Välja och isolera Kolonier av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller omprogrammeras från vuxna fibroblaster

Summary

Vi presenterar ett protokoll för effektiv omprogrammering av mänskliga somatiska celler till humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) med retrovirusvektorer som kodar Oct3 / 4, Sox2, Klf4 och c-myc (OSKM) och identifiering av korrekt omprogrammeras hiPSC med levande färgning med Tra- 1-81 antikropp.

Abstract

Häri presenterar vi ett protokoll av omprogrammering humana adulta fibroblaster in i humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) med användning av retrovirala vektorer som kodar Oct3 / 4, Sox2, Klf4 och c-myc (OSKM) i närvaro av natriumbutyrat ^1-3. Vi använde denna metod för att omprogrammera sent passage (> P10) humana vuxna fibroblaster som härrör från Friedreichs ataxi patienten (GM03665, Coriell Repository). Den omprogrammering tillvägagångssätt innefattar effektiv transduktion protokoll med användning av upprepad centrifugering av fibroblaster i närvaro av virus-innehållande media. De omprogrammerade hiPSC kolonier identifierades med användning av levande immunfärgning för Tra-1-81, en ​​ytmarkör av pluripotenta celler, separerades från icke-omprogrammerade fibroblaster och manuellt passerades ^4,5. Dessa hiPSC överfördes sedan till Matrigel plattor och odlades i feeder-fria betingelser, direkt från omprogrammering plattan. Med utgångspunkt från den första passagen, hiPSC kolonier visar karaktäristiska HES-like morfologi. Användning av detta protokoll mer än 70% av utvalda kolonier kan framgångsrikt expanderas och etablerad i cellinjer. De etablerade hiPSC linjerna visas karakteristiska pluripotensbestämmande markörer inklusive ytmarkörer TRA-1-60 och SSEA-4, samt kärnkraft markörer Oct3 / 4, Sox2 och NANOG. Protokollet presenteras här har fastställts och testats med vuxna fibroblaster som erhållits från FA patienter och individer kontroll ^6, mänskliga nyfödda fibroblaster, liksom humana keratinocyter.

Protocol

1. Virusproduktion och transduktion

1. Plattan Phoenix amfo-celler vid en densitet av ~ 7-8x10 ⁶ per 10 cm platta i 10 ml DMEM-medium (DMEM hög glukoshalt, 10% FBS värmeinaktiverat, 2 mM L-glutamin, utan antibiotika). Plats i inkubatorn och kulturen över natten vid 37 ° C, _5% CO2.
2. Nästa dag transfektera Phoenix celler med användning av 12 pg av en vektor som kodar för antingen Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc-eller GFP-genen (Addgene plasmider 17.217, 17.218, 17.219, 17.220) och 35 | il Fugene 6. Framställ transfektion blandningen i 500 | il av DMEM-medium (DMEM hög glukoshalt, 2 mM L-glutamin, utan FBS och antibiotika). Inkubera 20 min. Försiktigt Pipettera DNA-komplex i 10 cm plattor innehållande 70-80% sammanflytande Phoenix celler.
3. Ersätta mediet från 6 till 8 h efter transfektion med DMEM-medium (DMEM hög glukoshalt, 10% FBS värmeinaktiverat, 2 mM L-glutamin) innehållande penicillin och streptomycin.
4. Därefter samla virusinnehållande mediet 4 gånger i 12 h.intervall, kombinera alla delar och filtreras med ett 0,45 m filter för att ta bort fristående celler och skräp (media som innehåller viruspartiklar kan förvaras i kylskåp i 2 veckor utan att förlora smittsam aktivitet, men frysning rekommenderas inte).
5. För retrovirala transduktion, plåt humana vuxna fibroblaster (passage 10, Coriell Laboratories) från en frusen bestånd 24 timmar före den sista dagen i retroviral mediesamling. Frö cellerna på 6-brunnars gelatin täcks plattorna med en täthet 1x10 ^'5 celler per brunn i DMEM med hög glukoshalt, 10% FBS, 2 mM L-glutamin, penicillin, streptomycin och icke-essentiella aminosyror.
6. Nästa dag substitut DMEM media med media som innehåller viruspartiklar som erhållits från Phoenix celler. Tillsätt virala medier (1 ml av varje Oct4, Sox2, Klf4, och c-myc-medium, 4 ml totalt) kompletterat med 6 ^ g / ml polybren i varje brunn av 6-brunnsplatta av fibroblastodlingar och centrifugera vid 1600 g under 1 h vid 20 ° C. Ungefär 12 timmar afTER i transduktion, ersätta virala media med fibroblast odlingsmedium. Utföra virusinfektion och centrifugering 3 gånger vid 24 timmars intervall.
7. Kultur fibroblaster i DMEM media för 48 timmar efter sista infektionen. Kontrollera effektivitet infektion med parallella transduktioner med en retroviral media uttrycker GFP. Figur 1 illustrerar effektiviteten av centrifugering underlättas-retroviral infektion av humant fibroblast.

2. Omprogrammering

1. Framställa plattor med 6 brunnar med γ-bestrålade skikt MEF feeder genom ympning MEF-celler vid en densitet av ~ 2x10 ⁵ celler per brunn av gelatinet behandlats 6-brunnars platta i fibroblasttillväxtfaktor-medium. Följande dag uppdelad infekterade humana fibroblaster med användning vid en densitet av ~ 0,05% trypsin / EDTA och frö dem 1.2x10 ⁴ per brunn i fibroblaster tillväxtmediet.
2. Nästa dag ersätta mediet med HES-medium (DMEM/F12, 20% Knockout serumersättning, icke-essentiella aminosyror, penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 20 ng / ml basal fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), kompletterat med 0,5 mM natriumbutyrat under de initiala 7 dagar omprogrammering. Ändra mediet dagligen.
3. Övervaka morfologiska förändringar i omvandlade celler dagligen. Kolonier av HIPS-liknande celler kommer att börja dyka ca 5 - 10 dagar efter att överföra transducerade fibroblaster på matarceller. De hiPSC kolonier är redo att isoleras ungefär 14 - 28 dagar efter utstrykning dem på MEF matarceller.

3. Isolering av hiPSC kolonier

1. En dag innan plocka de hiPSC kolonierna förbereder 24-brunnsplattor med γ-bestrålade celler MEF matare (ca 4x10 ⁴ celler per brunn) i fibroblaster tillväxt medium. I detta skede hiPSC kolonier kan också överföras till mataren fri kultur med Matrigel och mTeSR1 medium.
2. Innan isolering av hiPSC kolonier förbereder MEF plattor genom att ta bort fibroblaster tillväxt medium och sköljning MEF med PBS för att avlägsna spår av FBS. Därefter tillsätta 0,5 ml hES mediet (eller mTeSR1 mediet i fallet med Matrigel-belagda brunnar) med 10 pM ROCK-inhibitor Y27632 till varje brunn ^7,8.
3. Om det behövs, ta bort fibroblaster kring hiPSC kolonier med en 21 gauge nål under ett mikroskop monterat i en huv med laminärt flöde (figur 2A - C). Skölj plattorna med PBS och tillför nyberedda hES media innehållande Tra-1-81 StainAlive specifik antikropp (1:200, Stemgent). Efter 30 min., Ersätta mediet innehållande antikroppen med färska hES media kompletterade med 10 pM ROCK-inhibitor. Undersök plattorna under fluorescensmikroskop och märket Tra-1-81 positiva kolonier med användning av en objektiv markör (figur 2D).
4. Skära Tra-1-81 positiva hiPSC kolonier under ett mikroskop i ett laminärt huven, i flera små bitar med hjälp av en 21 gauge nål såsom visas i figur 2E och F.
5. Med en automatisk pipett (P200) överföring fragment av hiPSC kolonier i individual brunnar i 24-brunnars platta med MEF eller Matrigel. Undvika att överföra icke-höfter celler. Placera plattorna i en 37 ° C, _5% CO2 inkubator och tillåta hiPSC kolonier fästa under 24-36 timmar.
6. Ändra HES eller mTeSR1 (för kolonier odlade på Matrigel) media dagligen. De hiPSC kolonier med korrekt HES-liknande morfologi kommer att vara synlig 48 h efter den initiala överföringen till en 24-brunnsplatta.
7. Manuellt passage hiPSC kolonier var 6 - 8 dagar på en 12-brunn och därefter på en 6-brunnsplatta.
8. Efter klonal expansion och fastställande av hiPSC linjer, analysera uttrycket av pluripotensbestämmande markörer TRA-1-60, SSEA-4, Oct3 / 4, Sox2 och NANOG användning immunocytokemi såsom visas i figur 3. Utvärdera genomisk integritet och differentiering potential av de erhållna linjer med karyotyp och teratom analyser bildning ^6,9.

4. Representativa resultat

Effektiv transduktion med retrovirus som innehåller media is kritiska för en framgångsrik omprogrammering. Det rekommenderas att utföra hela transfektion / infektion förfarande med användning av en GFP-uttryckande virus varje omprogrammering experiment för att övervaka effektiviteten som visas i figur 1. Titern av GFP-uttryckande virus bestämdes, såsom beskrivet i ^10, genom transduktion av humana fibroblaster med användning av icke-koncentrerade virala medier var typiskt inom området av 0,5 - 5 x 10 ⁷ virala partiklar per ml (VP / ml).

Fibroblaster ändras morfologi så tidigt som 2 dagar efter den sista infektionen. Trypsinerade humana fibroblaster bör noggrant räknas före sådd dem på MEF matarceller. Det rekommenderas att utsäde celler vid 3 olika densiteter (6x10 ^3, 1.2x10 ^4, 2.5x10 ⁴ per enskild brunn i en 6 brunnsplatta) eftersom varje cellinje visar olika tillväxt karakteristiska och sådd densitet är avgörande för effektiviteten i omprogrammering. Natriumbutyrat används förförsta 7 - 14 dagar omprogrammering ökar effektiviteten i hiPSC bildas ca 5 gånger. Ofta, särskilt när infekterade fibroblaster ympades vid högre densitet kan fibroblastliknande celler växa över en odlingsskål och täcka hiPSC kolonier som visas i figur 2A. I detta fall kan den fibroblastlagret noggrant lyftas och avlägsnas för att frilägga hiPSC kolonier (figur 2B). Därefter bör hiPSC kolonier sköljas med HES media och färgas med Tra-1-81 antikropp. Beroende på fibroblastceller, ungefär 20 - 40% av kolonier som visar med IPSC-liknande morfologi fläckar inte med Tra-1-81 antikropp. Identifierade hiPSC kolonier kan överföras från en platta inom nästa 12 - 24h. Långvarig odling kommer att resultera i en snabb differentiering av hiPSCs. Kolonier kan manuellt passera på antingen MEF matarceller eller Matrigel-ytbelagda plattor. Efter expansion etablerad hiPSC kloner testas med användning av immunocytokemi (ICC) för expression av pluripotency markörer såsom demonstreras i figur 3. Dessutom bör en detaljerad molekylär karakterisering av de genererade iPS cellinjer innefattar: analyser av pluripotens genuttryck med RT-PCR, demonstration av DNA demetyleringen vid initiativtagarna till pluripotensbestämmande gener och analyser av transgenerna tysta ^9.

Figur 1. Effektiviteten av viral transduktion bestämdes med användning av GFP-uttryckande retroviruset. (A, B) Human Adult fibroblaster härledda från Friedreichs ataxi patienten (GM03665, Coriell Repository) visualiserades efter två på varandra följande infektioner med GFP retrovirala medier. (C, D) Humana fibroblaster infekterades med samma sats av GFP retrovirala media följt av centrifugering av cellerna direkt på 6-brunnsplattor under 1 h vid 1600 g. Bilderna tagna 48 timmar efter infektion.

Figur 2. Identifieringen och isoleringen av hiPSC kolonier. (A) Faskontrast bild av en platta innehållande hiPSCs omgivna av fibroblaster. Cellerna odlades under 21 dagar på hES medier. (B, C) Samma hiPSC koloni efter avlägsnande av den omgivande fibroblast skiktet. (D) Korrekt omprogrammerade hiPSC kolonier identifieras genom levande färgning med Tra-1-81 ytmarkör antikropp, skärs med en steril nål (E, F) och överfördes till separata brunnar i en 24-brunnsplatta.

Figur 3. Expression av de pluripotensbestämmande specifika markörer Oct3 / 4, NANOG, Sox2, SSEA4 och Tra-1-60 i hiPSCs bestämdes genom immunocytokemi.

Discussion

Studiet av människans sjukdomar, särskilt neurologiska och neurodegenerativa, har speciellt utmanande på grund av otillgänglighet tillräckliga mänskliga cellulära modeller. Förmågan att programmera lätt erhållbara somatiska celler in inducerade pluripotenta stamceller och potentialen för att särskilja dem i olika celltyper öppnas en möjlighet att skapa cellulära modeller av genetiska sjukdomar. Dessutom iPSCs hålla en mycket lovande i framtiden regenerativ medicin. Därför är det viktigt att utveckla och optimera pålitliga, effektiva och säkra metoder för omprogrammering somatiska celler pluripotens.

Ur terapeutiska tillämpningar är det viktigt att utveckla säkra metoder för IPSC generation saknar fotavtryck mutationer i värdgenomet. Metoder för somatisk cell omprogrammering utan att introducera permanenta förändringar i genomet i omprogrammerade celler såsom transfektion av episomala vektorer, användning av punktskattepliktiga transposons och adenoviral infektion, och direkt leverans av mRNA eller protein har redan etablerats ^11-15. Hittills omprogrammering effektiviteten med hjälp av dessa transgen-fria metoder är låg och beror på karaktär, typ och ålder omprogrammerade somatiska celler. Därför är dessa protokoll är inte lämpliga för omprogrammering sent passage, deponeras vuxna somatiska celler ofta i cell förråd. Dessutom, för att möjliggöra detaljerad beskrivning av flera IPSC linjer och att etablera nya modeller av mänskliga sjukdomar och för att genomföra hög kapacitet läkemedel skärmar, omprogrammering av somatiska celler genom att använda viral leverans av transkriptionsfaktorer är en lämplig strategi. Hittills har mer än 20 studier rapporterade generation av patient-specifika iPSCs till modell mänskliga neurologiska och neuromuskulära sjukdomar. I alla utom en fallen iPSCs genererades med användning av lentiviralt eller retroviral transduktion ^16.

Våra data visar att ett enkelt protokoll baserat på the retrovirala avgivning av OSKM transkriptionsfaktorer kan användas för att effektivt omprogrammera adulta humana fibroblaster, även om en hög passagen. Mängden virus som erhållits från en enda transfektion av Phoenix celler på 10 cm platta är tillräcklig för mer än 10 omprogrammering experiment. Det finns tre viktiga steg i vår omprogrammering protokollet för vuxna fibroblaster: (i) högeffektiv viral transduktion underlättas av en extra centrifugering steg under transduktion som dramatiskt ökar effektiviteten i transduktionen, (ii) såddtäthet av den omvandlade fibroblast på MEF och ( iii) användning av levande färgning med Tra-1-81 markör antikropp för att underlätta val av potentiellt fullt omprogrammerade kolonier som direkt kan överföras till mataren-fria kulturer. Effektiviteten av omprogrammering är signifikant förbättras genom användning av natriumbutyrat under andra veckan av den omprogrammering. Dessutom noterade vi att en större andel av de IPSC kolonierna odlas inärvaro av drogen kan utökas och fastställas till helt omprogrammerade IPSC linjer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
DMEM/F12	Invitrogen	11330
KSR	Invitrogen	10828
Non-essential aminoacids	Invitrogen	11140
Sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887
Y27632	Stemgent	04-0012
bFGF	Stemgent	03-0002
Tra-1-81 antibody	Stemgent	09-0069
Oct3/4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-8628
Nanog antibody	Cell Signaling Technology	4903S
Tra-1-60 antibody	EMD Millipore	MAB4360
Sox2 antibody	Cell Signaling Technology	3579S
SSEA4	EMD Millipore	MAB4304
CF1 MEFs	Globalstem	GSC-6201G
Objective marker	Nikon Instruments	MBW10010
Matrigel	BD Biosciences	354277
mTeSR1	Stem Cell Technologies	05850
β-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Fugene 6	Roche Group	11814443001
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Object marker	Nikon Instruments	MBW10010