Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses

Summary

Se describe un método relativamente simple de transretinal electrorretinograma (ERG) para la obtención de grabaciones photoresponses conos y bastones de la retina del ratón intacto. Este enfoque se aprovecha del bloque de la transmisión sináptica de fotorreceptores para aislar sus respuestas de luz y grabar usando electrodos colocados sobre el terreno a través de la aislada plana montada en la retina.

Abstract

Hay dos clases distintas de formación de la imagen-los fotorreceptores de la retina de los vertebrados: los bastones y conos. Los bastones son capaces de detectar fotones individuales de luz, mientras que los conos de funcionar de forma continua en las cambiantes condiciones de luz brillante. La absorción de luz por la A-Rod y específicos de cono pigmentos visuales en los segmentos externos de fotorreceptores desencadena una cascada de fototransducción que finalmente conduce al cierre de los nucleótidos cíclicos-bloqueados los canales de la membrana plasmática y la hiperpolarización de la célula. Este cambio inducido por la luz en la membrana de actuales y potenciales pueden ser registrados como una foto-, ya sea por ^1,2 de electrodos de aspiración clásica técnica de grabación o grabaciones transretinal electrorretinograma (ERG) de retinas aisladas con componentes farmacológicamente bloqueados respuesta postsináptica ^3-5. Este último método permite drogas accesibles duraderos grabaciones de fotorreceptores de ratón y es particularmente útil para obtener photoresponses estables from los conos de ratones escasos y frágiles. En el caso de los conos, estos experimentos se puede realizar tanto en las condiciones adaptados a la oscuridad y la iluminación intensa siguiente que blanquea prácticamente todos pigmento visual, para supervisar el proceso de recuperación de cono de fotosensibilidad en adaptación a la oscuridad ^6,7. En este video, vamos a mostrar cómo llevar a cabo de vara y M / L de cono-impulsadas por las grabaciones de transretinal adaptada a la oscuridad retina del ratón. Grabaciones Rod se llevó a cabo utilizando retina de tipo salvaje (C57BL / 6) ratones. Por simplicidad, las grabaciones de cono se obtendrá a partir modificado genéticamente varilla transducina α-subunidad extractor (Tα ^{- / -)} ratones que carecen de barra de señalización ^8.

Protocol

1. Haciendo electrodos

1. Preparar electrodos de vidrio. Pesar 120 mg de agar y se mezcla en 10 ml de agua destilada (concentración final de 1,2% de agar). Derretir la solución de agar en un baño de agua caliente. Llenar capilares de vidrio (que se usen instrumentos de Word Presision TW100-4 capilares con las siguientes dimensiones: longitud = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, y el volumen interno = 44 l) con la solución de agar con una jeringa de plástico. Solidificar el agar a temperatura ambiente durante 10 min. Así, hasta ~ 200 capilares puede ser llenado (el resto de la mezcla de agar puede ser almacenado a -4 ° C y reutilizados varias veces).
2. Cortar los capilares en mitades utilizando una cuchilla de diamante.
3. Remoje los electrodos de vidrio resultantes en solución ratón electrodo por lo menos 24 horas a 4 ° C. Almacenar los electrodos a 4 ° C y utilizarlos durante el período de 3-4 meses.

2. Configuración del experimento

1. Dark-adaptación de un ratón durante la noche. El uso de tipo salvaje (por ejemplo, C57Bl / 6) para los ratones varilla impulsadas grabaciones transretinal y alfa T ^{- / -} ratones que carecen de barra de señalización de ⁸ para las grabaciones de cono transretinal.
2. Preparar una solución de perfusión L, 100 ml de solución electrodo, y 20 ml solución de incubación (véase más adelante) y filtrar la solución a través de perfusión un Millipore 0,45 micras o 0,22 micras filtro (opcional).
3. Calibrar la fuente de luz (505 nm LED o estimulador bombilla halógena óptico) utilizando un fotómetro colocado en el plano de la retina. En el caso de fuente de luz LED, utilizar un difusor óptico para conseguir una uniformidad de luz.
4. Prepare la cámara de perfusión para el experimento (construcciones de la cámara puede variar). Nuestra cámara está hecho de plexiglás 3 mm, con una parte inferior hecha de la tapa de un pequeño plato de Petri de plástico, y tiene un volumen de perfusión activa de ~ 400 l (l = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm). Llenar el espacio electrodo inferior de la cámara con una solución de electrodo que contiene 2 mM de L-glutamato y 10 mM de BaCl ₂. Usando un tubo de plástico y de vidrio un capilar, realizar una conexión entre la solución en el espacio electrodo inferior (hecho de conector de tubo de plástico unido a la parte inferior de la cámara) y el soporte del electrodo. Asegúrese de que no hay burbujas en el electrodo, los tubos de conexión, o el titular de electrodo (purgar la solución con la jeringa de plástico si es necesario).
5. Montar la cámara de grabación en la platina del microscopio (opcional: el microscopio puede ser montado en una mesa anti-vibración y protegido dentro de una jaula de Faraday para minimizar el ruido mecánico y electromagnético). Conectar el soporte de electrodo inferior al polo positivo cabezal de la platina del amplificador diferencial (por ejemplo, Warner Instrumentos DP-311 amplificador). Centro y alinear el electrodo de la cámara baja la apertura de los puntos de luz de estímulo. Conecte la línea de perfusión a la cámara de grabación y gire a la perfusión en el.
6. Burbuja de la perfusión de solución con 95% de O _2/5% CO _2, mientras que la incubación de 40 ° C water baño. CO ₂ ajusta el pH de la solución a 7,2. La solución fluye desde la botella a la cámara de grabación por la gravedad que pasa a través de una resistencia cerámica recalentar a 36-37 ° C. Para reducir la pérdida de calor, el calentador debe estar situada lo más cerca de la cámara de grabación como sea posible, idealmente en la platina del microscopio.
7. Con un regulador de flujo ajustar la velocidad de flujo a aproximadamente 1 ml / min.
8. Conectar el electrodo superior a la segunda (negativo) polo de la cabezal de la platina utilizando un soporte de electrodo segundos. Obligar a la sonda del termopar al electrodo superior mediante una junta tórica. Asegurarse de que las puntas de los electrodos y el termopar están muy juntas de modo que la lectura de la temperatura se toma como cerca del centro de la retina como sea posible. Sumergir la punta del electrodo superior en la solución de perfusión y lo coloca en el centro de la cámara. Permitir 10-15 minutos para la estabilización de referencia.
9. Ajustar la tensión de CC para el calentador de manera que la temperatura de la solución es 36 -37 ° C.

3. Aislamiento de la retina del ratón

1. Bajo una luz roja tenue, la eutanasia el ratón adaptado a la oscuridad con CO ₂ y la dislocación cervical. Opcional: hacer una marca de referencia en cada ojo del ratón mediante la cauterización, el punto más dorsal de la esclerótica con una pluma de cauterio o pines climatizada de disección. Todos los procedimientos posteriores se realizan bajo la luz infrarroja usando convertidores de imagen infrarroja de ajuste a un microscopio de disección.
2. Diseccionar los ojos con tijeras curvas, aplicando una presión suave y estiramiento de la piel a los lados de cada ojo. Hemisect ambos ojos bajo iluminación infrarroja usando microtijeras o una hoja de afeitar.
3. Retire la córnea y el cristalino. Eliminar la mayor cantidad de vítreo como sea posible.
4. Pelar la retina primero desde la capa de epitelio de pigmento y, si es necesario, es importante limpiarlo con pinzas para eliminar gránulos restantes de epitelio de pigmento. Estamos típicamente usando retina completa tanto para la varilla y transret conograbaciones Inal. Sin embargo, si desea grabar en concreto de la parte dorsal de la retina del ratón que tiene más de M / ^L-9 conos, antes de pelar la retina quitar la parte ventral de la ojera con una hoja de afeitar o microtijeras uso de la marca cauterio como una referencia.
5. Coloque el globo ocular hemiseccionaron segundos en una pequeña placa de Petri con solución de incubación y se incuba la preparación en una caja hermética a la luz saturada con oxígeno puro hasta su uso. Normalmente, en estas condiciones la copa ocular segundo ratón se pueden almacenar durante varias horas a temperatura ambiente y se utiliza para las grabaciones.
6. Utilizando una pipeta de plástico o vidrio transferir la retina aislada a una gota de solución de perfusión (ca. 300 l) en la tapa de una placa de Petri. Añadir 5-6 gotas de solución de electrodos que contienen BaCl ₂ al pre-incubar la retina con BaCl _2. Coloque un pedazo cuadrado (5x5 mm CA) de la parte de atrás de esquina engrasado (se utiliza el lubricante Dow Corning 111 de la válvula y sellador) Millipore filtro de papel (0,45 micras HARG tipo) con pre-hecho agujero en su centro (2-2,5 mm de diámetro) a la solución gota mismo. Utilizando posición fórceps la retina en la parte superior del papel de filtro (lado fotorreceptor arriba) y presione sus bordes en la periferia a plana montarla. La retina debe estar centrada sobre la abertura en el papel de filtro.
7. Con unas pinzas transferir el papel de filtro con la retina de la cámara de perfusión y colocarlo por encima del punto de estímulo-alineados espacio inferior del electrodo. Presione ligeramente los bordes engrasadas de papel de filtro para unir con la cámara.
8. Coloque el electrodo superior sobre el centro de la retina (ligeramente tocar la capa de fotorreceptores). Centrado el electrodo superior en la retina aumenta la amplitud de la señal (hasta ~ 20-40% en comparación con colocarlo más cerca del borde retina). Aunque la localización del electrodo distorsiona ligeramente la intensidad de la luz estímulo eficaz de llegar a un pequeño sector de la retina (~ 12-15% de su superficie total), sigue siendo la mejor forma de colocar el electrodoatropelló. La preparación está ahora listo para las grabaciones transretinal.

4. Grabaciones Transretinal

1. Dependiendo de su línea de ratones, registro de varilla o M / L de cono-impulsadas por las respuestas de destello de prueba desde tenue hasta la intensidad luminosa de la luz calibrada 505 nm siempre de la fuente de luz LED o estimulador óptico. En el caso de nuestra fuente de luz LED, la intensidad del flash se controla mediante una combinación de control computarizado de tensión de entrada de LED, resistencias conmutables, y un conjunto de filtros de densidad neutra (usamos E-Colour # 211 0,9 filtros ND de cine de Rosco Laboratories ) colocado entre el LED y la retina. La duración de la prueba de flash LED (20 ms) es controlado por un ordenador. Si se utiliza un estimulador bombilla halógena óptico, la intensidad de prueba flash y longitud de onda puede ser controlado por un conjunto de filtros de densidad neutra y estrechos filtros de interferencia de banda, respectivamente. Prueba de duración del flash pueden ser controlados por ordenador basadas en persianas.
2. Opcional: para mantener la eficienciala supresión del componente glial de la foto-con BaCl ₂ durante todo el día, cambiar la solución de electrodo inferior de vez en cuando (por ejemplo, antes de la prueba cada retina) por una purga con una jeringa de plástico llena con solución fresca.

5. Los resultados representativos

Soluciones

1. Retina del ratón perfusión solución: 112,5 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM de MgCl _2, 1,2 mM de CaCl _2, HEPES 10 mM (pH 7,2), 20 mM NaHCO _3, 3 mM de Na succinato, 0,5 mM de Na glutamato, 0,02 mM EDTA, y 10 mM de glucosa. Además, la solución se complementa con 2 mM de L-glutamato y 10 mM de DL-AP-4 para bloquear componentes de mayor orden de la fotorrespuesta ^10,11, y con MEM 0,1% vitaminas y soluciones MEM aminoácidos (Sigma) para mejorar la retina viabilidad.
2. Ratón solución electrodo: 140 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM de MgCl _2, 1,2 mM de CaCl _2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). La solución en el menor elementoespacio ctrode también contiene 2 mM de L-glutamato para bloquear la transmisión sináptica ¹⁰ y, además, 10 mM de BaCl ₂ para suprimir el componente glial de la fotorrespuesta ^3,12.
3. Retina solución de incubación: se disuelven 272 mg de medio L-15 (Sigma) y 20 mg de BSA en 20 ml de agua desionizada. Final L-15 y las concentraciones de BSA son 13,6 mg / ml y 1 mg / ml, respectivamente. Ajustar el pH a 7,4 con HCl 1 M.

Figura 1. Diagrama esquemático que muestra el aislamiento de la retina del ratón para transretinal grabaciones ERG.

Figura 2. Fotografía de la cámara de perfusión y de electrodos de registro con sus titulares. Las flechas rojas indican la dirección del flujo de perfusión.

Figura 3. Esquema del montaje experimental para la transretinal grabaciones del ERG. Las flechas rojas indican la dirección del flujo de perfusión.

Figura 4 resultados representativos:. Registrado familia de ratón la barra impulsadas por las respuestas transretinal. Photoresponses fueron filtrada de paso bajo a 30 Hz (8-Bessel), digitaliza a 1 kHz y almacenadas en un ordenador para su posterior análisis. Trazos mostrados corresponden a las medias de las respuestas de 5-6 a intensidades de luz tenue y las respuestas de 2-3 en la intensidad de luz de saturación.

Figura 5: Los resultados representativos. Familia registrada de ratón de cono impulsadas por las respuestas transretinal. Photoresponses fueron filtrada de paso bajo a 30 Hz (8-Bessel), digitaliza a 1 kHz y almacenadas en un ordenador para su posterior análisis. Trazas se muestran en la AVERAGes de las respuestas de 5-10 a intensidades de luz tenue y las respuestas de 3-5 en la intensidad de luz de saturación.

Discussion

El método de los bastones, los conos y las grabaciones basadas en transretinal-ERG se ha descrito anteriormente se está convirtiendo en una poderosa herramienta para la investigación de la función de los fotorreceptores de ratón en el tipo salvaje y animales modificados genéticamente. Además de la caracterización de las propiedades de fácil fotorrespuesta básicos, esta técnica simple proporciona estabilidad durante gran respuesta de larga duración experimentos realizados en preparaciones retina cercana al intactas. Tanto adaptado a la oscuridad amplitud de la barra respuesta máxima y fotosensibilidad en ratones de tipo salvaje son estables dentro de al menos 1 hora desde el comienzo de grabaciones, y la amplitud del cono adaptado a la oscuridad máxima y fotosensibilidad típicamente no disminuyen más del 10% después de 30-40 minutos de grabaciones. Otras ventajas de esta técnica son su susceptibilidad a las fáciles las manipulaciones farmacológicas que es inalcanzable en las grabaciones clásicas de succión de una sola célula de fotorreceptores de ratón, y la ausencia de la anestesia, se requiere para la realización de los animales vivos de registro ERGreuniones. Uso de las retinas de Tα ^{- / -} línea de ratones con la varilla de señalización eliminado ⁸ para cono grabaciones transretinal facilita sustancialmente tanto los procedimientos experimentales y la interpretación de los resultados. Esto es particularmente importante en los experimentos dirigidos a controlar ratón regeneración cono pigmento visual después de la exposición a la iluminación brillante y / o el estudio de la función de cono en la presencia de la luz de fondo estable. Por lo tanto, nuevas perspectivas interesantes se están abriendo para la investigación de las propiedades fisiológicas de las barras y los conos de ratones, incluyendo los modelos de ratón para los trastornos visuales de caña y relacionados cono.