Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Summary

Omfattningen av butiken som drivs Ca

Abstract

Store drivs Ca ^{2 +} inmatning (SOCE), tidigare benämnt kapacitiva Ca ^{2 +} posten är en hårt reglerad mekanism för inflöde av extracellulärt Ca ^{2 +} i celler för att fylla på utarmade endoplasmatiska retiklet (ER) eller sarkoplasmatiska retiklet (ER) Ca ^{2 +} lagrar ^1,2. Eftersom Ca ^{2 +} är en allestädes närvarande andra budbärare, är det inte överraskande att se att SOCE spelar viktiga roller i ett antal cellulära processer, inklusive tillväxt, apoptos, gentranskription och motilitet. På grund av dess breda förekomst i nästan alla celltyper, inklusive epiteliala celler och skelettmuskler, har denna väg rönt stort intresse ^3,4. Emellertid är heterogenitet SOCE egenskaper i olika celltyper och vilken fysiologisk funktion ännu oklart ^5-7.

De funktionella kanal egenskaper SOCE kan avslöjas genom patch-clamp studier, medan en stor mängd kunskap om this väg har erhållits genom fluorescens-baserade intracellulära Ca ^{2 +} mätningar på grund av dess bekvämlighet och möjligheten för high-throughput screening. Syftet med denna rapport är att sammanfatta några fluorescens-baserade metoder för att mäta aktiveringen av SOCE i monoskikt celler, suspenderade celler och muskelfibrer ^5,8-10. Det mest använda av dessa fluorescens metoder är att direkt övervaka dynamiken av den intracellulära Ca ^{2 +} med användning av förhållandet F _{340 nm} och _{380 nm} F (510 nm för emissionsvåglängd) av den kvotmetriska Ca ^{2 +} indikatorn fura-2. För att isolera aktiviteten hos enkelriktade SOCE från intracellulära Ca ^{2 +} frisättning och Ca ^{2 +} extrudering, en Mn ^{2 +} släcka analysen används ofta. ^{Mn2 +} är känd för att kunna tränga in i celler via SOCE medan det är ogenomträngligt för de extruderade ytmembran processer eller till ER upptag av Ca ^{2 +} pumpar på grund av dess mycket hög affinitet with Fura-2. Som ett resultat representerar släckning av Fura-2 fluorescens inducerad av inträde av extracellulär ^{Mn2 +-i} cellerna en mätning av aktiviteten av SOCE ^9. Kvotmetriska mätning och Mn ⁺² analyser kylning kan utföras på en kyvett-baserad spektrofluorometer i en cellpopulation läge eller i ett mikroskop system för att visualisera enstaka celler. Fördelen med att en enda cell mätningar är att enskilda celler som utsatts för genprodukter manipulationer kan väljas med användning av GFP eller RFP reportrar, vilket tillåter studier i genetiskt modifierade eller muterade celler. De Spatiotemporal egenskaper SOCE i strukturellt särskild skelettmuskel kan uppnås i skal muskelfibrer genom att samtidigt övervaka fluorescensen av två låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorer är riktade mot specifika avdelningar av muskelfibrer, såsom Fluo-5N i SR och Rhod- 5N i den tvärgående kanalerna ^9,11,12.

Protocol

1. Intracellulärt Ca ^{2 +} mätning av enskilda celler

1. KYSE-150, cellinje en människa esofagus skivepitelkarcinom (ECSS) odlas i _5% CO2 atmosfär vid 37 ° C i RPMI blandad 1640/Ham sektion F-12 medium (1:1) innehållande 5% fetalt bovint serum.
2. KYSE-150-celler transfekteras med plasmider innehållande antingen shRNA specifikt mot Orai1 eller en kodad sekvens. Plasmiderna innehöll också en gen som kodar för rött fluorescerande protein (RFP) som en reporter, vilken drivs av en separat promotor.
3. Cellerna odlas i glasbottnade skålar (Nr. 1,5 täckglas, MatTek, MA) under 48 timmar.
4. Avlägsna mediet och tvätta cellerna med en balanserad saltlösning (BSS) (140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, ₂ mM CaCl2, ₂ mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,2).
5. Tillsätt 1 ml BSS-lösning innehållande 2 | iM Fura-2 acetoximetylester (Molecular Probes) i skålen och linda det hela skålen med folie för att protect från ljus.
6. Inkubera cellerna under 40 min vid 37 ° C och sedan låta dem under ytterligare 15 min period vid rumstemperatur för att tillåta esterhydrolys för att slutföras. Tvätta cellerna med BSS två gånger.
7. Montera skålen på scenen för Nikon TE200 inverterat mikroskop, som är ansluten till PTI spektrofluorometer med exciteringsvåglängder på 350 och 390 nm och emission vid 510 nm. De exakta exciteringsvåglängder som skall användas kan variera något beroende på optiken i varje individuellt system. De två våglängderna med bästa förhållandet dynamisk bestäms av exciteringsspektrum avsökning av Fura-2 salt i lösningar innehållande Ca ^{2 +} som sträcker sig från 0 till 39,8 fim (eller högre koncentration vid vilken Fura-2 fluorescens är mättad).
8. Upprätta ett system tyngdkraften perfusion med 4 olika lösningar i BSS: Ca ^{2 +} (2 mM), EGTA (0,5 mM), EGTA-TG (thapsigargin, 5 pM), ^{Ca2 +-2-APB} (en SOCE hämmare, 75 iM). Datorstyrd automatiserad perfusipå system kan också användas.
9. Markera de celler som uttrycker RFP i visualisering läge.
10. Positionera öppningen spets perfusionssystemet vid 10x förstoring tills spetsen är precis ovanför området av intresse vid en 45 graders vinkel.
11. Samtidigt registrera fluorescenssignaler F _{350 nm} och F _{390 nm.} Ratio (F _{350 nm} / F _{390 nm)} visas i den tredje fönstret. Ändra perfusionslösningar i följande ordning: Ca ^{2 +;} EGTA; Ca ^{2 +;} EGTA-TG; Ca ^{2 +; Ca2 +-2-APB.}

Det ovanstående protokollet kan modifieras för mätning av intracellulär ^{Ca2 +} i celler upphängningssystem.

12. Kultur KYSE-150-celler i en T25-kolv med samma odlingsbetingelser som ovan.
13. När cellerna når 90% konfluens, avlägsna mediet och tvätta cellerna med en BSS-lösning.
14. Tillsätt 2,5 ml BSS-lösning innehållande 2 | iM Fura-2 AM och inkuberacellerna under 40 min vid 37 ° C följt av avförestring.
15. Avlägsna BSS, tillsätt 2,5 ml trypsin till kolven och inkubera vid 37 ° C tills cellerna lossnar. Tillsätt sedan 2,5 ml odlingsmedium för att stoppa trypsinisering och skörda cellerna genom centrifugering vid 800 rpm under 5 minuter.
16. Tvätta cellerna med odlingsmedium en gång till genom centrifugering och återsuspendera cellernas pelleten i BSS-lösning (utan tillsats av 2 mM CaCl _2, som innehåller M utbud Ca ^{2 +)} och räkna cellerna numret med en hematometer.
17. Lägg ~ 10 ⁶ celler till en kvartskyvett (10 mm, Starna celler) och fyll upp volymen till 2 ml med BSS.
18. Placera kuvetten (omrörning med en magnetisk stång) i spektrofluorometer.
19. Samtidigt registrera fluorescenssignaler F _{340 nm} och F _{380 nm} med emissionsvåglängd på 510 nm. Driften protokoll är: BSS, tillsats av 0,5 pl EGTA (0,25 M förrådslösning), tillsats av 1 pl thapsigargin(TG, 10 mM stamlösning), tillsats av 4 pl Ca ^{2 +} (1 M förrådslösning).

2. Mn kylning analys i odlade celler

1. Utföra excitationsvåglängd avsökning av Fura-2 i lösningar innehållande olika ^{Ca2 +-koncentrationen} sträcker sig från 0 till 39,8 pM för att bestämma Ca koncentrationen oberoende våglängd som den isosbestiska punkten. Vanligtvis är den isosbestiska punkten vid eller omkring 360 nm.
2. KYSE-150-celler odlas i glasbottnade skålar och laddades med Fura-2 AM.
3. Ställa in perfusionssystemet med 5 olika BSS lösningar: ^{Ca2 +} (2 mM), EGTA / TG (0,5 mM och 5 ^ M respektive), ^{Mn2 +} (0,5 mM, utan tillsats av EGTA eller Ca ^{2 +,} innehållande fri Ca ^{2 +} i ^ M eller lägre), ^{Mn2 +} / 2-APB (75 pM), EGTA / Triton X-100 (0,1%).
4. Montera skålen på scenen av mikroskopet och välj "Excitation Ratio"-läge med exciteringsvåglängder vid 360 nm och 390 nm och emission vid 510nm.
5. Samtidigt registrera fluorescenssignaler F _{360 nm} och F _{390 nm} med Ratio (F _{360 nm} / F _{390 nm)} visas i den tredje fönstret. Driften protokoll är: Ca ^{2 +} i 1 min för att stabilisera den fluorescens, ^{Mn2 +} för 30 sek, EGTA / TG under 10 min, ^{Mn2 +-i} 2 min, EGTA-Triton X-100 (0,1%) under 1 min för att erhålla den bakgrundsavläsning. ^{Mn2 +} / 2-APB-lösning kan användas i stället för Mn ^{2 +} att undersöka avskaffas fluorescenssläckande, vilket indikerar att ^{Mn2 +-inträde} är genom SOCE reaktionsvägen.

3. Mn kylning analys i muskelcellerna

1. C2C12, en mus myogena cellinje, odlas på glasbottnade skålarna i _5% CO2 atmosfär vid 37 ° C i DMEM-medium innehållande 10% fetalt bovint serum, 10% hästserum.
2. Efter det att cellerna når sammanflytning är odlingsmediet till differentieringsmedium (avlägsna fetalt bovint serum och minskninge hästserum till 2,5%). De C2C12 myoblaster kommer differentiera till myotuber efter 4 dagar.
3. Ladda C2C12 myotuber med en slutlig koncentration av 5 pM Fura-2 AM såsom beskrivits i 1,4-1,6.
4. Tillsätt en slutlig koncentration av 20 ^ M N-bensyl-p-toluensulfonamid (BTS) för att inhibera muskelsammandragningar och rörelseartefakter orsakade av dem och tillåta 15 minuter före initiering av försöket.
5. Montera skålen på scenen av mikroskopet kopplas till PTI enheten och ladda följande BSS lösningar i perfusionssystemet: 2 Ca ^{2 +} (2 mM), 0 Ca ^{2 +,} Mn ^{2 +} (0,5 mM), Mn ^{2 +} / TG (0,5 mM, 20 mM, respektive).
6. Upprätta perfusionssystemet enligt beskrivningen ovan.
7. Samtidigt registrera fluorescenssignaler F _{360 nm} och F _{390 nm} med förhållandet (F _{360 nm} / F _{390 nm)} visas i den tredje fönstret. Driften protokoll är: 2 Ca ^{2 +} i 1 min, 0 Ca ^{2 +} i 1 min till flush bort Ca ^{2 +, Mn2 +} för 0,5 min, ^{Mn2 +} / TG under 10 min, och Mn ^{2 +} / EGTA-Triton X-100 (0,1%).

4. Rumsligt och tidsmässigt lösas SOCE i flådda muskelfibrer

1. Bered följande lösningar.
   Isotonisk Tyrodes buffert: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, ₂ mM MgCl2, 2,5 mM _CaCl2, pH 7,2, 290 mOsm
   Odlingsmedium: DMEM med 2% hästserum och 1% penicillin och streptomycin
   Tvättlösning # 1: 109,6 mM K-glutamat, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 _mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM kreatinfosfat (CP), 20 mM N, N-bis (2-hydroxietyl)-2-aminoetansulfonsyra syra (BES)-KOH, pH 7,0
   Tvättlösning # 2: 140 mM K-glutamat, 5 mM EGTA-KOH, 6,5 _mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0
   Flås-lösning: 140 mM K-glutamat, 6,5 _mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0
   TT-lastninglösning: 90,6 mM K-glutamat, 18 Na-glutamat mM, 0,55 _mM CaCl2, 2 EGTA-KOH mM, 6,7 _mM MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg / ml kreatinkinas (CK), 20 mM BES-KOH, 5 | iM karbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), pH 7,0, pCa 7,0
   SR laddningslösningen: 107,8 mM K-glutamat, 0,98 _mM CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6,6 _mM MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg / ml CK, 20 mM BES-KOH, 5 | iM FCCP, pH 7,0, pCa 6,6
   SR utarmande lösning: 100 mM K-glutamat, 40 Na-glutamat mM, 10 EGTA-KOH mM, 10 mM 1,2-bis (o-aminofenoxi) etan-N, N, N ', N'-tetraättiksyra (BAPTA ), 0,35 _mM MgCl2, 0,5 mM ATP, 1 mM CP, 20 mM BES-KOH, 5 | iM FCCP, pH 7,0. 25 mM caffeine/20 M thapsigargin (TG) tillsätts före experiment.
2. Att dissekera extensor digitorum longus (EDL) muskler först fastställa mössen och ordna benet vid sidoläge och ta sedan bort huden från ankeln området upp till knäet, skärade ytliga muskelskikten i vävnaden för att exponera EDL, och avskilja både de övre och nedre senor att frigöra den intakta EDL-muskeln, och det är viktigt att hålla senor så länge som möjligt. EDL överförs till en Tyrode-lösning innehållande 0 Ca ^{2 +} och 0,1 mM EGTA för att förhindra några kontraktioner.
3. Under en stereomikroskop, använda två pincett för att hålla lägre isättning senor och dela EDL muskeln i två buntar. Upprepa processen för att få 4 och sedan 8 buntar. Det är kritiskt att senor förblir för var och en av de 8 buntar vid slutet av processen. Om de försvinner från vissa buntar, kassera dem.
4. Under en stereomikroskop är varje EDL bunt band griped både senor och försiktigt sträcks till 3 ~ 4 separerade enda muskel fibrer kvar intakt med senor på båda sidor.
5. Sätt 1 droppe Ca ^{2 +} free Tyrode buffert i mitten av glaset botten skål, fastställa EDL remsorna direkt på skålen, snabbt ta bort så mycket som möjligt avlösning, så tejpen både senor med vattenfast tejp, och se till att bandet är tight. Tvätta fibern först med 0 Ca ^{2 +} och sedan med en 2,5 mM Ca ^{2 +} lösning 2 ggr. Om fibern hyper-kontrakt och skador upptäcks, kassera fibern.
6. Om så behövs, kan fibern odlades under upp till 96 timmar, vilket möjliggör för genetiska manipulationer. Tvätta fibern 3 gånger med fullständigt odlingsmedium och tillsätt 2 ml medium i skålen, rum i _5% CO2 och 37 ° C inkubator. Före varje experiment, undersöka muskelfibrer och kassera de utan tydliga ränder eller med tecken på förorening, eller med tecken på skador som kontraktur av sarcolemmal membranet. Bra fibrer svarar på KCI, elektrisk stimulering, och koffein stimulering.
7. Single muskelfibrer tvättas 3 gånger med tvättlösningen # 1 och badades i intracellulär-liknande skinnbildning lösning med 500 | iM Rhod-5N och 0,5 mM Ca ^{2 +} i 5 min.
<li> Använda en Tungsten nål fäst vid en pinne hållare, mekaniskt hud fibern under ett stereomikroskop, så tvärgående tubuli (TT) för att automatiskt återförslutningen och fånga Rhod-5N konjugerad med Ca ^{2 +} i TT, tvätta skal fibrerna gånger med tvättlösning # 2. Den mekaniska skinning-processen är optimal när mindre än 25% av cellens bredd avlägsnas under skinning-processen.
8. Att ladda den SR, är hy fibrer inkuberas med skinnbildning lösning innehållande 20 pM fluo-5N AM under 1 h vid rumstemperatur, följt av omfattande tvättning med användning tvättlösningen # 2, och inkubera under ytterligare 30 min för att medge fullständig de-esterifiering av färgämnet.
9. Efter 30 min skal fibrer är visualiserades under 60X objektiv av det konfokala mikroskopet. Fluorescensbilder förvärvas vid våglängder av de motsvarande färgämnen (excitation vid 543 nm och emission är längre än 570 nm för Rhod-5N; excitation vid 488 nm och emission vid 530-560 nm för Fluo-5N). REGIons av intresse (ROI) väljs för varje färgämne belastade områden.
10. Den experimentella protokollet är enligt följande: TT-lastning lösning för 120 s, SR-loading lösning för 120 s, SR-utarmning lösning för 400-750 s för att utarma SR Ca ^{2 +} butik. Under denna process, förändringar i Rhod-5N intensiteten (TT Ca ^{2 +)} och Fluo-5N intensitet (SR Ca ^{2 +)} registreras skapa en bestämning tidsförlopp för relativa fluorescens förändringar i TT och SR. Medelvärdena för fluorescensintensitet från flera fibrer analyseras vidare. Den maximala belastningen intensitet vid slutet av TT / SR-lastning normaliseras till 100%.

5. Representativa resultat

Vi undersökte SOCE aktivitet i KYSE-150-celler med användning av intracellulärt Ca ^{2 +} mätning (fig. 2.). Användning RFP som rapportör, kan vi välja de individuella celler som transfekterats med plasmid innehållande specifika shRNA mot orai1, en ​​gen som kodar för SOCE channel. Jämfört med celler transfekterade med plasmider innehållande rusning shRNA (svart kurva), den taga isär av Orai1 protein resulterar i minskad aktivitet SOCE (röd linje).

SOCE i KYSE-150 celler bekräftades också med Mn ^{2 +} kylning analys (Fig. 3.). Excitationsvåglängden av 360 nm rapporterar den isosbestiska punkten av Fura-2, där fluorescensen är oberoende av ^{Ca2 +-koncentration.} Efter TG helt slut ER Ca ^{2 +} butiker, perfusion av Mn ^{2 +} resulterade i en signifikant fluorescens minskning. Den totala SOCE aktivitet kan mätas genom minskningen hastighet av Fura-2 fluorescensintensitet med en brantare lutning indikerar en mer aktiv SOCE, medan ett grundare lutning enligt en mindre aktiv SOCE. Lutningen av fluorescens minskning i 2-APB-behandlade celler visade sig vara mycket grundare, vilket indikerade att SOCE aktivitet blockerades genom denna förening. Mn^{2 +} var härdningshastigheter bestämdes av protokollet från de första 10 sekunderna, där härdning fortfarande var i linjära området utan mättnad.

En liknande ^{Mn2 +-störtkylning} Analysen utfördes i muskeln (fig. 4.). I detta fall Mn ^{2 +} applicerades tillsammans med TG. Medan TG var förbruka SR Ca ^{2 +} butiker, ändrade fluorescenssläckande sluttningen gradvis tills den nådde sin maximala hastighet. Den sigmoidal kurva indikerar det graderade aktivering av SOCE under dessa experimentella betingelser.

Friska intakta enstaka muskelfibrer i kultur visade tydlig och enhetlig ränder, inga tecken på föroreningar, och inga tecken på nedgång-inducerad skada. Dessa fibrer kunde krympa som svar på elektrisk stimulering eller depolariserande lösningar. Under konfokala avbildning visade flådd fiber fånga Rhod-5N färg i TT facket det karakteristiska däggdjur dublett mönster (VISUOrealiserade i den röda kanalen). Efter lastning av SR med Fluo-5N AM, var den typiska avbrutna SR mönstret synligt (i gröna kanalen). Vid perfusion av hudfärg fibern med TT / SR lastning lösningen, ökad fluorescensintensiteten av både Rhod-5N och Fluo-5N, vid perfusion med SR utarmning lösning, började fluorescens nivåer i SR facket och TT facket att minska, vilket tyder på täta koppling mellan SR Ca ^{2 +} butiken utarmning och SOCE aktivering respektive (Fig 5.).

Figur 1. Aktivering av lager manövrerad Ca ^{2 +} inmatning (SOCE). Orai1 är en kanal porbildande enhet, belägen på plasmamembranet (PM) och STIM1, en ​​Ca ^{2 +} sensor är placerad på det endoplasmatiska eller sarkoplasmatiska retiklet (ER / SR)-membraner. När ER / SR Ca ^{2 +} butiker reduceras antingen på grund av blockering av ER / SR Ca ^{2 +} pump (SERCA) eller Ca ^{2 +} frisättning genom _{IP-3-receptor} eller ryanodinreceptorn är STIM1 aktiveras. Aktiverade STIM1 molekyler bildar fläckar och inducera aggregation av Orai1, vilket ytterligare leder aktivering av SOCE.

Figur 2. Mätning av den intracellulära Ca ^{2 +} i KYSE-150-celler. Utbyte av extracellulär lösning från 0 Ca ^{2 +} (0,5 mM EGTA) och 2 mM Ca ^{2 +} inducerade inte någon förändring i intracellulär Ca ^{2 +.} 5 M TG i 0 Ca ^{2 +} badlösningen inducerade passiva ER Ca ^{2 +} frisättning. Efter ER ^{Ca2 +} lagrar utarmades (> 10 minuter), tillsats av extracellulärt Ca ^{2 +} (2 mM) aktiveras en fördröjd intracellulär Ca ^{2 +} höjdprofil genom SOCE, som kan blockeras av SOCE inhibitorer, t.ex. SKF-96.365 och 2 - APB (data inte visar). Celler som transfekterats med plasmider innehållande shRNA specifikt motorai1 (röd) visade signifikant minskade SOCE än celler transfekterade med scramble sekvens (svart).

Figur 3. ^{Mn2 +-släckning} analys av SOCE i KYSE-150-celler. Släckning av Fura-2 fluorescens genom ^{Mn2 +} (0,5 mM) mättes vid ^{Ca2 +-oberoende} excitationsvåglängd av Fura-2 (360 nm). Cellerna behandlades med 5 | iM TG under 10 min för att fullständigt tömma ER Ca ^{2 +} butiker. Sönderfallet lutning av Fura-2 fluorescens vid ^{Mn2 +-tillsats} (streckade linjer, inuti den första 10 sek) representeras av aktiveringen av SOCE, vilket uttrycktes som procent minskning i fluorescens per tidsenhet (det initiala värdet som 100%). Den maximalt kylda Fluorescenssignalen bildades vid slutet av experimentet genom att lysera cellerna med 0,1% Triton X-100 (som 0%). Celler behandlade med 2-APB (75 iM) visade en mycket grundarelutning, vilket tyder på SOCE blockeras av denna förening i KYSE-150-celler.

Figur 4. Graderad aktivering av SOCE i muskelcellerna avslöjats genom Mn ^{2 +} släcka analysen. Kan Aktivering av SOCE registreras när TG fick tömma SR Ca ^{2 +} butiker. Samtidig applicering av Mn ^{2 +} (0,5 mM) och TG (20 pM) inducerade en gradient-och sigmoidal minskning av intracellulärt Fura-2 fluorescens (cyan streckad linje för att visa den snabbaste släckning punkt), som var distinkt från den första ^{Mn2 +} släckning hastighet (blå streckad linje). ^{Mn2 +-störtkylning} lutning var nästan samma som basala nivå i celler behandlade 2-APB (75 pM), vilket antyder att SOCE inhiberades.

Figur 5. Rumsligt och tidsmässigt lösas SOCE i skal muskelfiber. (A) RhOD-5N-salt satsades i TT och Fluo-5N AM infördes i SR. (B) Efter applicering Ca ^{2 +} utarmning lösning minskade fluorescens i både TT och SR fack. Förlusten av Fluo-5N fluorescens anges hastigt släppte SR Ca ^{2 +} innehåll och förlusten av Rhod-5N fluorescens föreslås aktivering av SOCE.

Discussion

Även om de exciteringsvåglängder för ^{Ca2 +-bindande} och Ca ^{2 +} fri Fura-2 är 340 nm och 380 nm, respektive, det bästa förhållandet dynamiska området av Fura-2 under ^{Ca2 +-koncentrationen} mätning kan ske vid andra våglängder i ett särskilt mikroskopsystemet. Sådana förändringar i våglängd oftast beror på förändringar i den optiska banan med tillägg av olika optiska komponenter. I denna studie var exciteringsvåglängder för FURA-2 bestämdes som 350 nm och 390 nm genom att utföra spektralanalyser av Fura-2 fluorescens.

Den intracellulära ^{Ca2 +-nivå} i cytosolen resulterar från en balans av flera källor, inklusive intracellulär Ca ^{2 +} frisättning, extracellulärt Ca ^{2 +} inträde, såväl som Ca ^{2 +} uteslutningssystemet vid ER och plasmamembranet. För att isolera den enkelriktade SOC-medierad Ca ^{2 +} inflöde från intracellulära Ca ^{2 +} frisättning och Ca ^{2 +} Extrusion kan ^{Mn2 +-släckning} analys användas. ^{Mn2 +} är känd för att kunna tränga in i celler via SOCE men är ogenomträngligt för ytmembranet strängsprutning eller ER upptag av ^{Ca2 +-pumpar.} Därför representerar fluorescenssläckande en mätning av ensriktad ^{Mn2 +-flöde} in i celler som beräknar graden av aktivering av SOCE. ^{Mn2 +-störtkylning} analys utförs vid den isosbestiska punkten, vid en sådan våglängd Fura-2 fluorescensintensitet är oberoende av Ca ^{2 +-koncentration.} Den isosbestiska punkten för varje system bör bestämmas genom spektrum avsökning. Alternativt kan ^{Mn2 +-släckning} registreras med justerat fluorescens vid två våglängder på ett sådant sätt att det slutliga värdet är oberoende av Ca ^{2 +} koncentration ^13.

För att få den rumsliga och tidsmässiga information om aktivitet SOCE i skelettmuskler, använde vi en dubbel-färgämne metod som tillåter samtidig measurement av SOCE aktivitet och SR Ca ^{2 +} innehåll i flådda vuxna däggdjur EDL muskelfibrer. Den korrelation mellan förändringar i SR Ca ^{2 +} innehåll och SOCE aktivitet kan ritas för att indikera tröskeln och känsligheten hos SOCE aktivering till utarmning av SR Ca ^{2 +} lagring. TT-belastningen lösningen är optimerad för att ytterligare ladda T-tubuli med Ca ^{2 +} och grundning av T-tubuli och SR-belastningen lösning är utformad för att främja maximal SR Ca ^{2 +} lastning och att dessutom ladda T-tubuli med ~ 500 pM Ca ^{2 +.} FCCP ingår i TT / SR-lastning lösningen och SR-utarmande lösningen för att eliminera effekterna från mitokondrierna.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
Glass Bottom Dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20 °C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20 °C, seal tight, protected from light
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20 °C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette	Starna Cells	3-Q-10
thapsigargin	Tocris	1138
2-Amin–thoxydiphenylborane (2-APB)	Tocris	1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Collagenase Type I	Sigma	C0130
Equipment:
A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil). A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).