비율 또는 시간적 해상도로 신호를 증가 수정할 수 있습니다하시기 바랍니다. 프로브를 표현 세포의 대부분은 이미징 조건과 프로브의 표현 수준은 세포주기의 타이밍에 영향을 미치지 않습니다 나타내는 20 사이 및 25 시간의 세포주기의 시간 분아 따위에 의해 중식 그 그림 3 차원 보여줍니다. 상당한 소음이 있지만, Plk1 활동의 추세는 G2의 증가와 유사 분열 14 peaking하면 (그림 3A) 명확하게 볼 수 있습니다. 이곳으로 원시 데이터를 처리하는 말은 평균 거꾸로 RA의 kymograph (그림 3B) 또는 부량로 제시 필터링 티오 (그림 3C)는 명료을 강화할 수 있습니다.
그림 1. 무서워 기반 프로브의 원리 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링합니다. 두 fluorophores, 일반적으로 CFP (파란색)와 YFP (녹색)은, phospho - 결합 도메인 (오렌지색)과 phosphorylatable 시퀀스 (노란색)에 의해 연결되어 있습니다. 따라서 탐사에 conformational 변화를 유도 phospho 결합 도메인에 바인딩 인산화 (적색) mediates. CFP와 YFP 사이의 효율성을 걱정에 영향을 미치는 두 fluorophores, 사이의 거리 또는 방향의 차이에 conformational 변화 결과. 안달 흥분 CFP 및 모니터링 YFP 방출 (점선)에 의해 시각하실 수 있습니다.
그림 2. 실험 절차의 도식 개요.
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그림 3. Plk1 활동은 유사 분열 동안 G2 단계와 봉우리의 핵에서 처음 볼 수 있습니다. 안달 기반 프로브 모니터링 Plk1 활동 9,14을 표현 U2OS 세포는 20x NA 0.7 공기 객관적이고 수은 램프를 갖춘 Deltavision Spectris 이미징 시스템을 사용하여 60 시간에 대한 촬영했다. 이미징 조건 4X binning과 중성 밀도 필터를 사용하여, 같은 섹션 2에 명시된 최소한의 phototoxicity를 일으킬 선정되는 들어오는 빛을 차단 99%. 네 부문을 통해 한 셀 아래 거꾸로 걱정 - 비율, 잘못된 색상 표현. B, 의미 필터를 적용한 후에에 표시된 셀의 kymograph. C, 거꾸로의 부량는 A. D에 표시된 셀, 50의 누적 mitotic 항목의 비율을 걱정 딸 세포의 부서를 포함하여 표현 세포, - 프로브를 무서워.
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Discussion
세포주기에 걸쳐 무서워 모니터링하는 것은 외부 자극에 단기 반응을 평가했을 때 덜 중요한 고려 사항이 필요합니다. 첫째, 세포주기의 진행은 쉽게 phototoxicity이 최소로 보관이 필요한, 스트레스 신호에 의해 불안정하게된다 는걸 알수 있습니다. 둘째, 모든 기자 잠재적 kinases, phosphatases 또는 상호 작용 도메인을 titrating으로 세포 프로세스에 영향을 줄 수 있습니다. 실험 조건이 충분한 경우에는 평가하는 아마도 가장 간단한 방법은 유사 분열에서 유사 분열하는 세포주기의 길이를 측정하고 탐침의 형광 이미지와 표현의 독립 실험 비교하는 것입니다.
모니터링에 중요한 요소는 세포주기에 걸쳐 비율이 높은 해상도로 아름다운 이미지를 얻기위한 유혹을 견딜 수 있습니다 무서워. 정확한 설정이 현미경 시스템 및 표현 수준과 특정 프로브의 자연의 감도에 따라하지만, 사용하는 것이 중요합니다무엇에 해당하는 binning 수준의보고 절대적으로 필요합니다. CFPex 사이의 시간이 있지만 - YFPem 및 YFPex - YFPem 이미지가 우리 손에 셀 형태의 변경을 피하기 위해 짧게해야 더 이상의 0.1 초 노출 시간을 유지하고 중립적인 밀도 필터에 의해 형광의 강도를 줄이기 위해 더 .
phototoxicity이 영향을 어떻게 세포주기가 표현 수준과 프로브의 지방화에 크게 의존합니다. 염색질로 지역화된 것입니다 프로브는 히스톤와 융합하여 예를 들어, phototoxic 부산물이 DNA의 주변에서 만든 아마도 때문에 형광등에 더 민감한 세포를 렌더링. 그것은 기자의 상대적으로 낮은 수준을 표현하는 세포를 모니터링하고 다시 확인 셀 사이클 타이밍 다양한 subcellular 구조로 프로브를 현지화하는 경우에하는 것이 중요합니다.
여러 제어 실험 걱정이에 있는지 확인하는 데 필요한실험 설정 및 그 비율 변경 프로브의 실제 인산화을 반영합니다. 이러한 키나제의 억제 또는 고갈과 같은 기능 컨트롤,를 제외하고, 그것은 생화학 프로브가 phosphorylated되어 있는지 확인하기 위해 실험이 아닌 phosphorylatable 잔여물에 프로브 내에 예상 phospho - 수용체 사이트의 돌연변이, 그리고 photobleaching 수용체를 수행하는 것이 좋습니다 초조의 발생을 증명. 광범위한 검증의 예를 들어, 심판 14 보충 그림 3을 참조하십시오.
그것은 이러한 설정을 변경 및 조명 조건을 집중하고 쉽게 유물을 초래할 수있는 매우 민감한 CFP 및 YFP 방출을 모두 아르 모니터링하여 변경 내용을 안달 평가하는 이론적으로 바람직하지만. 변경 내용을 초점을 감도는 CFP와 YFP 방출이 같은 지점에 초점을하지 색수차, 때문입니다. 조명 변화는 빛의 경로의 다른 정렬에 크게 의존합니다. 필터가 포함된 큐브를 사용하는 경우이 특히 유명합니다이색성 거울. 초점과 조명의 변화가 수정 목표와 신중하게 정렬된 필터 큐브를 사용하여 줄일 수 있습니다. 그러나, 우리의 경험에서 방출 필터 상수를 유지하는 것은 낫게 여기 및 방출 필터를 별도로 제어할 수있는 설정을 사용하여, 우수한 결과를 제공합니다.
안달 - 변경 관찰의 크기는 CFP 형광에서 YFP 방출 필터 bleedthrough에 의해 감소됩니다. 경우에는 bleedthrough은 추가 CFPex 상당한입니다 - YFPem 이미지 - CFPem 이미지가 CFPex에 bleedthrough를 해결하기 위해 취득하실 수 있습니다. 그러나, 이러한 수정은 차이를 초점에 민감하고 유물을 소개합니다. 또한, 그들은 phototoxicity 생산 수있는 추가 이미지를 필요로합니다.
24 시간에 걸쳐 초점 세포를 유지에만 모니터링 YFP 방출은 + 시간 경과 실험이 어려운 수있을 때 문제가 적은 있지만. 초점 나타난다을 피하려면 확인하는 현미경그리고 접시는 미리 예열하고 방에 온도가 변동하지 않는다는 것입니다. 또는, transfected 프로브의 이미징을 기반으로하지 않는 오토포커스 시스템을 사용합니다.
사용하는 목적의 선택은 특정 응용 프로그램에 따라 달라집니다. 석유 기반의 높은 NA의 목적은 더 많은 빛을 수집하고 향상된 해상도를 제공하지만, 변화를 초점에 더 민감하고 높은 콘텐츠 설정에 비실 용적인 것입니다. 우리는 세포질 또는 핵 무서워 - 비율을 연구하기 위해 상대적으로 높은 NA와 공기 목표를 사용하는 것을 선호하고, 높은 subcellular 해상도가 필요한 경우에만 오일 목표 NA 높은 사용합니다.
본 논문은 영화 많은 생명 과학 연구자에 일반적으로 사용할 수 있으며 현미경 및 이미지 처리만을 기초 지식을 필요로 장비를 사용하는 세포주기를 통해 무서워 기반 프로브를하는 간단한 방법을 설명합니다. 보다 전문적인 대안 빔 - 스플리터의 사용, 형광 수명 M을 포함icroscopy (FLIM) 1 개체 세분화 16 계산을 자동화하는 소프트웨어는 비율 17 무서워.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 스웨덴 연구 협의회, 전략 연구, 스웨덴의 암 사회, 스웨덴의 아동 암 사회 아케 Wibergs 재단과 Jeanssons 기초에 대한 스웨덴의 기초에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15, no phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 21083-027 | |
| DMEM+Glutamax-I | GIBCO, by Life Technologies | 31966 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SV30160.03 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Hyclone | SH30236.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14287 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 |
References
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
- Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
- Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
- Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
- Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
- Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
- Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
- Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 Forthcoming.
- Morgan, D. O. The cell cycle : principles of control. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).
- Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
- Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
- van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).
