Transretinal ERG Opptak fra Mouse Retina: Rod og Cone Photoresponses

Summary

Vi beskriver en relativt enkel metode for transretinal elektroretinogrammet (ERG) opptak for å få stang og kjegle photoresponses fra intakt mus netthinnen. Denne tilnærmingen tar nytte av blokken av synaptiske overføring fra fotoreseptorene å isolere sine lette svar og ta dem med i felten elektroder plassert over den isolerte flat-montert netthinnen.

Abstract

Det er to forskjellige klasser av image-forming fotoreseptorene i virveldyr netthinnen: stenger og kjegler. Stenger er i stand til å oppdage enkelte fotoner av lys, mens kjegler kontinuerlig drift i henhold til raskt skiftende skarpe lysforhold. Absorpsjon av lys ved stang-og membran-spesifikke visuelle pigmenter i de ytre deler av fotoreseptorene utløser en phototransduction kaskade som til slutt fører til nedleggelse av sykliske nukleotid-gated kanaler på plasmamembranen og celle hyperpolariseringen. Denne lys-indusert endring i membranen nåværende og potensielle kan registreres som en photoresponse, enten klassisk suging elektrode opptaksteknikk ^1,2 eller ved transretinal elektroretinogrammet opptak (ERG) fra isolerte netthinne med farmakologisk blokkerte postsynaptiske respons komponenter ^3-5. Den siste metoden tillater narkotika-tilgjengelige langvarige opptak fra mus fotoreseptorene og er spesielt nyttig for å oppnå stabile photoresponses from de knappe og skjøre mus kjegler. I tilfelle av kjegler, kan slike eksperimenter utføres både i mørke tilrettelagte forhold og følgende intens belysning som blekemidler i hovedsak all visuell pigment, til å overvåke prosessen med kjeglen fotosensitivitet utvinning i løpet av mørk tilpasning ^6,7. I denne videoen viser vi hvordan du utfører stang-og M / L-kjegle-drevet transretinal opptak fra mørk-tilpasset mus netthinnen. Rod opptak vil bli gjennomført ved hjelp av netthinnen av vill type (C57Bl / 6) mus. For enkelhets skyld vil kjegle opptak hentes fra genmodifisert stang transducin α-subenheten knockout (Tα ^{- / -)} mus som mangler stang signalering ^8.

Protocol

1. Å gjøre Elektroder

1. Forbered glass elektroder. Vei 120 mg agar og bland det i 10 ml destillert vann (endelig agar konsentrasjon 1,2%). Smelt agar løsningen i varmt vannbad. Fyll glasset kapillærer (vi bruker Word Presision Instrumenter TW100-4 kapillærer med følgende dimensjoner: lengde = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, og innvendig volum = 44 mL) med agar løsningen ved hjelp av plast sprøyte. Stivne i agar ved romtemperatur i 10 min. Dermed opp til ~ 200 kapillærene kan fylles (resten av agar blandingen kan oppbevares ved -4 ° C og gjenbrukes flere ganger).
2. Skjær kapillærer i halvdeler med en diamant kniv.
3. Bløtlegg de resulterende glass elektrodene i mus elektroden løsningen i minst 24 timer ved 4 ° C. Oppbevar elektrodene ved 4 ° C og bruke dem over en periode på 3-4 måneder.

2. Sette opp eksperimentet

1. Dark-tilpasse en mus over natten. Bruk vill type (for eksempel C57Bl / 6) mus til stang-drevet transretinal innspillinger og T alfa ^{- / -} mus mangler stang signalering ⁸ for kjegle transretinal opptak.
2. Forbered en L perfusjon løsning, 100 ml elektrode løsning, og 20 ml inkubasjon løsning (se nedenfor) og filtrere perfusjon løsningen gjennom en Millipore 0,45 mikrometer eller 0,22 mikrometer filter (valgfritt).
3. Kalibrer lyskilden (505-nm LED eller halogen pære optisk stimulator) med en fotometer plassert på flyet av netthinnen. Når det gjelder LED lyskilde, bruker en optisk diffuser for å oppnå lys ensartethet.
4. Klargjør perfusjon kammeret for eksperimentet (kammerkor konstruksjoner kan variere). Vår kammer er laget av 3 mm plexiglass, med en bunn laget av lokket på en liten plast petriskål, og har en aktiv perfusjon volum på ~ 400 mL (L = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm). Fyll den nederste elektroden plass i kammeret med elektroden løsning som inneholder 2 mm L-glutamat og 10 mM BaCl ₂. Ved hjelp av plastrør og et glass kapillar, lage en forbindelse mellom den løsningen i nedre elektrode plass (laget av plast slange kontakten festet til kammeret nederst) og elektroden holderen. Pass på at det ikke er noen bobler i elektroden, den kobler rør, eller elektrodeholder (purge løsningen ved hjelp plastsprøyte hvis nødvendig).
5. Monter opptaket kammer på scenen av mikroskopet (valgfritt: mikroskopet kan monteres på en anti-vibrasjon bord og skjermet innenfor en Faraday bur for å minimere mekanisk og elektromagnetisk støy). Koble den nedre elektroden holderen til positive headstage polen på differensial forsterkeren (f.eks Warner Instrumenter DP-311 forsterker). Center og justere kammer nedre elektroden åpning med stimulus lys flekk. Koble perfusjon linje til opptak kammer og slå perfusjon på.
6. Bubble perfusjon løsning med 95% O _2/5% CO _2, mens ruger den i 40 ° C watER bad. CO ₂ justerer pH av løsningen til 7,2. Løsningen renner fra flasken til innspillingen kammeret ved hjelp av tyngdekraften som går gjennom et keramisk motstand oppvarmingen til 36-37 ° C. For å redusere varmetapet, bør ovnen være plassert så nær innspillingen kammer som mulig, helst på scenen av mikroskop.
7. Med en strøm regulator justere strømningshastighet til ca 1 ml / min.
8. Koble den øvre elektroden til den andre (negativ) polen på headstage bruke en andre elektrode holder. Bind termoelementet sonde til øvre elektroden ved hjelp av en O-ring. Kontroller at elektroden og termoelement tips er nær hverandre slik at temperaturen blir tatt så nær sentrum av netthinnen som mulig. Dypp tuppen av øvre elektroden i perfusjon løsning og plassere den i midten av kammeret. Tillat 10-15 min for baseline stabilisering.
9. Juster DC spenning for varmeren slik at temperaturen i løsningen er 36 -37 ° C.

3. Isolere Mouse Retina

1. Under svakt rødt lys, avlive den mørke tilpasset mus med CO ₂ og cervical forvridning. Valgfritt: lage en referanse merke på hver mus øyeeplet ved cauterizing mest dorsal punktet på sclera med en elektrokirurgi penn eller oppvarmet dissekere pin. Alle påfølgende prosedyrer er utført under infrarødt lys ved hjelp av infrarøde bildet omformere passer til en dissekere mikroskop.
2. Skjær ut øynene med buede saks ved å bruke milde press og strekke huden på siden av hvert øye. Hemisect begge øyeepler henhold infrarød belysning ved hjelp microscissors eller et barberblad.
3. Fjern hornhinnen og linsen. Fjern så mye av glasslegemet som mulig.
4. Skrell første netthinnen fra pigment epitelet laget og, om nødvendig, rengjør den med tang for å fjerne gjenværende partikler av pigment epitelet. Vi er vanligvis bruker hele netthinnen for både stang og kjegle transretinal innspillinger. Men hvis du ønsker å spesifikt ta opp fra dorsal del av musen netthinnen som har mer M / L-kjegler ^9, før peeling netthinnen fjerne ventrale delen av eyecup med et barberblad eller microscissors bruke elektrokirurgi merket som en referanse.
5. Plasser andre hemisected øyeeplet i en liten petriskål med inkubasjonstid løsning og inkuber preparatet i en lys-tett boks mettet med rent oksygen inntil bruk. Vanligvis under disse forholdene den andre musen eyecup kan lagres i flere timer ved romtemperatur og brukes til innspillinger.
6. Bruk et glass eller plast pipette overføre den isolerte netthinnen til en dråpe perfusjons løsning (ca. 300 mL) på lokket av en petriskål. Legg 5-6 små dråper elektrode løsning som inneholder BaCl ₂ til pre-inkuber netthinnen med BaCl _to. Plasser en firkantet stykke (ca. 5x5 mm) av baksiden hjørne-smurt (vi bruker Dow Corning 111 ventil smøremiddel og tetningsmasse) Millipore filter papir (0,45 mikrometer Harg type) med pre-laget hull i midten (2 til 2,5 mm i diameter) til den samme løsningen dråpe. Bruk pinsett posisjon netthinnen på toppen av filteret papir (fotoreseptoren side opp) og trykk kantene på periferien til flat-montere den. Netthinnen skal være sentrert over åpningen i filteret papir.
7. Bruk pinsett overføre filteret papir med netthinnen til perfusjon kammeret og plassere den over stimulus spot-justert lavere elektroden plass. Litt trykker de smurte kantene av filteret papir å binde det sammen med kammeret.
8. Plasser øvre elektroden over netthinnen sentrum (litt røre fotoreseptoren lag). Sentrering øvre elektrode på netthinnen øker signal amplitude (opp til ~ 20-40% i forhold til å plassere den nærmere netthinnen kanten). Selv om slik elektrode plassering forvrenger litt effektiv lyset stimulus intensitet nå en liten sektor av netthinnen (~ 12-15% av sitt totale areal), er det fortsatt den optimale måte å plassere den elektrode. Preparatet er nå klar for transretinal opptak.

4. Transretinal Recordings

1. Avhengig musen linje, rekord stang eller M / L-kjegle-drevet test flash svar fra dim til lys intensitet av kalibrert 505 nm lys gitt fra LED lyskilde eller optisk stimulator. Ved vår LED lyskilde, vil blitsen intensiteten styres av en kombinasjon av datastyrt kontroll av LED inngangsspenningen, vendbar motstander, og et sett med nøytral tetthet filter (vi bruker E-farge # 211 0,9 ND film filtre fra Rosco Laboratories ) plassert mellom LED og netthinnen. Varigheten av LED test blits (20 ms) er kontrollert av en datamaskin. Hvis du bruker en halogen pære optisk stimulator, kan test flash intensitet og bølgelengde styres av et sett med nøytral tetthet filter og smale band interferens filtre, henholdsvis. Test flash varighet kan kontrolleres av datamaskinen-drevne skodder.
2. Valgfritt: for å opprettholde effektivundertrykkelse av glial komponenten av photoresponse med BaCl ₂ hele dagen, endre nedre elektroden løsningen innimellom (f.eks før testing hver netthinnen) ved sletting den med en plast sprøyte fylt med fersk løsning.

5. Representative Resultater

Løsninger

1. Mus netthinnen perfusjon løsning: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2.4 mM MgCl _2, 1,2 mM CaCl _2, 10 mm HEPES (pH 7,2), 20 mm NaHCO _3, 3 mm Na succinate og 0,5 mM Na glutamat, 0,02 mm EDTA, og 10 mm glukose. I tillegg er løsningen suppleres med 2 mm L-glutamat og 10 mm DL-AP-4 for å blokkere høyere ordens komponenter i photoresponse ^10,11, og med 0,1% MEM vitaminer og MEM ​​aminosyrer løsninger (Sigma) for å forbedre netthinnen levedyktighet.
2. Mus elektrode løsning: 140 mm NaCl, 3,6 mM KCl, 2.4 mM ₂ MgCl, 1,2 mm ₂ CaCl, 3 mm HEPES (pH 7,4, NaOH). Løsningen i nedre electrode plass også inneholder 2 mm L-glutamat å blokkere den synaptiske overføring ^10, og i tillegg til 10 mm BaCl ₂ undertrykke glial komponenten av photoresponse ^3,12.
3. Retina inkubasjon løsning: Løs 272 mg L-15 medium (Sigma) og 20 mg BSA i 20 ml avionisert vann. Endelig L-15 og BSA konsentrasjoner er 13,6 mg / ml og 1 mg / ml, henholdsvis. Juster pH til 7,4 med 1 M HCl.

Figur 1. Prinsippskisse som viser isoleringen av musen netthinnen for transretinal ERG opptak.

Figur 2. Fotografi av perfusjons kammer og opptak elektroder med sine eiere. Røde piler viser retningen perfusjon flyt.

Figur 3. Skjematisk diagram av den eksperimentelle oppsett for transretinal ERG opptak. Røde piler viser retningen perfusjon flyt.

. Figur 4 Representative resultater: innspilt familie av mus stang-drevet transretinal svar. Photoresponses var lav-pass filtrert ved 30 Hz (8-pol Bessel), digitalisert ved 1 kHz og lagret på en datamaskin for videre analyse. Vist spor representerer gjennomsnitt av 5-6 responser ved svakt lys intensitet og 2-3 responser ved mette lysintensitet.

Figur 5 Representative resultater:. Innspilt familie av mus kjegle-drevet transretinal svar. Photoresponses var lav-pass filtrert ved 30 Hz (8-pol Bessel), digitalisert ved 1 kHz og lagret på en datamaskin for videre analyse. Vist spor er averages på 5-10 responser ved svakt lys intensitet og 3-5 responser ved mette lysintensitet.

Discussion

Metoden for stang-og membran-drevet transretinal ERG opptak beskrevet ovenfor blir et kraftig verktøy for å undersøke funksjonen av mus fotoreseptorene både villtype og genmodifiserte dyr. I tillegg til enkel karakterisering av grunnleggende photoresponse egenskaper, gir denne enkle teknikken god respons stabilitet under langvarige eksperimenter utført på nært til intakte netthinnen preparater. Både mørk-tilpasset stang maksimal respons amplitude og fotosensitivitet i villtype mus er stabile innen minst 1t fra begynnelsen av innspillinger, og den mørke tilpasset kjegle maksimal amplitude og fotosensitivitet vanligvis ikke falle mer enn 10% etter 30-40 min av innspillinger. Andre fordeler med denne teknikken er dens amenability til enkle farmakologiske manipulasjoner som er uoppnåelig i klassiske encellede sugekopper opptak fra mus fotoreseptorene, og fraværet av anestesi, nødvendig for å utføre levende dyr ERG rekordninger. Bruke netthinne av Tα ^{- / -} mus linje med eliminert stang signalering ⁸ for kjegle transretinal opptak muliggjør betydelig både eksperimentelle prosedyrer og tolkning av resultatene. Dette er spesielt viktig i eksperimenter som tar sikte på å overvåke mus kjegle visuell pigment foryngelse etter eksponering for sterkt lys og / eller studere membran funksjon i nærvær av stødig bakgrunn lys. Dermed blir nye spennende perspektiver nå åpner for å undersøke fysiologiske egenskapene til mus stenger og kjegler inkludert musemodeller for stang-og membran-relaterte synsforstyrrelser.