Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Summary

A extensão da loja operado Ca

Abstract

Loja operado Ca ^{2 +} entrada (SOCE), anteriormente denominado capacitiva Ca ^{2 +} entrada, é um mecanismo altamente regulado para influxo de Ca ^{2 +} extracelular em células para repor empobrecido retículo endoplasmático (ER) ou retículo sarcoplasmático (SR) de Ca ^{2 +} lojas ^1,2. Uma vez que o Ca ^{2 +} é um mensageiro ubíquo em segundo lugar, não é surpreendente verificar que SOCE desempenha papéis importantes numa variedade de processos celulares, incluindo transcrição proliferação, gene apoptose, e motilidade. Devido à sua ampla ocorrência em quase todos os tipos de células, incluindo células epiteliais e os músculos esqueléticos, esta via tem recebido grande interesse ^3,4. No entanto, a heterogeneidade das características SOCE em diferentes tipos de células e da função fisiológica ainda não são claros ^5-7.

As propriedades funcionais do canal SOCE pode ser revelada por patch-clamp estudos, enquanto que uma grande corpo de conhecimento sobre thivia de s foi adquirida por fluorescência baseados intracelulares de Ca ^{2 +} medições por causa de sua conveniência e viabilidade de high-throughput screening. O objetivo deste relatório é resumir alguns fluorescência baseados em métodos para medir a ativação de SOCE em monocamada de células, as células em suspensão e fibras musculares ^5,8-10. Os mais comumente usados ​​os métodos de fluorescência é monitorar diretamente a dinâmica de Ca ^{2 +} intracelular função da relação entre F e F _{340nm 380nm} (510 nm para a emissão de comprimento de onda) do Ca ^{2 +} raciométrica indicador Fura-2. Para isolar a actividade de SOCE unidireccional a partir intracelular de Ca ^{2 +} libertação e Ca ^{2 +} extrusão, um Mn ² ensaio de têmpera ⁺ é frequentemente utilizado. Mn ^{2 +} é conhecido por ser capaz de penetrar nas células por meio de SOCE ao mesmo tempo que é impermeável à superfície da membrana processos de extrusão ou a absorção de ER por Ca ^{2 +} bombas, devido à sua elevada afinidade with Fura-2. Como resultado, a supressão de Fura-2 fluorescência induzida pela entrada de Mn ^{2 +} extracelular para dentro das células representa uma medição da actividade de SOCE ^9. Medição raciométrica e os ensaios de Mn ⁺² têmpera pode ser realizada em um espectrofluorímetro cuvete baseada no modo de uma população de células ou em um sistema de microscópio-Based para visualizar células individuais. A vantagem de medições de célula única é que as células individuais submetidos a manipulações genéticas podem ser seleccionadas utilizando GFP ou repórteres RFP, permitindo que os estudos em células geneticamente modificadas ou mutantes. As características espaço-temporais de SOCE em estruturalmente especializado músculo esquelético pode ser conseguido nas fibras musculares pele por simultaneamente o controlo da fluorescência de duas baixa afinidade de Ca ^{2 +} indicadores que permitam compartimentos específicos da fibra muscular, tais como Fluo-5N na SR e Rhod de 5N nos túbulos transversal ^9,11,12.

Protocol

1. Intracelular de Ca ^{2 +} medição para células individuais

1. KYSE-150, um carcinoma de células escamosas humano esofágica (ECSS) linha de células é cultivada em atmosfera de 5% _de CO2 a 37 ° C em meio RPMI misto 1640/Ham 's meio F-12 (1:1) contendo 5% de soro fetal de bovino.
2. KYSE-150 células são transfectadas com os plasmídeos contendo os shRNA especificamente contra Orai1 ou uma sequência codificada. Os plasmídeos também incluído um gene que codifica a proteína vermelho fluorescente (SDP) como um repórter, que é accionado por um promotor separado.
3. As células são cultivadas em pratos com fundo de vidro (N ° tampa de vidro 1,5, MatTek, MA) durante 48 horas.
4. Remover o meio e enxaguar as células com uma solução salina equilibrada (BSS) (140 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 2 _mM de CaCl2, 2 _mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, pH 7,2).
5. Adicionar 1 ml de solução de BSS contendo 2 mM Fura-2 éster acetoximetilo (Molecular Probes) para dentro do prato e enrolar o prato inteiro com papel de alumínio para protect da luz.
6. Incubar as células durante 40 min a 37 ° C e, em seguida, deixá-los por um período adicional de 15 min à temperatura ambiente para permitir a hidrólise do éster a ser concluída. Lave as células duas vezes com BSS.
7. Montar o prato com a fase de Nikon microscópio invertido TE200, que está ligado a PTI espectrofluorímetro, com comprimentos de onda de excitação a 350 e 390 nm e emissão a 510 nm. Os comprimentos de onda de excitação exactos a ser usado pode variar ligeiramente dependendo da óptica de cada sistema individual. Os dois comprimentos de onda com melhor relação dinâmica são determinados por espectro de excitação de varrimento de Fura-2 sal em soluções contendo Ca ^{2 +} variando de 0 a 39,8 uM (ou superior concentração à qual Fura-2 fluorescência é saturado).
8. Estabelecer um sistema de perfusão gravidade com 4 diferentes soluções em BSS: Ca ^{2 + (2} mM), EGTA (0,5 mM), EGTA-TG (tapsigargina, 5 mM), Ca ^{2 +-2-APB} (um inibidor SOCE, 75 iM). , Controlado por computador automatizado perfusisistemas sobre também pode ser usado.
9. Selecione as células que expressam RFP no modo de visualização.
10. Posicione a ponta de abertura do sistema de perfusão com ampliação de 10x até que a ponta está logo acima da região de interesse em um ângulo de 45 graus.
11. Gravar simultaneamente os sinais de fluorescência F _350nm e _390nm F. Ratio (F _350nm / _390nm F) é exibido na janela do terceiro. Alterar as soluções de perfusão na seguinte ordem: Ca ^{2 +;} EGTA; Ca ^{2 +;} EGTA-TG; Ca ^{2 +;} Ca ^{2 +-2-APB.}

O protocolo acima pode ser modificado para a medição de Ca ^{2 +} intracelular em sistema de suspensão de células.

12. Cultura KYSE-150 células em um balão T25 com a condição de cultura mesmo que acima.
13. Quando as células atingem confluência de 90%, retirar o meio e enxaguar as células com uma solução de BSS.
14. Adicionar 2,5 ml de solução de BSS contendo 2 mM Fura-2 AM e incubaras células durante 40 min a 37 ° C seguido por desesterificação.
15. Remover o BSS, adicionar 2,5 ml de tripsina para o balão e incubar a 37 ° C até que as células separar. Em seguida, adicionar 2,5 ml meio de cultura para parar a tripsinização e colher as células por centrifugação a 800 rpm durante 5 min.
16. Lavar as células com meio de cultura mais uma vez por centrifugação e re-suspender sedimento das células em solução BSS (sem adição de CaCl2 ₂ mM, contendo gama iM Ca ^{2 +)} e contar o número de células utilizando um hematometer.
17. Adicionar ~ 10 ⁶ células numa cuvete de quartzo (10 mm, Células Starna) e preencher o volume até 2 ml com BSS.
18. Coloque a cuvete (agitação com uma barra magnética) para dentro do espectrofluorímetro.
19. Simultaneamente gravar os sinais de fluorescência F _340nm e _380nm F com comprimento de onda de emissão a 510 nm. O protocolo de execução é: BSS, a adição de 0,5 EGTA uL (0,25 estoque M), a adição de 1 ul tapsigargina(TG, 10 mM), a adição de Ca 4 uL ^{2 +} (1 estoque M).

2. Mn ensaio de têmpera em células em cultura

1. Realizar comprimento de onda de excitação de varrimento de Fura-2 em soluções contendo várias Ca ^{2 +} concentração variando de 0 a 39,8 uM para determinar o comprimento de onda concentração de Ca independente como o ponto de isosbestic. Geralmente, o ponto de isosbestic é de ou cerca de 360 ​​nm.
2. KYSE-150 células são cultivadas em pratos com fundo de vidro e carregado com Fura-2 AM.
3. Configurar o sistema de perfusão com 5 diferente BSS: Ca ^{2 + (2} mM), EGTA / TG (0,5 mM e 5 mM, respectivamente), Mn ^{2 +} (0,5 mM, sem adição de EGTA ou Ca ^{2 +,} contendo livre Ca ^{2 +} na faixa de M), Mn ^{2 +} / 2-APB (75 mM), EGTA / Triton X-100 (0,1%).
4. Monte o prato no palco do microscópio e selecione a opção "Excitação Ratio" o modo com comprimentos de onda de excitação em 360 nm e 390 nm e emissão a 510nm.
5. Gravar simultaneamente os sinais de fluorescência F _360nm e _390nm F com razão (F _360nm / _390nm F) exibidos na terceira janela. O protocolo de execução é: Ca ^{2 +} durante 1 min para estabilizar a fluorescência, Mn ^{2 +} durante 30 seg, EGTA / TG durante 10 min, Mn ^{2 +} durante 2 min, EGTA-Triton X-100 (0,1%) durante 1 min para se obter leituras de fundo. Mn solução ^{2 +} / 2-APB pode ser usado em vez de Mn ^{2 +} para examinar a têmpera suprimida de fluorescência, que indica que o Mn ² entrada ⁺ é por via SOCE.

3. Mn ensaio de têmpera em células musculares

1. C2C12, uma linha de células de rato miogênico, é cultivada em pratos com fundo de vidro em 5% de _atmosfera de CO2 a 37 ° C em meio DMEM contendo 10% de soro fetal de bovino, soro de cavalo a 10%.
2. Após as células atingem a confluência, o meio de cultura é mudado para meio de diferenciação (remover soro fetal de bovino e reduçãoe soro de cavalo a 2,5%). Os mioblastos C2C12 irá diferenciar em miotubos após 4 dias.
3. Carregar C2C12 miotubos com uma concentração final de 5 uM Fura-2 AM como descrito no 1,4-1,6.
4. Adicionar uma concentração final de 20 mM de N-benzil-p-tolueno sulfonamida (BTS) para inibir as contracções musculares e os artefactos de movimento causadas por eles e permitir 15 min antes de se iniciar a experiência.
5. Montar o prato sobre a fase do microscópio ligado ao dispositivo PTI e carregar as seguintes soluções BSS para o sistema de perfusão: 2 Ca ^{2 + (2} mM), 0 Ca ^{2 +,} Mn ^{2 +} (0,5 mM); Mn ^{2 +} / TG (0,5 mM, 20 mM, respectivamente).
6. Configurar o sistema de perfusão como descrito acima.
7. Gravar simultaneamente os sinais de fluorescência F _360nm e _390nm F com o Ratio (F _360nm / _390nm F) exibido na janela do terceiro. O protocolo de execução é: Ca ^{2 +} 2 durante 1 min, 0 Ca ^{2 +} por 1 min a flush distância Ca ^{2 +,} Mn ^{2 +} para 0,5 min, Mn ^{2 +} / TG durante 10 min, e Mn ^{2 +} / EGTA-Triton X-100 (0,1%).

4. SOCE espacialmente e temporalmente resolvido nas fibras musculares de pele

1. Prepare as seguintes soluções.
   Tampão de Tyrode isotónica: 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 2 _mM de MgCl2, 2,5 _mM de CaCl2, pH 7,2, 290 mOsm
   O meio de cultura: DMEM com soro de cavalo 2% e 1% de penicilina e estreptomicina
   Lavar solução # 1: 109,6 mM K-glutamato, 2 mM de EGTA-KOH, 6,7 _mM de MgCl2, 2 mM de ATP, 6 mM de fosfato de creatina (CP), 20 mM de N, N-bis (2-hidroxietil)-2-aminoethanesulfonic ácido (BES)-KOH, pH 7,0
   Lavar solução # 2: 140 mM de K-glutamato, 5 mM de EGTA-KOH, 6,5 _mM de MgCl2, 2 mM de ATP, 6 mM de PB, 20 mM de BES-KOH, pH 7,0
   Esfolamento solução: 140 mM de K-glutamato, 6,5 _mM de MgCl2, 2 mM de ATP, 6 mM de PB, 20 mM de BES-KOH, pH 7,0
   TT-loadingsolução: 90,6 mM K-glutamato, 18 mM de Na-glutamato, 0,55 _mM de CaCl2, 2 mM de EGTA-KOH, 6,7 _mM de MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM de PB, 0,0025 mg / ml de creatina quinase (CK), 20 mM BES-KOH, 5 mM de carbonilo de cianeto de p-Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP), pH 7,0, 7,0 pCa
   SR solução de carga: 107,8 mM K-glutamato, 0,98 _mM de CaCl2, 2 mM de EGTA-KOH, 6,6 _mM de MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM de PB, 0,0025 mg / ml de CK, 20 mM de BES-KOH, 5 uM FCCP, pH 7,0, 6,6 pCa
   SR solução esgotar: 100 mM de K-glutamato, 40 mM de Na-glutamato, 10 mM de EGTA-KOH, 10 mM de 1,2-bis (o-aminofenoxi) etano-N, N, N ', N'-tetracético ácido (BAPTA ), 0,35 _mM de MgCl2, 0,5 mM de ATP, 1 mM de PB, 20 mM de BES-KOH, 5 uM FCCP, pH 7,0. 25 mM caffeine/20 iM tapsigargina (TG) são adicionados antes de experiências.
2. Para dissecar o extensor longo dos dedos músculo (EDL), primeiro estabelecer os ratos e organizar a perna na posição lateral, em seguida, remova a pele da área do tornozelo até o joelho, corteas camadas musculares superficiais do tecido para expor o EDL, e cortar ambos os tendões superior e inferior para libertar o músculo EDL intacto, é importante manter tendões tanto tempo quanto possível. O EDL é transferida para uma solução de Tyrode contendo 0 Ca ^{2 +} e 0,1 mM de EGTA para evitar quaisquer contracções.
3. Sob um microscópio estereoscópico, use uma pinça para segurar dois tendões inserção inferior e dividir o músculo EDL em dois feixes. Repetir o processo para se obter 4 e, em seguida, 8 feixes. É crítico que os tendões permanecem para cada um dos 8 feixes no final do processo. Se forem perdidos de alguns pacotes, descartá-las.
4. Sob microscópio estereoscópico, cada tira pacote EDL é agarrado em ambos os tendões e cuidadosamente esticado até 3 ~ 4 separados fibras musculares individuais são deixados intactos com tendão de ambos os lados.
5. Coloque 1 gota de Ca ^{2 +} tampão de Tyrode livre no meio do prato com fundo de vidro, deitou-se as tiras EDL em frente do prato, de forma rápida remover tanto quanto possível dosolução, então a fita para baixo os tendões com água fita adesiva resistente, e verifique se a fita é apertada. Lava-se a primeira fibra com a 0 Ca solução ^{+ 2} e, em seguida, com uma mM 2,5 Ca ^{2 +} solução de 2 vezes. Se a fibra hiper-contratos e danos é notado, descarte a fibra.
6. Se necessário, a fibra pode ser cultivadas durante até 96 horas, permitindo que para manipulações genéticas. Lave as fibras 3 vezes com meio de cultura completo e adicionar 2 ml de meio para o prato, em lugar de 5% de CO ₂ e 37 ° C incubadora. Antes de cada experimento, analisar as fibras musculares e descartar aqueles sem estrias claras ou com sinais de contaminação, ou com sinais de danos, tais como contratura da membrana sarcolema. Fibras boas responder à estimulação, KCl eléctrica, e estimulação da cafeína.
7. Fibras musculares individuais são lavadas 3 vezes com a solução de lavagem # 1 e banhadas em solução intracelular-like esfolamento com 500 uM Rhod-5N e 0,5 ^mM de Ca2 ^+, durante 5 min.
<li> Usando uma agulha de tungstênio ligado a um suporte de pino, mecanicamente pele da fibra sob microscópio estereoscópico, permitindo túbulos transversais (TT) para automaticamente reseal e para interceptar o conjugado Rhod-5N com Ca ^{2 +} no TT, lavar as fibras de pele duas vezes com solução de lavagem # 2. O processo de esfolamento mecânica é óptima quando menos de 25% da largura da célula é removido durante o processo de descasque.
8. Para carregar o SR, fibras de pele são incubadas com a solução de esfolamento contendo 20 uM Fluo-5N PM durante 1 h à temperatura ambiente, seguido por lavagens extensas com solução de lavagem # 2, e incubar durante mais 30 min para permitir a completa de esterificação- do corante.
9. Após 30 min, as fibras de pele são visualizados no âmbito do objectivo 60X do microscópio confocal. Imagens de fluorescência são adquiridos a comprimentos de onda dos corantes correspondentes (excitação a 543 nm e emissão de 570 nm, mais tempo do que para Rhod-5N; de excitação a 488 nm e emissão a 530-560 nm para Fluo-5N). Regions de interesse (ROIs) são selecionados para cada área de corante carregadas.
10. O protocolo experimental é o seguinte: TT-loading solução para 120 s, a solução SR-carregamento de 120 s, a solução para o esgotamento SR 400-750 s para esgotar o SR Ca ^{2 +} loja. Durante este processo, as mudanças no Rhod-5N (intensidade TT Ca ^{2 +)} e Fluo-5N intensidade (SR Ca ^{2 +)} são registadas, criando uma determinação tempo de curso do relativos alterações de fluorescência no TT e SR. Valores médios de intensidade de fluorescência a partir de fibras múltiplas são analisadas. A intensidade de carga máxima no final de carregamento-SR TT / é normalizado para 100%.

5. Os resultados representativos

Foram examinados actividade SOCE em KYSE-150 células utilizando Ca ^{2 +} intracelular de medição (Fig. 2.). Usando RFP como repórter, que poderia seleccionar as células individuais transfectadas com shRNA contendo o plasmídeo específico contra orai1, um gene que codifica o c SOCEhannel. Comparado com células transfectadas com plasmídeos contendo scramble shRNA (preto traço), o. Derrubando Orai1 de proteína resulta em atividade SOCE diminuiu (traço vermelho)

SOCE em KYSE-150 células foi também confirmado com o Mn ^{2 +} ensaio de têmpera (Fig. 3).. O comprimento de onda de excitação de 360 nm relata o ponto isosbestic de Fura-2, onde a fluorescência é independente da concentração de Ca ^{+ 2.} Depois de TG completamente esgotado ER Ca ^{2 +} armazena, a perfusão de Mn ^{2 +} resultou numa diminuição significativa de fluorescência. A actividade SOCE global pode ser medido pela taxa de diminuição de Fura-2 intensidade de fluorescência com um declive mais acentuado indicando uma SOCE mais activo, enquanto que um significado mais raso declive SOCE um menos activo. O declive da diminuição de fluorescência em 2-APB células tratadas pareceu ser muito mais raso, o que indicou que a actividade SOCE foi bloqueada por este composto. O Mn^{2 +} taxas de extinção foram determinados a partir do registro dos 10 segundos iniciais, onde o resfriamento ainda estava na faixa linear, sem saturação.

Um semelhante Mn ² ensaio de têmpera ⁺ foi realizada no músculo (Fig. 4.). Neste caso Mn ^{2 +} foi aplicada em conjunto com TG. Enquanto TG foi esgotando as SR Ca ^{2 +} lojas, a inclinação extinção de fluorescência mudou gradualmente até atingir a sua taxa máxima. A curva sigmoidal indica a ativação gradual de SOCE nestas condições experimentais.

Saudáveis ​​intactas fibras musculares individuais na cultura mostrou estriação clara e uniforme, sem sinais de contaminação, e não há sinais de contração induzida por danos. Estas fibras foram capazes de contrair em resposta à estimulação eléctrica ou soluções despolarizantes. Sob imagem confocal, o aprisionamento de fibra de esfoladas Rhod-5N corante no compartimento TT mostrou o padrão dupleto característico de mamíferos (visudesmineralizada no canal de vermelho). Após o carregamento do SR com Fluo-5N AM, o padrão típico SR pontuado era visível (no canal verde). Após a perfusão da pele com a fibra de TT / SR solução de carga, a intensidade de fluorescência de ambos Rhod-5N e Fluo-5N aumentada; sobre a perfusão com solução SR depleção, os níveis de fluorescência no compartimento SR eo compartimento TT começou a diminuir, indicando acoplamento apertado entre SR Ca ^{2 +} depleção de armazenamento e de activação SOCE, respectivamente (Fig. 5.).

Figura 1. Activação de armazenamento de accionamento Ca ^{2 +} entrada (SOCE). Orai1, um poro do canal formando unidade, está localizada na membrana plasmática (PM) e STIM1, um de Ca ^{2 +} sensor de, está localizado no retículo endoplasmático, ou sarcoplasmático (ER / SR) membranas. Quando ER / SR Ca ^{2 +} são lojas reduzida, quer devido ao bloqueio do ER / SR Ca ^{2 +} bomba (SERCA) ou Ca ^{2 +} libertação através do receptor ₃ do receptor de IP ou rianodina, STIM1 é activado. Ativados STIM1 moléculas formam manchas e induzir a agregação de Orai1, que leva ainda a ativação de SOCE.

Figura 2. Medição de Ca ^{2 +} intracelular em KYSE-150 células. Troca de solução extracelular de 0 Ca ^{2 +} (0,5 mM de EGTA) a 2 ^mM de Ca2 ⁺ não induziu qualquer alteração na Ca ^{2 +} intracelular. 5 mM TG em 0 Ca ^{2 +} banho de solução passiva induzida ER Ca ^{2 +} release. Após ER Ca ^{2 +} foram lojas empobrecido (> 10 min), a adição de Ca extracelular ^{2 + (2} mM) activada uma sustentada intracelular de Ca ^{2 +} através de elevação SOCE, que pode ser bloqueado por inibidores SOCE, por exemplo, SKF-96365 e 2 - APB (dados não mostram). As células transfectadas com plasmídeos contendo shRNA especificamente contraorai1 (vermelho) demonstraram significativamente SOCE reduzida do que as células transfectadas com a sequência de embaralhar (preto).

Figura 3. Mn ^{2 +} ensaio de têmpera de SOCE em KYSE-150 células. A têmpera de Fura-2 fluorescência por Mn ^{2 +} (0,5 mM) foi medido no ^{Ca2 +-independente} de comprimento de onda de excitação de Fura-2 (360 nm). As células foram tratadas com 5 uM TG durante 10 min para esgotar completamente ER Ca ^{2 +} lojas. O declive de decaimento de Fura-2 fluorescência após Mn ^{2 +} adição (linhas tracejadas, dentro dos primeiros 10 seg) representada a activação de SOCE, que foi expressa como redução percentual na fluorescência por unidade de tempo (o valor inicial como 100%). O sinal de fluorescência máximo temperada foi estabelecida no final da experiência por lise das células com 0,1% de Triton X-100 (como 0%). As células tratadas com 2-APB (75 uM) demonstraram uma superficial muitoSOCE inclinação, sugerindo é bloqueado por este composto em KYSE-150 células.

Figura 4. Ativação gradual de SOCE em células musculares reveladas por Mn ^{2 +} ensaio de têmpera. Ativação de SOCE poderia ser registrado enquanto TG foi esgotando SR Ca ^{2 +} lojas. Aplicação simultânea de Mn ^{2 +} (0,5 mM) e TG (20 uM) induziu uma diminuição gradual e sigmoidal de intracelular Fura-2 têmpera ⁺ fluorescência (ciano linha traço para mostrar o ponto mais rápido arrefecimento), que foi distinta da Mn inicial ² taxa (linha traço azul). Mn ^{2 +} declive têmpera permaneceu quase o mesmo nível basal como em células tratadas 2-APB (75 mM), sugerindo que SOCE foi inibida.

Figura 5. Espacialmente e temporalmente resolvido SOCE na fibra muscular pele. (A) Rhod-5N sal foi carregado para TT e Fluo-5N AM foi carregado no SR. (B) Após a aplicação de Ca ^{2 +} solução de depleção, a fluorescência em ambos TT e compartimentos SR diminuída. A perda de Fluo-5N fluorescência indicaram rapidamente libertado SR Ca ^{2 +} conteúdo ea perda de Rhod-5N fluorescência sugerido activação de SOCE.

Discussion

Embora os comprimentos de onda de excitação para Ca ^{2 +-binding} e Ca ^{2 +} livre Fura-2 são 340 nm e 380 nm, respectivamente, a gama dinâmica melhor proporção de Fura-2 para o Ca ^{2 +} medição da concentração pode ocorrer em outros comprimentos de onda em particular um sistema de microscópio. Tais mudanças no comprimento de onda são geralmente devido a alterações no percurso óptico com a adição de vários componentes ópticos. Neste estudo, os comprimentos de onda de excitação para Fura-2 foram determinados como a 350 nm e 390 nm através da realização de análise espectral de Fura-2 fluorescência.

A intracelular de Ca ^{2 +} nível nos resultados do citosol a partir de uma balança de várias fontes, incluindo intracelular de Ca ^{2 +} libertação, extracelular Ca ^{2 +} entrada, bem como Ca ^{2 +} mecanismo de exclusão na membrana ER e de plasma. Para isolar o unidireccional SOC mediada influxo de Ca ^{2 +} intracelular de Ca ^{2 +} libertação e Ca ^{2 +} extrusion, o Mn ² ensaio de têmpera ⁺ pode ser usado. Mn ^{2 +} é conhecido por ser capaz de penetrar nas células por meio de SOCE mas é impermeável a extrusão superfície da membrana ou absorção ER por Ca ^{2 +} bombas. Portanto, extinção de fluorescência representa uma medição de Mn unidireccional ^{2 +} fluxo em células que estima o grau de activação de SOCE. Mn ^{2 +} ensaio de têmpera é realizada no ponto isosbestic, no comprimento de onda, tais Fura-2 intensidade de fluorescência é independente de Ca ^{2 +} concentração. O ponto de isosbestic para cada sistema deve ser determinada por varrimento do espectro. Alternativamente, Mn ² têmpera ⁺ pode ser gravado por fluorescência corrigido em qualquer dois comprimentos de onda, de tal maneira que o valor final é independente da concentração de Ca ^{2 + 13.}

Para obter a informação espacial e temporal da atividade de SOCE nos músculos esqueléticos, que utilizou o método duplo-dye, que permite MeasureMe simultâneant de SOCE atividade e Ca ^{2 +} SR conteúdo em pele de mamíferos adultos fibras musculares EDL. A correlação entre as mudanças na SR Ca ^{2 +} atividade de conteúdo e SOCE podem ser plotados para indicar o limite de sensibilidade e de ativação SOCE ao esgotamento do Ca SR ^{2 +} armazenamento. A solução TT-carregamento é otimizado para carregar adicionalmente túbulos T com Ca ^{2 +} e para o condicionamento de túbulos T ea solução SR-carregamento foi projetado para promover a máxima SR Ca ^{2 +} e de carga para carregar adicionalmente túbulos T com ~ 500 uM Ca ^{2 +.} FCCP está incluído na solução de TT / SR-carregamento ea solução SR-empobrecimento de eliminar os efeitos da mitocôndria.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
Glass Bottom Dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20 °C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20 °C, seal tight, protected from light
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20 °C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette	Starna Cells	3-Q-10
thapsigargin	Tocris	1138
2-Amin–thoxydiphenylborane (2-APB)	Tocris	1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Collagenase Type I	Sigma	C0130
Equipment:
A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil). A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).