基于荧光测定活细胞中的钙进入商店经营：从培养的肿瘤细胞，骨骼肌纤维

Summary

店经营CA的程度

Abstract

商店经营的Ca ^{2 +}进入（SOCE），早期称为库容的Ca ^{2 +}进入，是一个涌入细胞外Ca ^{2 +}进入细胞，以补充枯竭的内质网（ER）或肌浆网（SR）的Ca ^{2 +}商店严格监管机制^1,2。由于^钙离子是一种普遍存在的第二信使，它是不奇怪，SOCE多种细胞过程中起着重要的作用，包括增殖，凋亡，基因转录和运动。由于其广泛发生在几乎所有类型的细胞，包括上皮细胞和骨骼肌，这一途径已得到极大的兴趣^3,4。然而，在不同类型的细胞和生理功能的SOCE特征的异质性仍然不明确^5-7。

SOCE功能的通道特性可以发现，而大量的知识约氏体膜片钳研究基于荧光的细胞内^钙离子的测量，因为它的方便和高通量筛选的可行性已经获得人生道路。本报告的目的是总结了一些基于荧光的方法来衡量SOCE在单层细胞，悬浮细胞和肌纤维^5,8-10激活。最常使用这些荧光的方法是直接动态监测胞内Ca ^{2 +}使用的F _340nm的发射波长（510 nm）的比例的Ca ^{2 +}荧光浓度指示剂fura-2和F _380nm的比例。隔离开来单向SOCE活性细胞内Ca ^{2 +}释放和Ca ^{2 +}挤压，常用的Mn ^{2 +}淬火法。锰^{2 +}被称为是能够渗透到细胞通过SOCE，而这是防渗膜表面的挤压过程，或雌激素受体 ​​摄取^钙+泵由于其非常高的亲和力机智ĤFURA-2。因此，外锰^{2 +}进入细胞诱导的Fura-2荧光猝灭SOCE ⁹测量的活动。可以进行比率测量和Mn ⁺²淬火检测细胞的人口模式，或在显微镜为基础的系统，以可视化的单细胞在试管基于分光光度计。单细胞测量的优点是可以选择使用GFP或RFP的记者，让转基因或突变的细胞研究，基因操作的单个细胞。 SOCE结构专门骨骼肌中的时空特征，可以实现皮肤的肌纤维，同时监测两个低亲和力^钙荧光FLUO-5N，如肌纤维中的SR和具体的车厢有针对性地⁺指标Rhod 5N在横管^9,11,12。

Protocol

1。细胞内Ca ^{2 +}测量单个细胞

1. KYSE-150，一个人食管鳞状细胞癌（ECSS）细胞株培养在5％CO ₂的气氛，在37°C的混合的RPMI 1640/Ham的F-12培养基（1:1），含5％胎牛血清。
2. KYSE-150细胞转染质粒或者含有shRNA的专门针对Orai1或炒序列。质粒基因编码作为记者，这是由一个独立的启动子驱动的红色荧光蛋白（RFP），还包括。
3. 细胞生长在玻璃底菜（第1.5玻璃盖，MatTek，马）48小时。
4. 取出介质和冲洗细胞，用平衡盐溶液（BSS）（140毫米氯化钠，氯化钾2.8毫米，2毫米氯化钙_{2，MgCl 2的} 2毫米，10毫米肝素钠，pH值7.2）。
5. 加入1毫升的BSS解决方案，包含2微米的Fura-2乙酰酯（分子探针）入菜，并用铝箔纸包裹，整道菜蛋白酶CT光。
6. 在37°C孵育40分钟的细胞，然后离开他们在室温下为一个额外的15分钟内让酯水解完成。与BSS洗涤细胞两次。
7. 装入菜尼康TE200倒置显微镜，它是连接公共交通交汇处分光光度计激发波长，在350和390 nm和510 nm处的发射阶段。要使用的确切的激发波长可以略有不同取决于各个系统的光学。确定最佳比例动态两个波长激发频谱扫描的Fura-2盐中含有的Ca ^{2 +}从0到39.8μM（或更高浓度的Fura-2荧光饱和）的解决方案。
8. 成立了4个不同的解决方案在BSS重力灌注系统的Ca ^{2 +（2}毫米），EGTA（0.5毫米），EGTA-TG（毒胡萝卜素，5μM）的Ca ^{2 +-2-}建业（SOCE抑制剂“，75 μM）计算机控制的自动化perfusi系统上也可以使用。
9. 选择细胞表达RFP的可视化模式。
10. 定位在10倍放大倍率的灌注系统启用提示，直到针尖以上地区的利益是在45度角。
11. 同时记录的F _为350nm和F _390nm荧光信号。比（F _为350nm / F _390nm）显示，在第三个窗口。更改灌注以下顺序的解决方案的Ca ^{2 +;} EGTA的Ca ^{2 +} EGTA-TG的Ca ^{2 +}的Ca ^{2 +-2-}建业。

上述协议可以修改为测量细胞内Ca ^{2 +}在细胞悬液系统。

12. 文化KYSE-150细胞在与上述相同的培养条件下的T25瓶。
13. 当细胞达到90％汇合，除去介质和冲洗细胞与BSS解决方案。
14. 添加2.5毫升含2微米的Fura-2 AM和孵化的BSS解决方案细胞40分钟，在37°C间跟着脱酯化。
15. 删除的BSS，添加2.5毫升胰蛋白酶在37°C，直到细胞分离到烧瓶，并培育。再加入2.5毫升培养基停止胰蛋白酶和收获的细胞，在800转离心5分钟。
16. 离心洗更多的时间与培养基中的细胞重新悬浮颗粒细胞的BSS解决方案（不加2毫米氯化钙_2，含有μm范围内的Ca ^{2 +）}和计数细胞使用hematometer数。
17. 加入到石英比色皿（10毫米，Starna细胞）〜10 ⁶细胞和填充量高达2毫升与BSS。
18. 放入分光光度计试管（与磁棒搅拌）。
19. 同时记录与发射波长在510 nm处的F _340nm的和F _380nm的荧光信号。正在运行的协议是：BSS的，除了0.5μLEGTA（0.25M股票），另外1μL毒胡萝卜素（甘油三酯（TG），10毫米股票），另外4μL的Ca ^{2 +（1}米股票）。

2。培养细胞中的锰淬火法

1. 执行的Fura-2激发波长扫描解决方案，包含不同的Ca ^{2 +}浓度范围从0到39.8微米，以确定钙离子浓度等色点的独立波长。通常情况下，等色点或360纳米左右。
2. KYSE-150细胞培养在玻璃底部的菜肴和加载的Fura-2 AM。
3. 成立灌注系统：与5个不同的BSS解决方案的Ca ^{2 +（2}毫米），EGTA /易性癖（0.5毫米和5μm，分别），锰^{2 +（0.5}毫米，不加EGTA或^钙离子含有游离的Ca ^{2 +}在μm范围内），锰^{2 +} / 2-APB（75μM），EGTA /剂Triton X-100（0.1％）。
4. 装载显微镜阶段的菜，然后选择“激励比”模式，激发波长为360 nm和390 nm，发射，在510纳米。
5. 同时记录的F比_390nm与_360nm处和F（F _360nm处 / F _390nm）在第三个窗口显示的荧光信号。正在运行的协议是：1分钟的Ca ^{2 +}稳定的荧光， ^锰+ 30秒，10分钟，锰EGTA /易性癖^{2 +} 2分钟，EGTA海卫X-100的（0.1％），持续1分钟获得的背景读数。可用于锰^{2 +} / 2，建业解决方案，而不是对Mn ^{2 +}检查取消的荧光猝灭，这表明了Mn ^{2 +}入门SOCE途径是通过。

3。在肌肉细胞中的锰淬火法

1. C2C12细胞，小鼠肌细胞线，是在37°C的DMEM含10％胎牛血清，10％马血清的培养基培养玻璃底菜在5％CO ₂气氛。
2. 细胞达到汇合后，改变培养基分化培养基（除去胎牛血清和减少é马血清2.5％）。后4天，C2C12细胞分化成肌管。
3. 加载C2C12肌管与5μM终浓度的Fura-2上午在1.4-1.6。
4. 添加终浓度为20μM的N-苄基-P-甲苯磺酰胺（BTS），来抑制肌肉收缩和运动造成的工件，并允许在开始实验前15分钟。
5. 交汇处的设备连接到显微镜的舞台上安装盘和灌注系统装入以下BSS解决方案：2的Ca ^{2 +（2}毫米），0的Ca ^{2 +，}锰^{2 +（0.5}毫米）;锰^{2 +} / TG（0.5毫米，20μM，分别）。
6. 成立如上所述灌注系统。
7. 在第三个窗口中显示的比率（F _360nm处 / F _390nm），同时记录的F _360nm处和F _390nm荧光信号。正在运行的协议是：2的Ca ^{2 +} 1分，0的Ca ^{2 +} 1分钟FLUSH距离的Ca ^{2 +，}锰^{2 +}为0.5分钟，锰^{2 +} / 10分钟，和Mn ² TG ⁺ / EGTA的Triton X-100（0.1％）。

4。空间和时间上解决皮肤肌纤维SOCE

1. 准备以下的解决方案。
   等渗缓冲台氏：140毫米氯化钠，氯化钾5毫米，10毫米的肝素钠，MgCl _2的 2毫米，2.5毫米氯化钙_2，pH值7.2，290 mosm
   培养基：2％和1％的马血清青霉素，链霉素的DMEM培养液
   解决方案＃1：109.6毫米的K-谷氨酸， 洗净 2毫米EGTA氢氧化钾，6.7毫米MgCl _2的三磷酸腺苷，2毫米，6毫米的磷酸肌酸（CP）20毫米列印，N-二（2 -羟乙基）-2 -氨基乙酸（BES），氢氧化钾，pH值7.0
   清洗解决方案＃2：140毫米的K-谷氨酸EGTA-KOH毫米，6.5毫米MgCl _2的 ，2毫米的三磷酸腺苷，CP的6毫米，20毫米的BES，氢氧化钾，pH值7.0，5
   剥皮的解决方案：140毫米的K-谷氨酸，MgCl _2的 6.5毫米，2毫米的三磷酸腺苷，CP的6毫米，20毫米的BES，氢氧化钾，pH值7.0
   TT加载解决方案：90.6毫米，18毫米谷氨酸钠， _氯化钙 0.55毫米，2毫米EGTA-KOH，MgCl _2的 6.7毫米，5.4毫米ATP，15毫米的CP，0.0025毫克/毫升肌酸激酶（CK），20毫米的K-谷氨酸百世氢氧化钾，5微米羰基氰化物P-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP），PCA，pH值7.0 7.0
   SR装载解决方案：107.8毫米，0.98毫米氯化钙_2，EGTA-KOH 2毫米，6.6毫米MgCl _2的 ATP的5.4毫米，15毫米的CP，0.0025毫克/毫升对照，20毫米的BES-氢氧化钾，5微米FCCP的K-谷氨酸， pH值7.0，6.6前列腺癌
   简消耗的解决方案：K -谷氨酸，100毫米40毫米10毫米谷氨酸钠，EGTA-KOH，10毫米1,2 -双（邻氨基苯氧基）乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸（BAPTA ），0.35毫米MgCl _2的 ATP的0.5毫米，1毫米，20毫米的BES-氢氧化钾的CP，5微米FCCP，pH值7.0。 25毫米caffeine/20μM的毒胡萝卜素（TG），实验前加入。
2. 解剖的趾长伸肌（EDL）的肌肉，先放下老鼠，并安排在腿侧卧位，然后从脚踝到膝盖皮肤，切浅表肌肉层组织揭露了EDL，并断绝上下肌腱释放完整的EDL肌;重要的是保持尽可能长的肌腱。 EDL是转移到台氏液，含0的Ca ^{2 +}和EGTA 0.1毫米，以防止任何收缩。
3. 立体显微镜下，用两个镊子保持较低的插入肌腱，并分成两束的EDL肌。重复的过程，以获得4年，然后8束。肌腱保持在该进程的结束，8束，这是关键。如果他们失去了一些捆绑，抛弃他们。
4. 立体显微镜下，每个EDL捆绑带是抱怨道，两筋和仔细拉长，直到3〜4分离的单个肌纤维都留下完整与肌腱两侧。
5. 将1滴的Ca ^{2 +}在中间的玻璃底菜免费台氏缓冲直线上的菜，放下了EDL带，尽可能的快速清除解决方案，然后都用防水胶带，确保磁带的筋向下的磁带是严密的。先洗纤维0的Ca ^{2 +}溶液中，然后用2.5毫米的Ca ^{2 +}溶液的2倍。如果纤维超合同和损害注意到，丢弃的纤维。
6. 如果需要，可以培养的光纤长达96小时，使遗传操作。完整的培养基洗纤维的3倍，并加入2毫升入菜的介质，在5％CO ₂和37°C间孵化器的地方。每次实验前，检查肌肉纤维和丢弃那些没有明确的条纹或污染的迹象，或如细胞膜膜挛缩损伤的迹象。良好的纤维回应，氯化钾，电刺激，刺激和咖啡因。
7. 单肌纤维的洗涤与洗涤液＃1的3倍和沐浴Rhod-5N 500微米和0.5毫米的Ca ^{2 +} 5分钟内像剥皮的解决方案。
<李>使用钨针连接到针座，机械立体显微镜下皮肤的纤维，使横小管（TT），自动重新密封，并捕获与Ca ² Rhod-5N共轭⁺在TT，两次洗皮肤纤维洗涤液＃2。在蒙皮过程中删除单元格的宽度小于25％时是最佳的机械剥皮过程。
8. 加载SR，皮肤纤维孵育20μM的FLUO-5N 1小时，在室温下，广泛使用一个额外的30分钟洗涤液＃2，孵育清洗，让皮肤含有的解决方案，完整的去酯化染料。
9. 30分钟后，皮肤纤维60X客观的共聚焦显微镜下可视化。获得相应的染料（激发波长为543 nm和发射时间比570纳米Rhod-5N;激发在488 nm和排放量在530-560纳米荧光5N）波长的荧光图像。 regi每个染料装领域选择感兴趣的组件（投资回报）​​。
10. 实验的协议如下：TT -负荷为120秒，装载的SR-120，SR消耗400-750以消耗的SR的Ca ^{2 +}存储的解决方案解决方案解决方案。在此过程中，Rhod-5N强度的变化（电汇的Ca ^{2 +）}和5N荧光强度（简的Ca ^{2 +）}的记录，创造一个相对荧光的变化，在TT和SR的时间当然决心。荧光强度的平均值，从多种纤维作进一步分析。在TT /简式结束时的最大负荷强度正常化至100％。

5。代表结果

我们审查KYSE-150细胞的SOCE活动，利用细胞内Ca ^{2 +}测量（ 图2）。使用利福平作为记者，我们可以选择orai1含有特定的shRNA质粒转染对单个细胞的基因编码SOCEÇhannel。与转染质粒与含有争夺的shRNA（ 黑色线 ），敲Orai1减少的SOCE活动（ 红色曲线 ）的蛋白质结果。

SOCE KYSE-150细胞中也证实了Mn ^{2 +}淬火法（ 图3）。激发波长为360 nm报告等色点的Fura-2，荧光是独立的Ca ^{2 +}浓度。后甘油三酯完全耗尽的ER的Ca ^{2 +}店，灌注的Mn ^{2 +}导致在一个显着的荧光减少。整体SOCE活动可以衡量的Fura-2荧光强度显示出更积极的SOCE一个陡峭的斜坡下降速率，而浅的斜坡意义不太积极的SOCE。 2建业细胞荧光下降的斜率要浅得多，这表明，这种化合物被阻断SOCE活动。锰^{2 +}淬火率进行了测定，从最初的10秒，淬火仍然没有饱和的线性范围的记录。

类似的锰^{2 +}淬火法进行肌肉（ 图4）。在这种情况下，锰^{2 +}与TG。而甘油三酯消耗的SR的Ca ^{2 +}商店，荧光猝灭坡逐渐改变，直至达到其最大速率。 S形曲线，表明这些实验条件下的分级SOCE激活。

健康完好的文化单肌纤维表现出明确和统一的条纹，没有污染的迹象，没有收缩损伤的迹象。这些纤维能够响应电刺激或去极化的解决方案合同。在共聚焦成像，Rhod-5N染料剥皮纤维在TT车厢诱捕表明哺乳动物的特征双峰模式（visu就是靠在红色通道）。在加载SR FLUO-5N上午，穿插典型的SR模式是可见的（绿色通道）。 TT /简装载解决方案的皮肤纤维灌注后，Rhod-5N和Fluo-5N荧光强度增加;灌注SR枯竭的解决方案后，在SR车厢和TT的车厢荧光水平开始下降，表明紧耦合之间的SR的Ca ^{2 +}商店枯竭和SOCE激活，分别为（ 图5）。

图1。激活存储操作的Ca ^{2 +}进入（SOCE）。Orai1，孔隙通道形成单位，位于质膜（PM）和STIM1的， ^一种 Ca2 ⁺传感器，位于质或肌质网（ER / SR）的膜。时，ER / SR的Ca ^{2 +}门店减少，由于封锁，ER / SR的Ca ^{2 +}泵（电监会A）或通过IP ₃受体或ryanodine受体的Ca ^{2 +}释放，STIM1的被激活。激活STIM1的分子形成的补丁和诱导的聚集Orai1，从而进一步导致SOCE激活。

图2。测量KYSE-150细胞内Ca ^{2 +}在细胞外液的外汇。0的Ca ^{2 +（0.5}毫米EGTA）到2毫米的Ca ^{2 +}并没有引起任何细胞内^钙离子的变化。 5μM的甘油三酯在0的Ca ^{2 +}沐浴液引起的被动的ER的Ca ^{2 +}释放。耗尽后雌激素受体 ​​的Ca ^{2 +}商店（10分钟），持续内Ca ^{2 +}海拔SOCE，可以通过阻断SOCE抑制剂通过激活胞外Ca ^{2 +（2}毫米）此外，如SKF-96365和2 -建业（数据未显示）。含有专门针对的shRNA质粒转染细胞orai1（红色）显示SOCE争夺序列（黑色）转染细胞相比，显着降低。

图3。锰^{2 +}的SOCE淬火法在KYSE-150细胞的Ca ^{2 +}独立的Fura-2（360 nm）的激发波长测定锰^{2 +（0.5}毫米）的Fura-2荧光猝灭。细胞经5μM10分钟TG完全耗尽的ER的Ca ^{2 +}商店。 ⁺加法（虚线，在第10秒）后， ^锰的Fura-2荧光衰减斜率代表，这是表示单位时间内的荧光（初始值的100％）减少百分之SOCE激活。最大淬火的荧光信号是建立在实验结束后，裂解细胞，0.1％的Triton X-100（0％）。 2-APB（75μM）处理的细胞表现出了浅斜坡，建议SOCE这KYSE-150细胞中的化合物被封锁。

图4。在肌肉细胞中发现锰^{2 +}淬火法梯度SOCE激活。SOCE激活可以注册，而甘油三酯的消耗SR的Ca ^{2 +}商店。同时应用的Mn ^{2 +（0.5}毫米）和TG（20μM）诱导细胞内的Fura-2荧光（青色虚线显示最快的淬火点），这是明显的，从最初的锰^{2 +}淬火梯度和S形下降率（蓝色虚线）。锰^{2 +}淬火坡度为2-APB（75μM）处理的基底细胞水平几乎保持相同，这表明，SOCE抑制。

图5。空间和时间上解决皮肤的肌纤维SOCE。 （一）RHOD-5N盐加载到TT和FLUO-5N AM被加载到的SR（B）申请的Ca ^{2 +}消耗的解决方案后，在TT和SR车厢荧光下降。 FLUO-5N荧光的损失迅速释放的SR的Ca ^{2 +}含量和Rhod-5N荧光损失建议SOCE激活。

Discussion

虽然的Ca ^{2 +}结合的Ca ^{2 +}免费的Fura-2激发波长为340 nm和380 nm处，分别的最佳比例的Fura-2的动态范围为Ca ^{2 +}浓度测量，可能会发生在其他波长在一个特定的显微镜系统。波长的这种变化通常是由于除了与各种光学元件的光学路径的变化。在这项研究中，FURA-2激发波长为350 nm和390 nm的决定FURA-2荧光光谱的分析。

细胞内Ca ^{2 +}水平的细胞质结果从几个来源的平衡，包括细胞内Ca ^{2 +}释放，细胞外Ca ^{2 +}进入，以及在ER和细胞膜^钙离子排斥机制。为了隔离从单向SOC介导的Ca ^{2 +}涌入细胞内Ca ^{2 +}释放和Ca ⁺ EXTR延髓的Mn ^{2 +}淬火法都可以使用。锰^{2 +}被称为是能够渗透到细胞通过SOCE，但防渗膜表面挤压或吸收^钙的ER ⁺泵。因此，荧光猝灭代表进入细胞的单向锰^{2 +}流量测量估计SOCE激活程度。锰^{2 +}淬火法等色点波长在这样的Fura-2荧光强度是独立的Ca ^{2 +}浓度。为每个系统等色点应确定由光谱扫描。另外， ^锰+淬火可以在任何两个波长，在这样一种方式，最终的价值是独立的Ca ^{2 +}浓度¹³记录调整后的荧光。

为了获得的SOCE骨骼肌肉的活动空间和时间的信息，我们采用双染的方法，它允许同时measuremeNT SOCE活性和SR的Ca ^{2 +}在皮肤成年哺乳动物的EDL肌纤维含量。 SR钙^2的变化之间的关系⁺活动内容和SOCE可以绘制指示阈值和灵敏度SOCE激活枯竭的SR的Ca ^{2 +}存储的。 TT加载的解决方案进行了优化，另外加载的T管与Ca ^{2 +}和吸T型管和SR的装载解决方案旨在促进最大的SR的Ca ^{2 +}负荷，另外加载的T-管〜500微米的Ca ^{2 +。} FCCP在TT /简加载的解决方案和SR消耗的解决方案，以消除从线粒体的影响。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
Glass Bottom Dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20 °C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20 °C, seal tight, protected from light
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20 °C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette	Starna Cells	3-Q-10
thapsigargin	Tocris	1138
2-Amin–thoxydiphenylborane (2-APB)	Tocris	1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Collagenase Type I	Sigma	C0130
Equipment:
A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil). A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).