Summary
Клетки играют важную и все возрастающую роль в научных исследованиях, и открытие и разработку новых методов лечения. При этом растущая потребность в большем количестве клеток нам необходимо более эффективное и эффективные способы для выращивания и сбора урожая привязанности зависимые ячейки. Многослойные колбу с правом особенности могут служить этой цели.
Abstract
Все большее число клеточных приложения требуют большого количества клеток. Использование одного слоя T-колб, которые являются адекватными во время мелкие расширения, может стать громоздким, трудоемким и длительным, когда большое количество клеток не требуется. Чтобы удовлетворить эту потребность, производительность новой многослойной судна культуры клеток для облегчения расширения клеток из одного слоистого T-колб будет обсуждаться. Колбы испытания доступны в 3 - и 5-слойная формат и включить культуру и полное восстановление три и пять раз превышает число клеток, соответственно, по сравнению с Т-175 флаконов. Ключевой особенностью BD Multi-колбе смесь / уравновешивания порт, который позволяет быстро, в-сосуд смешивания, а также равномерное распределение клеток и реагентов внутри и между слоями каждое судно и постоянно производить клетки, которые можно культивировать в среде, которая сравнимо с Т-175 флаконов.
Дизайн этих Multi-Колбы также позволяет сonvenient доступ пипетки для добавления реагентов и клеток непосредственно в колбах, а также эффективное восстановление ценных клеток и реагентов и уменьшает риск загрязнения в результате заливки. Для приложений, где проливной предпочтительнее, чем пипетки, конструкция позволяет минимальной остаточной удержанию жидкости в целях снижения потерь ценных клеток и реагентов.
Protocol
1. Протокол использовать Multi-Колбы для клеточных культур
- Подготовка судов и добавлением суспензии клеток
- Подготовка средний рост клеток по мере необходимости.
- Выстроить Multi-Колба вертикально на боку с крышкой вверх на рабочую поверхность (стерильные ламинарном боксе).
- Эти колбы доступны в 3 и 5-слойная форматов и использования подобной работы-картины течения, как T-175 колбу.
- Ослабить и снять шапки. Добавить необходимое количество подогретого среды в колбе с использованием 50 или 100 мл пипетки или путем заливки.
- Пипетки, которые ≤ 10 мл может достигать дна сосуда, когда на нескольких Колбы помещают вертикально с крышкой вверх. Пипетки ≥ 10 мл может достигать в сосуд сразу прошлом логотип на Multi-колбу, тем самым обеспечивая удобный портал для добавления большего объема средств массовой информации для судна.
- Чтобы избежать пузырьков среды, позволяют поток жидкости на этвл вдоль внутренней стенки Multi-колбу крышкой (логотип стороне).
- Добавить клеточной суспензии из концентрированного фондовом клетки в питательной среде через верхний слой с помощью 10 мл пипетки и крышка фляги.
Советы:
- Транспорт на нескольких контейнерах на корзину на сайте инкубатора и выполнить оставшиеся шаги.
- Плотность клеток посева будет варьироваться в зависимости от типа клеток, средних и необходимости культуры продолжительности. Начните с плотностью посева и средств массовой информации объем, который используется в стандартной Т-175 колб и умножить на 3 или 5 в зависимости от Multi-Колба формат.
- Смешивание клеток
- Смешайте позицию: Держите Multi-Колба вертикально с логотипом к себе и повернуть против часовой стрелки, чтобы под углом 45 ° с микс порт к себе.
- Холдинг под тем же углом, слегка наклонять Multi-Колба спереди назад (шея от себя), пока жидкость в верхнем слое стоков полностью downwarDS через смесь порт. Pivot на смесь левого борта.
- Точно так же осторожно встряхнуть Multi-колбу от задней стенки к передней (шеи по направлению к вам), пока средний стоков полностью от нижнего слоя к вершине через смесь порт. Повторите шаги 1.2.2 и 1.2.3 еще раз, чтобы обеспечить надлежащее смешивание.
- Принесите Multi-колбу обратно смешать позицию (шаг 1.2.1) и перейдите к шагу 1,3
- Кроме того, клеточная суспензия может быть подготовлен внешне от Multi-колбы и клеточной суспензии могут быть добавлены в сосуд с помощью пипетки или нежный заливки.
- Смешайте порт позволяет в сосуд смешивания клеток со средствами массовой информации и избавляет от необходимости делать большие объемы клеточные суспензии, внешне.
- Она также позволяет СМИ выравнивания поперек слоев Multi-Колба
- Уравновешивание жидкости
- После смешивания / добавление суспензии клеток, место Multi-Колба вертикально на ровную рабочую поверхность для выравнивания объема жидкости уравнениеlly во всех слоях.
- Раздела жидкость в каждом слое
- Держите Multi-Фляга с логотипом к себе и повернуть по часовой стрелке на 45 градусов для разделения жидкости в каждом из слоев.
Совет:
- Для достижения наилучших результатов, важно использовать ровную рабочую поверхность для Шаги 1.3-1.4
- Держите Multi-Фляга с логотипом к себе и повернуть по часовой стрелке на 45 градусов для разделения жидкости в каждом из слоев.
- Транспорт
- После среды, содержащие суспензии клеток разбито, транспорт Multi-колбу, в то же углом 45 ° (по часовой стрелке), как в шаге 1.4.1 со средствами массовой информации от сочетания порта в инкубаторе. Эта позиция подходит также при извлечении колбы из инкубатора для просмотра на микроскоп.
- Размещение нескольких колбу на полке инкубатора
- Холдинг Multi-колбу на 45 ° (по часовой стрелке, вдали от микс-порт), осторожно поверните его горизонтально на поверхность инкубатора (с использованием углу от смеси портвращения). Положите Multi-колба с логотипом вверх.
- Сокол Multi-Колба конструкция позволяет судам для штабелирования и удерживает их на месте с помощью надежное штабелирование ребра.
- Холдинг Multi-колбу на 45 ° (по часовой стрелке, вдали от микс-порт), осторожно поверните его горизонтально на поверхность инкубатора (с использованием углу от смеси портвращения). Положите Multi-колба с логотипом вверх.
- Распределение клеток и реагенты
- После размещения Multi-Колба квартира на рабочую поверхность, аккуратно рок вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы распространять клетки равномерно на поверхности культуры, стараясь не пролить жидкость из каждого слоя. Стек колб.
- Это колба выполнена из оптически прозрачного материала и клеток на последний слой можно легко просматривать на микроскоп.
- После размещения Multi-Колба квартира на рабочую поверхность, аккуратно рок вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы распространять клетки равномерно на поверхности культуры, стараясь не пролить жидкость из каждого слоя. Стек колб.
- Медиа-обмен
- Аспирацию в то время как наклон Multi-Колба влево (смесь левого борта) с логотипом к себе.
- Затем наклон, Multi-Колба вправо, продолжая аспирации всех остаточных средств массовой информации.
- Добавить соответствующее количество средств массовой информации и выполните шаги 1.3-1.7
2.Сбор клетки Multi-Колбы
- Чтобы отделить клетки, выстраиваются на нескольких колб вертикально и принести каждому из них Mix позицию (шаг 1.2.1). Аккуратно инвертировать колбы с шеи к себе с тем чтобы средства массовой информации отводится в верхний слой Multi-Flask.
- Вставьте 5 или 10 мл аспирационных наконечник через шею, пока не достигнете уровня жидкости вблизи смесь порт. Аспирируйте исчерпаны среды.
- Добавить диссоциации реагента / промывочного буфера и довести до Mix позиции, как в шаге 1.2.1, а затем приступить и выполните шаги 1.3-1.7. Нейтрализовать со средним ростом / нейтрализующим агентом и залить клеточной суспензии в приемной трубки или инвертировать колбу так, что клетки стекать Верхний слой судна и собрать клетки с помощью 10 мл пипетки.
Совет: Для улучшения восстановления клеток или реагенты, довести Multi-Колба смешивать позицию (шаг 1.2.1), инвертировать с шеи по отношению к оператору, чтобы полный дренаж СМИ от др. л слоев для верхнего слоя. Затем наклоните Multi-колбу по часовой стрелке на 45 градусов (от сочетания порта), а Multi-Колба остается перевернутой. Используйте пипетку (1-10 мл), чтобы собрать все оставшиеся реактивы.
3. Рекомендуемый рабочий объем в Соколе Multi-Колбы
Рост средств массовой информации
3-слой: 75-150 мл на Multi-Колба
5-слой: 125-250 мл на Multi-Колба
Диссоциация агент
3-слой: ≥ 15 мл на Multi-Колба
5-слоя: ≥ 25 мл на Multi-Колба
Совет: Начните со средним объемом используется в стандартных Т-175 колб и умножить на 3 или 5 раз в зависимости от Multi-Колба формате оценивается таким образом, чтобы мл на единицу площади поверхности остается той же.
4. Представитель Результаты:
1. Дизайн Сокол Multi-Колба
files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/>
. Рисунок 1: Multi-Колба судов культуре клеток доступны в 3 - и 5-слойная стекируемых формат для расширения масштабов предоставления клетки 525 и 875 см 2 площади поверхности роста, соответственно. Внесите доступа облегчает добавление и удаление клеток и реагентов в-и из сосуда. Наличие микс-порт позволяет быстро в сосуд смешивания и выравнивания СМИ во всех слоях Multi-Flask.
2. Сотовые Доходность использованием Multi-Колба:
Эти суда доступны в 3-слойный и 5-слойная форматов, которые соответствуют 3 и 5 раз площадь поверхности Т-175 флаконов. Соответственно, ≥ 3 и 5 раз (130 ± 6,8 х 10 6 и 218 ± 23,6 х 10 6 клеток, соответственно) число ВНК-21 (ребенок почек хомяка) клетки были выращены и оправился от Multi-Колба по сравнению с Т-175 колбы (43,2 ± 3,5 х 10 6 клеток; рис.2а). Сотовые урожайность унит площадь была эквивалентна в 3 - и 5-слойная Multi-Колбы и Т-175 контейнеров для ВНК-21, LNCaP (аденокарциномы предстательной железы человека линии клеток), Нер-G2 (линии клеток человека гепатокарциномы), ECOPACK 2-293 (человека линии клеток почек) культивировали в течение периода 48-96ч (рис.2б) в питательной среде (35 мл на слой) в соответствии с рекомендациями по мобильному поставщика (АТСС, Sigma и / или Clontech). Клетки были перечислены на автоматизированных Vi-CELL счетчик (1).
Рисунок 2А: три и в пять раз число ВНК-21 клетки были выращены и оправился от 3 - и 5-слойная Multi-Колбы по сравнению с Т-175 флаконов. Ожидаемая доходность определялась с помощью Средняя урожайность ячейки из-под контроля Т-175 колб, умноженному на три и в пять раз по 3 - и 5-слойная Multi-Колбы соответственно (п = 4 колб / формат).
3. Медиа распределения между слоями Multi-Колба
Сотовые культуральной среде (DMEM; Invitrogen) был добавлен в 5-слойной Multi-колбы (250 mL/5-layer судна) и разбивается на слои в соответствии с протоколом, описанных выше. Медиа распределение измерялось сверления отверстий в каждом слое и СМИ откачивается из отдельных слоев. Вес жидкости оправился от каждого слоя оказалось относительно равномерным от слоя к слою, как показано на рис 3. Они заключаются в следующем: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (г).
Рисунок 3. Равномерное распределение средств массовой информации в каждой из пяти слоев 5-слойной Multi-Flask. Среду клеточной культуры был добавлен в Multi-колбы (250 ml/5-layer судна), уравновешенной и разделена на отдельные слои. СМИ откачивается через отверстия, просверленные в отдельных пластов и переход жидкости вес был зафиксирован из каждого слоя (п = 6 колб).
4. Сотовые распределения между слоями Multi-Колба
Клетки могут быть добавлены и смешанной в пределах нескольких Flask. Мы моделировали распределение клеток между слоями Multi-Колба использованием бисера (10 мкм; PolySciences Inc) близки по размерам к клеткам. Бусы суспензии добавляют в Multi-Колба судна с помощью 10 мл пипетки через верхний слой и смешанные со средствами массовой информации в сосуде, как по убываниюribed в протоколе выше. Бусы распределение измерялось сверления отверстий в каждом слое и жидкости, содержащей бусинку суспензия откачивается из отдельных слоев. Бусы концентрации оправился от каждого слоя было зачитано от счетчика Coulter и зарегистрированы. Ниже приведены эквивалентные межуровневых бусинка распределений в 3-х слойные Multi-колбы (рис.4а). Микс-порт дает возможность равномерного распределения клеток и реагентов между Multi-Колба слоев.
Рисунок 4а: Bead распределения в каждой из трех слоев 3-слойный Multi-Flask. Подвески из бисера (3,6 х10 6 / мл) добавляют к среде разливали в Multi-колбы (шарик подвеска: медиа объем составляет 1:10, т.: т.) и смешанные, а затем равновесия и разделов действия, используя протокол, описанный. Бусы концентрации оправился от каждого слоя (перекачиваемой жидкости через отверстия, просверленные на каждом слое) было зачитано от Coulter графаэр и зарегистрированы. Ниже приведены эквивалентные межуровневых бусинка распределений в 3 - слой Multi-колбы (п = 5 колб)
Ниже приведены представитель образы Ecopack 2-293 окрашивания моделей клеток, выращенных на> 80% от слияния 3-х слойные Multi-Колбы в средствах массовой информации дополнены роста. Сотовые монослои фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым и мульти-Колба слои затем вырезать и отсканированные изображения (2). Обратите внимание, сотовые структурирование была однородной по всем слоям Multi-Колба (Fig.4B). Аналогичные результаты были получены с несколькими типами клеток оценивали (данные не представлены).
Рис 4B: Этот рисунок иллюстрирует однородные роста клеток между слоями Multi-колбы. Ecopack-2-293 клеток, выращенных на> 80% слияния в 3-х слойные Multi-Колбы и Т-175 были зафиксированы и окрашивали фиолетовый кристалл. Multi-Колба суда были вырезаны, и каждый окрашенный слой был отсканирован.
5 Подача воздуха в Multi-Flask.:
Анализ провел носитель с помощью BioProfile FLEX анализатор (3,4) (Nova биомедицинских) от EcoPack2-293 клетки культивировали в течение 96 часов не выявили различий в воздухе насыщение клеток, выращенных в 5-слойной Multi-Колбы по сравнению с Т-175 колб (81,03 ± 1,9 против 83,4 ± 5,8% окружающего O 2).
Рисунок 5: Air насыщения (% окружающего O 2) отработанного СМИ были одинаковыми в предварительно смешанных средств массовой информации из 5-слойной Multi-Колбы по сравнению с Т-175 флаконов. EcoPack2-293 клетки высевали при плотности 35000 клеток / см 2 и культивировали в течение 96 часов до анализа СМИ (п = 3 фляги).
Discussion
Данное исследование демонстрирует увеличение производительности, что Multi-Колба дизайн предлагает исследователям. Хотя важно следовать шаги, описанные выше, для достижения оптимальной производительности при использовании Multi-Колбы, Есть несколько важных шагов в этом протоколе, которые считаются наиболее существенными. К ним относятся (я) смешивание клеток и реагенты использованием смеси порт в сосуд (II) транспортировки Multi-колбу на 45 ° по часовой стрелке после перегородки жидкости в каждом из слоев (III), укладка Multi-Колба плоские разбиения на сообщение инкубатора.
Правильное использование Multi-колба приводит к производству однородной популяции клеток внутри каждого судна, которое культивировали в среде, которая сравнима с Т-175 колб (5). Эти суда предоставить 3 и 5 раз больше клеток в аналогичный след, как T-175 колбу. 3 и 5-слойная судна обеспечивает 525 и 875cm 2 роста области, соответственно, и предлагают как пространство и труда сavings для пользователей. Тканевой культуры Обработка поверхности сравнима с колбами стандартного что позволяет масштабов без необходимости повторной оптимизации существующих условиях культуры или ущерба для качества, однородности или производительность клеток (6, 7). Это также обеспечивает сопоставимость с ранее собранными данными. Эти суда могут быть также покрыта реагентов, таких как коллаген, фибронектин, поли-D-лизина предоставить специализированные субстратом для прикрепления, роста и дифференциации определенных типов клеток, таких как гепатоциты 8, 9 kertainocytes, стволовые клетки, выращенные в бессывороточной СМИ формулировках. Покрытие решения могут быть удалены с минимальной остаточной удержанию жидкости в целях снижения потерь ценных реагентов, а также эффективное удаление раствор для покрытия до культивирования клеток. Рекомендуется оптимальный объем средств массовой информации к культуре клеток в нескольких колб от 0.142-0.287 мл / см 2, которые переводят на 25-50 мл на один слой. В отличие от другого многослойные колбу, тсвой продукт предлагает микс-порт судно, которое позволяет быстро, в-сосуд смешивания, а также равномерное распределение клеток и реагентов внутри и между слоями каждого судна. Разнообразные клеточные линии, первичных культур и стволовые клетки были расширены эффективного использования Multi-колбы. Эти сосуды особенно выгодно в приложениях, требующих большого количества клеток, например, в высокой пропускной способности отбор, производство вакцин, вирусной трансфекции вектора и клеточной терапии.
Экономия времени, пространства, труда и снижение отходов являются ключевыми выигрыш Multi-Колба по сравнению с обычными культурами в однослойных сосудах. Мы можем культуры примерно в три раза превышает число клеток, полученных из 5, Т-175 колб в том же пространстве, используя 3, 5-слоя Multi-колбы. Это преимущество в экономии пространства, не ограничивается только на Т-175, но может быть распространено и на другие суда: стандартный аппарат бутылки ролик, который вписывается в общие лабораторные инкубаторы домов ~ 4 ROLлер бутылки (2200 мл), каждый из которых обеспечивает 850cm 2 площади поверхности. В этом же районе, ~ 20, 5-слойной Multi-Колбы могут быть размещены таким образом обеспечивая пятикратный рост поверхности к культуре клеток. Кроме того, с увеличением "Go-зеленой" общественности, что позволит уменьшить образование отходов является весьма желательным. В этом отношении, есть 38% (5, Т-175 колб весом ~ 640G в то время как один, 5-слойной Multi-Колба весит ~ 400 г) уменьшение образования отходов использованием Multi-Колбы по сравнению с Т-175 колб и эти преимущества ведут к снижению хранения и захоронения отходов затрат и привести к экономии средств для пользователя.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками Becton Dickinson, Biosciences сегмента, Discovery лабораторные группы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-layer Tissue Culture-treated 525cm2 | BD Biosciences | 353143 | |
| 5-layer Tissue Culture-treated 875cm2 | BD Biosciences | 353144 | |
| 100ml pipette | BD Biosciences | 357600 | |
| 10 ml pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml aspirating pipette | BD Biosciences | 357501 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| T-175 flask Tissue Culture-treated | BD Biosciences | 353028 | |
| Gram Crystal Violet | BD Biosciences | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| Fetal Bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma-Aldrich | T8159 | |
| BHK-21 cells | Sigma-Aldrich | 85011433 | |
| Hep-G2, LnCAP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech Laboratories | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polystyrene Bead | Polysciences, Inc. | 24628-20 | |
| Bio-Profile Flex Analyzer | Nova BioMedical |
References
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).
- Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).
- Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).
- Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
- Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).
- Flaherty, P. Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).
- Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).
- Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303-2303 (2002).
