Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Summary

De omvang van de winkel bediende Ca

Abstract

Store bediend Ca ^{2 +} entry (SOCE), eerder aangeduid als capacitieve Ca ^{2 +} ingang, is een strak gereguleerd mechanisme voor instroom van extracellulaire Ca ^{2 +} in de cellen aan verarmd endoplasmatisch reticulum (ER) of sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca ^{2 +-winkels} te vullen ^1,2. Sinds Ca ^{2 +} is een alomtegenwoordige tweede boodschapper, is het niet verwonderlijk om te zien dat SOCE speelt een belangrijke rol in verschillende cellulaire processen, met inbegrip van proliferatie, apoptose, gentranscriptie en beweeglijkheid. Door zijn brede aanwezigheid in bijna alle typen cellen, waaronder epitheelcellen en skeletspieren, heeft deze route ontvangen grote belangstelling ^3,4. Echter, de heterogeniteit van SOCE kenmerken verschillende celtypes en de fysiologische functie nog niet duidelijk ^5-7.

De functionele eigenschappen van SOCE kanaal kan worden onthuld door de patch-clamp studies, terwijl een grote hoeveelheid kennis over this pad is opgedaan door middel van fluorescentie-based intracellulaire Ca ^{2 +} metingen vanwege het gemak en de haalbaarheid van high-throughput screening. Het doel van dit rapport is om een paar fluorescentie gebaseerde methoden samen te vatten aan de activering van SOCE in monolaag cellen, geschorst cellen en spiervezels ^5,8-10 te meten. De meest gebruikte deze fluorescentie methoden rechtstreeks controleren de dynamiek van ^{intracellulair} Ca2 ⁺ met de verhouding van F _{340 Nm} en F _{380 nm} (510 nm voor emissie golflengte) van de ratiometrische ^{Ca2 +} indicator Fura-2. Om de activiteit van unidirectionele SOCE isoleren van ^{intracellulair} Ca2 ⁺ en afgifte Ca ^{2 +} extrusie wordt een Mn ^{2 +} quenching gebruikte assay. ^{Mn2 +} bekend kunnen doordringen in de cellen via SOCE terwijl het ondoordringbaar het oppervlak membraan extrusie of ER opname ^door Ca2 ⁺ pompen vanwege de zeer hoge affiniteit with Fura-2. Hierdoor de quenching van fluorescentie Fura-2 geïnduceerd door de vermelding van extracellulaire ^{Mn2 +} in de cellen is een meting van de activiteit van SOCE ^9. Ratiometrisch meting en de Mn ⁺² quenching assays worden uitgevoerd op een cuvet gebaseerde spectrofluorometer een celpopulatie, of in een microscoop-gebaseerd systeem om afzonderlijke cellen te visualiseren. Het voordeel van single cell metingen is dat individuele cellen blootgesteld aan gen-manipulaties kunnen worden geselecteerd met behulp van GFP of RFP verslaggevers, waardoor studies in genetisch gemodificeerde of gemuteerde cellen. De eigenschappen van spatiotemporele SOCE in structureel gespecialiseerde skeletspier kan op huid spiervezels door gelijktijdig controle van de fluorescentie van twee lage affiniteit ^{Ca2 +} indicatoren afgestemd op de compartimenten van het spierweefsel, zoals Fluo-5N in SR en Rhod- 5N in de dwars-tubuli ^9,11,12.

Protocol

1. ^{Intracellulair} Ca2 ⁺ meting van afzonderlijke cellen

1. KYSE-150, een menselijke slokdarm plaveiselcelcarcinoom (ECSS) cellijn wordt gekweekt in _5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C in gemengde RPMI 1640/Ham de F-12 medium (1:1) met 5% foetaal runderserum.
2. KYSE-150 cellen getransfecteerd met de plasmiden met een shRNA specifiek tegen Orai1 of gecodeerde sequentie. De plasmiden ook een gen coderend rood fluorescent eiwit (RFP) als een reporter, die wordt aangedreven door een afzonderlijke promoter.
3. De cellen worden gekweekt in glazen bodem schalen (nr. 1.5 beschermglas, MatTek, MA) gedurende 48 uur.
4. Verwijder het medium en spoel de cellen met een gebalanceerde zoutoplossing (BSS) (140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM _CaCl2, 2 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,2).
5. Voeg 1 ml BSS oplossing die 2 uM Fura-2 acetoxymethyl ester (Molecular Probes) in de schaal en wikkel geheel schotel folie protect tegen licht.
6. Incubeer de cellen gedurende 40 min bij 37 ° C en laat ze nog 15 min bij kamertemperatuur periode om esterhydrolyse wordt uitgevoerd. Was de cellen met BSS twee keer.
7. Plaats de schotel op het stadium van Nikon TE200 omgekeerde microscoop, die verbonden is PTI spectrofluorometer met golflengten van 350 tot 390 nm en emissie bij 510 nm. De exacte golflengten gebruikt worden kunnen enigszins variëren afhankelijk van de optiek van ieder systeem. De twee golflengten met beste verhouding dynamische bepaald door excitatiespectrum scannen van Fura-2 zout in oplossingen met ^{Ca2 +} variërend 0 tot 39,8 uM (of hogere concentratie waarbij Fura-2 fluorescentie verzadigd).
8. Stel een dichtheid perfusie met 4 verschillende oplossingen BSS: Ca ^{2 +} (2 mM), EGTA (0,5 mM), EGTA-TG (thapsigargin, 5 pM), ^{Ca2 +-2-APB} (a SOCE remmer, 75 pM). Computergestuurde geautomatiseerde perfusiop systemen kunnen ook worden gebruikt.
9. Selecteer de cellen die RFP in visualisatie-modus.
10. Plaats de opening topje van de perfusie-systeem op een vergroting van 10x tot de tip is recht boven het gebied van belang in een hoek van 45 graden.
11. Tegelijkertijd nemen de fluorescentie signalen F _{350 nm} en F _390nm. Ratio (F _{350 nm} / F _390nm) wordt weergegeven in het derde venster. Wijzig de bloedtransfusie-oplossingen in de volgende volgorde: Ca ^{2 +,} EGTA, Ca ^{2 +,} EGTA-TG; Ca ^{2 +,} Ca ^{2 +-2-APB.}

De bovenstaande protocol kan worden aangepast voor het meten van ^{intracellulair} Ca2 ⁺ in celsuspensie systeem.

12. Culture KYSE-150 cellen in een T25 fles met dezelfde cultuur staat als hierboven.
13. Wanneer de cellen 90% confluentie bereiken verwijderen medium en spoel de cellen met een BSS oplossing.
14. Voeg 2,5 ml BSS oplossing die 2 uM Fura-2 AM en incubeerde cellen gedurende 40 min bij 37 ° C gevolgd door esterificatie.
15. Verwijder de BSS, voeg 2,5 ml trypsine in de kolf en incubeer bij 37 ° C totdat de cellen los te maken. Voeg vervolgens 2,5 ml kweekmedium de trypsine stoppen en de cellen geoogst door centrifugatie bij 800 rpm gedurende 5 minuten.
16. Was de cellen met kweekmedium nog een keer door middel van centrifugeren en resuspendeer de cellen 'pellet in de BSS-oplossing (zonder toevoeging van 2 mM _CaCl2, met uM bereik Ca ^{2 +)} en tel de cellen nummer met een hematometer.
17. Voeg ~ 10 ⁶ cellen in een kwarts cuvet (10 mm, Starna cellen) en vul het volume tot 2 ml met BSS.
18. Plaats de cuvet (roeren met een magnetische bar) in de spectrofluorometer.
19. Tegelijkertijd nemen de fluorescentie signalen F _{340 Nm} en F _{380 nm} met een emissie golflengte bij 510 nm. De lopende protocol is: BSS, toevoeging van 0,5 ul EGTA (0,25 M voorraad), toevoeging van 1 pi thapsigargin(TG, 10 mM voorraad), toevoeging van 4 pi Ca ^{2 +} (1 M voorraad).

2. Mn afschrikken test in gekweekte cellen

1. Voer golflengte scannen Fura-2 in oplossingen met verschillende Ca ^{2 +} concentratie variërend 0-39,8 pM de Ca concentratie-afhankelijke golflengte als de isosbestic duiden. Meestal is de isosbestic punt is op of rond 360 nm.
2. KYSE-150-cellen worden gekweekt in glazen bodem gerechten en geladen met Fura-2 uur.
3. Stel het perfusiesysteem met 5 verschillende BSS oplossingen: Ca ^{2 +} (2 mM), EGTA / TG (0,5 mM en 5 uM genoemd), Mn ^{2 +} (0,5 mM, zonder toevoeging van EGTA of Ca ^{2 +,} dat vrij Ca ^{2 +} in uM bereik), Mn ^{2 +} / 2 APB (75 uM), EGTA / Triton X-100 (0,1%).
4. Monteer de schotel op het podium van de microscoop en selecteer de "Opwinding Ratio"-modus met excitatie golflengte van 360 nm en 390 nm en emissie bij 510nm.
5. Tegelijkertijd nemen de fluorescentie signalen F _{360 Nm} en F _390nm met Ratio (F _{360 Nm} / F _390nm) weergegeven in het derde venster. De lopende protocol: Ca ^{2 +} 1 min de fluorescentie stabiliseren, ^{Mn2 +} 30 seconden, EGTA / TG 10 min, ^{Mn2 +} 2 min, EGTA-Triton X-100 (0,1%) 1 min de achtergrond te bekomen. ^{Mn2 +} / 2 APB oplossing plaats van ^{Mn2 +} worden gebruikt om de opgeheven fluorescentie quenching, wat aangeeft dat de ^{Mn2 +} ingang via SOCE weg te onderzoeken.

3. Mn afschrikken test in de spiercellen

1. C2C12 een muis myogene cellijn, wordt gekweekt op glazen bodem schotels in _5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C in DMEM medium dat 10% foetaal bovine serum, 10% paardenserum.
2. Nadat de cellen samenvloeiing bereikt, wordt het kweekmedium veranderd differentiatie medium (verwijderen foetaal runderserum en verminderinge paardenserum tot 2,5%). De C2C12 myoblasten zal differentiëren tot myotubes na 4 dagen.
3. Plaats C2C12 myotubes met een eindconcentratie van 5 pM Fura-2 AM beschreven in 1.4-1.6.
4. Voeg een eindconcentratie van 20 pM N-benzyl-p-tolueen sulfonamide (BTS) spiercontracties en bewegingsartefacten door te remmen en 15 min toe alvorens het experiment.
5. Plaats de schotel op het stadium van de microscoop verbonden met het apparaat en PTI laden volgende BSS oplossingen in de perfusiesysteem: 2 Ca ^{2 +} (2 mM), 0 ^{Ca2 +, Mn2 +} (0,5 mM), Mn ^{2 +} / TG (0,5 mM, 20 uM, respectievelijk).
6. Stel het perfusiesysteem zoals hierboven beschreven.
7. Tegelijkertijd nemen de fluorescentie signalen F _{360 Nm} en F _390nm met de Ratio (F _{360 Nm} / F _390nm) weergegeven in het derde venster. De lopende protocol is: 2 Ca ^{2 +} 1 min, 0 Ca ^{2 +} 1 min Flush afstand ^{Ca2 +, Mn2 +} 0,5 min, ^{Mn2 +} / TG gedurende 10 minuten en ^{Mn2 +} / EGTA-Triton X-100 (0,1%).

4. Ruimte en tijd opgelost SOCE in huid spiervezels

1. Bereid de volgende oplossingen.
   Isotonisch tyrode buffer: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, 2,5 mM _CaCl2, pH 7,2, 290 mOsm
   Kweekmedium: DMEM met 2% paardenserum en 1% penicilline en streptomycine
   Wasoplossing 1: 109,6 mM K-glutamaat, 2 mM EGTA KOH, 6,7 mM _MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM creatine (CP), 20 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) KOH, pH 7,0
   Wasoplossing 2: 140 mM K-glutamaat, 5 mM EGTA KOH, 6,5 mM _MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES KOH, pH 7,0
   Ontvellen oplossing: 140 mM K-glutamaat, 6,5 mM _MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES KOH, pH 7,0
   TT-ladenoplossing 90,6 mM K-glutamaat, 18 mM Na-glutamaat, 0,55 mM _CaCl2, 2 mM EGTA KOH, 6,7 mM _MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg / ml creatine (CK), 20 mM BES-KOH, 5 uM carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), pH 7,0, PCA 7,0
   SR laden oplossing: 107,8 mM K-glutamaat, 0,98 mM _CaCl2, 2 mM EGTA KOH, 6,6 mM _MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg / ml CK, 20 mM BES KOH, 5 uM FCCP, pH 7,0, PCA 6,6
   SR aantasten oplossing: 100 mM K-glutamaat, 40 mM Na-glutamaat, 10 mM EGTA KOH, 10 mM 1,2-bis (o-aminophenoxy) ethaan-N, N, N ', N'-tetraazijnzuur (BAPTA ), 0,35 mM _MgCl2, 0,5 mM ATP, 1 mM CP, 20 mM BES KOH, 5 pM FCCP, pH 7.0. 25 mM caffeine/20 uM thapsigargin (TG) worden toegevoegd voor de experimenten.
2. Om de extensor digitorum longus (EDL) spier te ontleden in de eerste vaststelling van de muizen en leg de been bij zijligging en verwijder de huid van de enkel tot aan de knie, knippende oppervlakkige spier weefsellagen de EDL bloot, en scheiden de bovenste en onderste pezen de intacte EDL spieren los, is het belangrijk om pezen zo lang mogelijk. De EDL wordt overgebracht naar een oplossing die tyrode 0 ^{Ca2 +} en 0,1 mM EGTA voor een contracties voorkomen.
3. Onder een stereomicroscoop, gebruikt u twee pincet tot lagere inbrengen pezen vast te houden en splitsing van de EDL spier in twee bundels. Herhaal dit proces tot en met 4 en 8 bundels te verkrijgen. Het is essentieel dat pezen blijven voor elk van de bundels 8 aan het einde van het proces. Als ze verloren gaan van een aantal bundels, gooi deze weg.
4. Onder een stereomicroscoop, wordt elke EDL bundel strip jammerden aan beide pezen en zorgvuldig uitgerekt tot 3 ~ 4 gescheiden enkele spier vezels worden intact gelaten met een pees aan beide zijden.
5. Doe 1 druppel van Ca ^{2 +} gratis tyrode buffer in het midden van het glas-onderste schaal, vaststelling van de EDL-strips recht op de schotel, snel te verwijderen zo veel mogelijk van deoplossing, vervolgens band naar beneden beide pezen met waterbestendig plakband, en zorg ervoor dat de tape is strak. Was de eerste vezel met 0 ^{Ca2 +-oplossing} en daarna met een 2,5 mM ^{Ca2 +} oplossing 2 maal. Als de vezel hyper-contracten en schade wordt opgemerkt, gooi de vezel.
6. Indien nodig, kan de vezel worden gekweekt tot maximaal 96 uur, waardoor genetische manipulaties. Was de vezel 3 keer met een complete kweekmedium en voeg 2 ml medium in de schotel, plaats in 5% CO ₂ en 37 ° C incubator. Voor elk experiment, onderzoek spiervezels en lever dit zonder duidelijke strepen of met tekenen van verontreiniging, of met tekenen van schade zoals contractuur van de sarcolemmal membraan. Goede vezels reageren op KCl, elektrische stimulatie, en cafeïne stimulatie.
7. Enkele spiervezels 3 keer gewassen met wasoplossing 1 en ondergedompeld in intracellulaire-achtige onthuiden oplossing met 500 pM Rhod-5N en 0,5 mM ^{Ca2 +} 5 minuten.
<li> Met behulp van een Tungsten naald bevestigd aan een penhouder, mechanisch de huid van de vezels onder een stereomicroscoop, waardoor transversale tubuli (TT) om automatisch reseal en de Rhod-5N geconjugeerd met Ca ^{2 +} te vangen in de TT, twee keer was de huid vezels met wasoplossing # 2. De mechanische skinning proces is optimaal wanneer minder dan 25% van de cel breedte wordt verwijderd tijdens het onthuiden proces.
8. Om de SR laden worden huid vezels geïncubeerd met het onthuiden oplossing die 20 pM Fluo-5N 1 h uur bij kamertemperatuur, gevolgd door uitgebreid wassen met wasoplossing # 2 en incubeer gedurende 30 min om volledige de-esterificatie van de kleurstof.
9. Na 30 min, huid vezels zijn zichtbaar onder 60X doel van de confocale microscoop. Fluorescentie beelden worden verkregen bij golflengten van het betreffende kleurstoffen (excitatie bij 543 nm en emissie langer dan 570 nm voor Rhod-5N; excitatie bij 488 nm en emissie bij 530-560 nm voor TL-5N). Regions van belang (ROI) zijn geselecteerd voor elke kleurstof belaste gebieden.
10. Het experimentele protocol is als volgt: TT-loading oplossing voor 120 s, SR-loading oplossing voor 120 s, SR-uitputting oplossing voor 400-750 s om de SR Ca ^{2 +} winkel afbreken. Tijdens dit proces worden de veranderingen in de Rhod-5N-intensiteit (TT Ca ^{2 +)} en TL-5N-intensiteit (SR Ca ^{2 +)} opgenomen, waardoor er een tijdsverloop bepalen van relatieve fluorescentie veranderingen in de TT en SR. Gemiddelde waarden van fluorescentie intensiteit van meerdere vezels verder geanalyseerd. De maximale belasting intensiteit eind TT / SR geladen onder genormaliseerd op 100%.

5. Representatieve resultaten

We onderzochten SOCE activiteit KYSE-150 cellen met ^{intracellulair} Ca2 ⁺ meting (Fig. 2.). Met behulp van RFP als verslaggever, konden we de individuele cellen getransfecteerd met plasmide bevattende specifieke shRNA tegen orai1 te selecteren, een gen dat codeert voor het SOCE channel. In vergelijking met cellen getransfecteerd met plasmiden die scramble shRNA (zwart trace), het neerhalen van Orai1 eiwit resulteert in een verminderde SOCE activiteit (rood trace).

SOCE in KYSE-150 cellen werd ook bevestigd door de ^{Mn2 +} quenching assay (figuur 3.). De golflengte van 360 nm rapporteert de isosbestic punt Fura-2, waarbij de fluorescentie onafhankelijk van ^{Ca2 +} concentratie. Na TG volledig verarmd ER ^{Ca2 +} winkels de perfusie van ^{Mn2 +} resulteerde in een significante afname fluorescentie. De totale SOCE activiteit kan worden gemeten door de afname percentage Fura-2 fluorescentie intensiteit steiler waarin een actieve SOCE, terwijl een ondieper helling betekenis van een minder actieve SOCE. De helling van fluorescentie afname in 2-APB behandelde cellen bleek veel ondieper, volgens hetwelk SOCE activiteit geblokkeerd door deze verbinding. Het Mn^{2 +} quenching tarieven werden vastgesteld op basis van het verslag van de eerste 10 seconden, waar de afkoeling nog in lineaire bereik zonder verzadiging.

Een soortgelijke Mn ^{2 +} quenching assay werd uitgevoerd in de spier (fig. 4.). In dit geval ^{Mn2 +} toegepast met TG. Terwijl TG werd uitputting van de SR Ca ^{2 +-winkels,} de fluorescentie quenching helling geleidelijk veranderd tot het bereikte zijn maximale snelheid. De sigmoïdale curve geeft de gesorteerde activering van SOCE onder deze experimentele omstandigheden.

Gezonde en ongeschonden enkele spiervezels in de cultuur vertoonde een duidelijke en uniforme strepen, geen tekenen van verontreinigingen, en geen tekenen van krimp veroorzaakte schade. Deze vezels konden samentrekken reactie op elektrische stimulatie of depolariserende oplossingen. Onder confocale beeldvorming, gevild vezels vangen van Rhod-5N kleurstof in de TT compartiment toonde de karakteristieke zoogdieren doublet patroon (visufinanciële meerwaarden die in het rode kanaal). Na het laden van de SR met Fluo-5N AM, de typische doorspekt SR patroon zichtbaar was (in het groene kanaal). Na perfusie van de gevilde vezel met TT / SR laden oplossing, fluorescentie-intensiteit van zowel Rhod-5N en Fluo-5N toegenomen; na perfusie met SR uitputting oplossing, fluorescentie niveaus in de SR compartiment en de TT compartiment begon af te nemen, met vermelding van strakke koppeling tussen de SR Ca ^{2 +} winkel uitputting en SOCE activering, respectievelijk (fig. 5.).

Figuur 1. Activering van de winkel bediende Ca ^{2 +} toegang (SOCE). Orai1, wordt een kanaal porie vormen van eenheid, gelegen op de plasmamembraan (PM) en STIM1, een Ca ^{2 +-sensor,} bevindt zich op het endoplasmatisch of sarcoplasmatisch reticulum (ER / SR) membranen. Bij het ​​ER / SR Ca ^{2 +-winkels} zijn ofwel afnemen als gevolg van het blokkeren van de ER / SR Ca ^{2 +-pomp} (SERCA) of Ca ^{2 +} versie door middel van IP _3-receptor of ryanodine receptor, wordt STIM1 geactiveerd. Geactiveerd STIM1 moleculen vormen patches en induceren de aggregatie van Orai1, die verder leidt de activering van SOCE.

Figuur 2. Meten van de intracellulaire ^{Ca2 +} met KYSE-150 cellen. Uitwisseling van extracellulaire oplossing van 0 Ca ^{2 +} (0,5 mM EGTA) 2 mM ^{Ca2 +} induceerde geen wijzigingen in intracellulaire ^{Ca2 +.} 5 uM TG in 0 Ca ^{2 +} bad oplossing geïnduceerde passieve ER Ca ^{2 +} release. Na ER ^{Ca2 +-winkels} verarmd (> 10 min), toevoeging van extracellulaire Ca ^{2 +} (2 mM) geactiveerd een aanhoudende ^{intracellulair} Ca2 ⁺ hoogte door SOCE, die kan worden geblokkeerd door SOCE remmers, bijv. SKF-96365 en 2 - APB (gegevens niet te tonen). Cellen getransfecteerd met plasmiden die shRNA specifiek tegenorai1 (rood) significant afgenomen SOCE dan cellen getransfecteerd met versleuteling sequentie (zwart).

Figuur 3. ^{Mn2 +} quenching assay van SOCE in KYSE-150 cellen. Quenching van fluorescentie Fura-2 Mn ^{2 +} (0,5 mM) werd gemeten op de ^{Ca2 +-onafhankelijke} golflengte van Fura-2 (360 nm). Cellen werden behandeld met 5 pM TG gedurende 10 min bij geheel leeg ER ^{Ca2 +} winkels. Het verval helling van Fura-2 fluorescentie bij ^{Mn2 +} toevoeging (streeplijnen in de eerste 10 sec) vertegenwoordigen de activering van SOCE, die uitgedrukt als percentage vermindering van fluorescentie per tijdseenheid (de eerste waarde als 100%). De maximaal afgeschrikte fluorescentiesignaal is aan het einde van het experiment door lyseren van de cellen met 0.1% Triton X-100 (als 0%). Cellen werden behandeld met 2 APB (75 uM) toonde een veel ondieperhelling suggereert SOCE geblokkeerd door deze verbinding in KYSE-150 cellen.

Figuur 4. Graded activering van SOCE in de spiercellen onthuld door Mn ^{2 +} quenching-test. Activering van SOCE kon worden ingeschreven, terwijl TG werd uitputting van SR Ca ^{2 +} winkels. Gelijktijdige toepassing van Mn ^{2 +} (0,5 mm) en TG (20 uM) induceerde een graded-en sigmoïdale afname van intracellulaire Fura-2 fluorescentie (cyaan stippellijn om de snelste quenching punt te tonen), dat was duidelijk vanaf het eerste Mn ^{2 +} quenching tarief (blauwe stippellijn). ^{Mn2 +} quenching helling nagenoeg gelijk basale niveau cellen behandeld 2 APB (75 uM), hetgeen suggereert dat SOCE geremd.

Figuur 5. Ruimte en tijd opgelost SOCE in huid spiervezels. (A) Rhod-5N zout werd geladen in TT en Fluo-5N AM werd geladen in SR. (B) Na het aanbrengen van Ca ^{2 +} depletie oplossing, de fluorescentie in zowel de TT en SR compartimenten afgenomen. Het verlies van TL-5N fluorescentie aangegeven snel afgegeven SR Ca ^{2 +-inhoud} en het verlies van Rhod-5N fluorescentie voorgestelde activering van SOCE.

Discussion

Hoewel de golflengten van ^{Ca2 +-binding} en ^{Ca2 +} vrije Fura-2 zijn 340 nm en 380 nm respectievelijk de beste verhouding dynamisch bereik van Fura-2 ^{Ca2 +-concentratie} kan op andere golflengten in een bepaalde microscoop systeem. Deze verschuivingen golflengte gewoonlijk als gevolg van veranderingen in de lichtweg van de toevoeging van verschillende optische componenten. In deze studie werden de excitatiegolflengten voor Fura-2 bepaald als 350 nm en 390 nm door het uitvoeren van spectrale analyse van Fura-2 fluorescentie.

De intracellulaire ^{Ca2 +-niveau} in het cytosol resultaten van een saldo van verschillende bronnen, waaronder ^{intracellulair} Ca2 ⁺ release extracellulaire ^{Ca2 +} ingang, alsmede ^{Ca2 +} uitsluitingsmechanisme de ER en plasmamembraan. Om de unidirectionele SOC gemedieerde ^{Ca2 +} influx isoleren van ^{intracellulair} Ca2 ⁺ en afgifte ^{Ca2 +} extrusion kan de ^{Mn2 +} quenching assay gebruikt worden. ^{Mn2 +} bekend kunnen doordringen in de cellen via SOCE maar ongevoelig oppervlaktemembraan extrusie of ER opname ^door Ca2 ⁺ pompen. Daarom fluorescentie quenching is een meting van unidirectionele ^{Mn2 +} flux in cellen die de mate van activering van SOCE schat. ^{Mn2 +} quenching assay uitgevoerd op de isosbestic punt, zoals golflengte Fura-2 fluorescentie intensiteit is onafhankelijk ^van Ca2 ⁺ concentratie. De isosbestic punt voor elk systeem moet worden bepaald door spectrum scannen. Als alternatief kan ^{Mn2 +} quenching opgenomen door aangepaste fluorescentie bij elke twee golflengten zodanig dat de uiteindelijke waarde onafhankelijk ^van Ca2 ^{+-concentratie 13.}

Om de ruimtelijke en temporele informatie van de activiteit van SOCE in de skeletspieren te krijgen, hebben we gebruik van een dual-dye methode, die gelijktijdig MeasureMe maaktnt van SOCE activiteit en SR Ca ^{2 +-gehalte} in huid volwassen zoogdieren EDL spiervezels. De correlatie tussen veranderingen in de SR Ca ^{2 +} inhoud en SOCE activiteit kan worden uitgezet om de drempel en de gevoeligheid van SOCE activering tot uitputting van de SR Ca ^{2 +} opslag te geven. De TT-laden oplossing geoptimaliseerd bovendien de T-buisjes geladen met ^{Ca2 +} en priming van de T-buisjes en de SR-laden oplossing is ontworpen om maximaal SR Ca ^{2 +} lading te bevorderen en tevens laden T-buisjes met ~ 500 uM Ca ^{2 +.} FCCP is opgenomen in de TT / SR-laden oplossing en SR-afbrekende oplossing voor de effecten van de mitochondria elimineren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
Glass Bottom Dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20 °C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20 °C, seal tight, protected from light
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20 °C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette	Starna Cells	3-Q-10
thapsigargin	Tocris	1138
2-Amin–thoxydiphenylborane (2-APB)	Tocris	1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Collagenase Type I	Sigma	C0130
Equipment:
A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil). A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).