Summary
Droplet מבוססי פלטפורמות microfluidic הם המועמדים המבטיחים לניסויים תפוקה גבוהה שכן הם מסוגלים להפיק, picoliter עצמית מידור כלי ובזול בשיעורים קילוהרץ. באמצעות שילוב עם מהירות, רגישות גבוהה שיטות ספקטרוסקופיות ברזולוציה פלואורסצנטי, כמויות גדולות של מידע שנוצר בתוך מערכות אלה ניתן לחלץ ביעילות, לרתום ולנצל אותו.
Abstract
הפיתוח של פלטפורמות microfluidic לביצוע כימיה וביולוגיה יש במידה רבה היתה מונעת על ידי מגוון של היתרונות הפוטנציאליים הנלווים מזעור המערכת. היתרונות כוללים את היכולת ביעילות תהליך ננו כדי femoto ליטר כרכים של מדגם, שילוב קליל של רכיבים פונקציונליים, נטייה פנימית כלפי ריבוב בקנה מידה גדול, התפוקה אנליטי משופר, שליטה משופרת ועקבות אינסטרומנטלי מופחת. 1
בשנים האחרונות עניין רב יש התמקדו בפיתוח של אגל מבוססי (או זרם מקוטע) מערכות microfluidic ואת הפוטנציאל שלהם כפי פלטפורמות בניסויים תפוקה גבוהה. 2-4 הנה מים ב-תחליב שמן נעשים באופן ספונטני טופס ערוצי microfluidic כתוצאה של אי יציבות נימי בין שני שלבים immiscible. חשוב לציין, microdroplets כרכים ויצירות הגדיר במדויק יכול להיות שנוצר בתדירויותשל כמה קילוהרץ. יתר על כן, על ידי encapsulating ריאגנטים עניין בתוך תאים בודדים מופרדים בשלב immiscible רציפה, הן מדגם צולבות לדבר פיזור (דיפוזיה ו טיילור מבוסס) ניתן למנוע, מה שמוביל זיהום צולבות מינימלית ויכולת הזמן תהליכים אנליטיים בדייקנות רבה. בנוסף, מאחר ואין קשר בין התוכן של הטיפות ואת הקירות ערוץ (אשר הרטובות על ידי השלב מתמשך) ספיגה ואובדן ריאגנטים על קירות הערוץ נמנע.
לאחר טיפות מסוג זה נוצרו ומעובדים, יש צורך לחלץ את המידע הנדרש אנליטית. מבחינה זו, שיטת הזיהוי של הבחירה צריכה להיות מהירה, לספק רגישות גבוהה ומגבילה נמוך של גילוי, לחול על מגוון של מינים מולקולרית, להיות הרסני ולהיות מסוגלים להיות משולב עם התקנים microfluidic באופן קליל. כדי לענות על צורך זה פיתחנו כמוuite של כלים ניסיוניים פרוטוקולים המאפשרים הפקת כמויות גדולות של מידע photophysical מ קטן בנפח סביבות, ואת החלות על ניתוח של מגוון רחב של פרמטרים פיזיים כימיים וביולוגיים. להלן שתי דוגמאות של שיטות אלה מוצגים ליישם זיהוי של תאים בודדים ועל מיפוי של תהליכי ערבוב בתוך picoliter נפח טיפות. אנו מדווחים על תהליך הניסוי כולו כולל ייצור שבב microfluidic, ההגדרה אופטיים בתהליך של הדור אגל וזיהוי.
Protocol
1. ייצור שבב
- SU8 מאסטר ייצור.
כדי להשיג ערוצי microfluidic בגובה 40 מיקרומטר, מעיל ספין SU8-50 (MicroChem קורפ) על פרוסות סיליקון Si בסל"ד 3000 למשך 30 s. לאפות רכה על צלחת חמה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ו - 95 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להתאדות ממס densify את הסרט. לאחר הרגעות, לחשוף SU8 להתנגד עם קרינה 360-440 ננומטר ב 300 mJ / 2 תחת מסכה המתאימה. בעקבות החשיפה, לאפות את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ו - 95 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. לאחר הקירור, לפתח את האזורים שלא נחשפו (EC Micrpoposit ממס, Chestech) במשך 5 דקות, עם ערבוב. 5 השתמש טרי EC ממס לשטוף את פרוסות ולאחר מכן לייבש אותו תחת גז כדי ליצור משטח נקי. פנקו את פרוסות שוטף עם הקסאן, מתנול. השלם את תהליך ייצור SU8 מאסטר בצעד הסופי של מתאדים trichloro (1,1,2,2-perfluoocytl) silane על פני השטח (בתוך תא ייבוש במשך 40 דקות). - PDMS curing, חיתוך ו-ניקוב חור.
כדי ליצור מצעים microfluidic מובנים, אנו לערבב Sylgard 184 (Dow Corning) ביחס (w / w) 10:01 של שרף crosslinker ואז לשפוך על המאסטר. דגה בתוך תא ייבוש, ואז לרפא את המכשיר (השכבה העליונה) למשך שעה אחת ב 65 ° C. חותכים את PDMS נרפא לקלף אותו המאסטר. יצירת חורים גישה צינורות fluidic באמצעות אגרוף ביופסיה. Cure שכבה נוספת של PDMS (8 גרם של שרף להתפשט באופן שווה בתוך צלחת פטרי 10x10 ס"מ) במשך 20 דקות בטמפרטורה 65 ° C. מניחים את השכבה העליונה מוכן על השכבה התחתונה ואז לרפא לילה בשעה 65 ° C. קולפים את שבבי מצלחת פטרי קוביות לשימוש.
2. ניסיוני ההתקנה
- Microfluidic ההתקנה
- מלא מזרקים (פלסטיק או זכוכית Beckton, דיקינסון החברה או SGE אנליטית המדע) עם הפתרונות הנדרשים, כדי להבטיח שלא יישארו בועות אוויר בכל חלקי צנרת. עבור הדור אגל בשני שלבים רגילים. מימית (מפוזר) phasדואר שמכיל את ריאגנטים עניין (למשל השעיה של תאים במדיום הגידול, או פתרון של fluorophores מולקולרית). השלב הנפט, אשר במקרה זה משמש בשלב רציף, נוצר בדרך כלל מתערובת של שמן פעילי שטח, למשל שטח RainDance 2% (RainDance טכנולוגיות) בשמן fluorinated (3M נוזלי Fluorinert אלקטרונית FC-40), או 2% טווח 80 (Croda) בשמן מינרלי.
- Fit צינורות (צינורות פוליאתילן, הרווארד Apparatus) בקוטר פנימי זהה מחט מזרק טיפים על קצה אחד של המחטים. צינורות יש לחתוך לאורך הקצר ביותר האפשרי כדי למזער את אי יציבות עקב הפרעות בזרימת הרטט.
- חברו את הקצוות האחרים של צינורות ישירות החורים אגרוף המצע PDMS. פתרונות מורכבים יותר, כגון שימוש יציאות סיליקה נימי או מחברים (למשל Nanoports אפצ'רץ') יכול גם להיות מיושמת עבור ממשק חזק יותר בין המכשיר microfluidic ואת צינורות. חברו את שקעהנמל של השבב כדי צינורות ישיר לתוך אספן (לאיסוף פסולת או עיבוד אנליטי נוסף).
- הר מזרקים על משאבת מזרק (למשל PHD 4400 משאבות מזרק Hpsi לתכנות, הרווארד Apparatus) ולהגדיר את יציקת הרצוי זרימה שיעור עבור כל שלב (בדרך כלל בסדר גודל של מיקרוליטר לדקה). יחס מינימלי של שמן / מימית זרימה שיעורי 1 מומלץ להימנע הרטבה של PDMS על ידי השלב מימית, אשר יוביל להיווצרות טיפה לא יציב (תלוי במכשיר הגיאומטריה). מאותה סיבה, מומלץ גם לשטוף קודם את השלב שמן לבד, באמצעות כל ערוצי microfluidic, לפני המבוא של השלב מימית. ההגדרה הסופית המשמש במסמך הניסויים ממחישה איור 2a.
- מערכת אופטית התקנה
- כדי לחקור כמויות קטנות (עד picoliters כמה) בתוך ערוצי microfluidic עם רזולוציה במרחב ובזמן גבוהה במיקרוסקופ confocal (עם אוטומטעורך קיבולת submicron מיקום).
- השתמש מסיסים במים מולקולות ניאון עם תשואות גבוהות באופן אידיאלי קוונטי. Excite מולקולות באמצעות הפעלה לייזר באורך גל שתואם את ספיגת fluorophore המעורבים. למשל, מולקולות ניאון נפוצות כגון והעמסת 5-isothiocyanate (FITC) ו-Alexa 488 פלואוריד יכול להיות נרגש ביעילות באמצעות דיודה 488 ננומטר לייזר (למשל PicoQuant GmbH, LDH-PC-485). מולקולות פלורסנט, כגון טקסס אדום או Allophycocyanin (APC) יכולה להיות יעילה יצא ב 633 ננומטר הוא משתמש / Ne לייזר (למשל ניופורט R-31425).
- השתמש לייזרים פעמו ההפעלה בשיעורים חזרה על כמה MHz (עם הפרדות הדופק כמה ns) ו fluorophores עם מאפייני החיים מובחנים דיים עבור הדמיה חיים (FLIM) ניסויים פלואורסצנטי.
- השתמש הקורה ההיגוי מראות אופטיקה לשלוט על גובה הקורה, כמו גם לכיוון הקורה.
- השתמש במראה כדי לשקף את dichroic קרן לייזר לתוך l המטרהENS. אם שני לייזרים משמשים בו זמנית, להקה כפול ראי dichroic ניתן להתקין כדי לאפשר השתקפות של שני קרני לייזר (למשל עבור 488 ו 633 ננומטר קורות מראה z488/633rdc מתאגיד טכנולוגיה Chroma הוא אידיאלי).
- השתמש אינסוף, תיקן, הצמצם המספרי גבוה (NA) מיקרוסקופ אובייקטיבי (כלומר אולימפוס 60 / x 1.2 NA, טבילה במים) כדי להביא את אור הלייזר להתמקד הדוק בתוך ערוץ microfluidic. כאשר עובדים עם microchannels גבוה (> 100 מיקרומטר) המטרה בשימוש יש לבחור כראוי על מנת להבטיח כי המרחק עבודתה ביעילות מכסה את גובה מלא של microchannel.
- איסוף הקרינה הנפלטת במדגם (בתוך הערוץ microfluidic) באמצעות אותה מטרה גבוהה NA ומועבר דרך המראה dichroic אותו.
- הסר את כל אור עירור שיורית באמצעות יחיד או הלהקה כפול מסנן פליטה (למשל מסנן z488/633 מ Chroma Technology Corporation).
- פוקוס emissio פלואורסצנטיn אל חריר 75 מיקרומטר באמצעות עדשה Plano-קמורה (למשל 50.2 F; ניופורט בע"מ). מקם את חריר במישור confocal המטרה מיקרוסקופ.
- שימוש נוסף במראה dichroic (למשל 630dcxr, Chroma Technology Corporation) לפצל את האות על גבי שני גלאי פלורסנט.
- סינון הקרינה לידי ביטוי במראה dichroic עם מסנן פליטה (למשל hq540/80 מ לסנן Chroma Technology Corporation) ולמקד אותה עם עדשה קמורה Plano-(כלומר f = 30.0, 25.4 מ"מ id, Thorlabs) על הראשון ( "ירוק") גלאי. בניסויים מעורבים fluorophore אדום משני לסנן את הקרינה מועברת על ידי המראה dichroic עם עוד מסנן פליטה (למשל מסנן hq640lp מ Chroma Technology Corporation) ולאחר מכן להתמקד בו עם עדשה Plano-קמור עוד על הגלאי ("אדום") השני.
- השתמש photodiodes מפולת (למשל AQR-141, EG & G, פרקין אלמר-) לגילוי של פוטונים פלואורסצנטי. ההגדרה הסופית ממחישה
3. Droplet הדור רכישת נתונים
- Droplet שיטות דור
- ניתן להשתמש בשתי תצורות העיקרי של microchannels לייצר טיפות: זרימה התמקדות או T-בצומת הפורמט (איור 3 א ו 3 ב) 6,7 שתי השיטות שווה, כל עוד טיפות יצרו רחבים כמו microchannel עצמו.. כתוצאה מכך כוחות גזירה העולות באמצעות אלה הגיאומטריות להביא את שני נוזלים immiscible יחד ואת אי יציבות נימי הבאים המתפתחים בממשק, טיפות monodisperse (קטן ככל femtoliters כמה) נוצרות באופן ספונטני.
- אתה יכול לתמצת ריאגנטים בדרכים שונות: ריאגנטים ניתן להכין מעורב את שבב לתערובת הרצוי / ריכוז, או שהם יכולים להיות הביאו לתוך שבב בנפרד ולאחר מכן בשילוב יחד לפני היווצרות טיפה (איור 3c). זההשיטה האחרונה מספקת גמישות גבוהה יותר מאז תערובות / ריכוזי ניתן לשנות על ידי כוונון פשוט יחסית, ספיקות. יצוין, כי אנקפסולציה התא, השעיה תא המזרק צריך להיות עורר כדי למנוע התעבות של התאים על פני זמנים של הניסוי.
- רכישת נתונים פלואורסצנטי.
- זוג האות אלקטרוניים גלאי photodiode מפולת (המתואר 2.2.12) למכשיר DAQ תכליתי עבור נתונים כניסה (למשל PCI 6602, National Instruments), שרצה על מחשב אישי.
- על הניסויים FLIM לחבר את גלאי ספירת Time-בקורלציה פוטון יחיד (TCSPC) כרטיס (למשל TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) רץ על מחשב נפרד. כרטיס זה מאפשר נתונים חיים פלואורסצנציה שיופק באמצעות מתודולוגיה TCSPC: כל פוטון ניאון הוא זוהה מתואמים הדופק לייזר האירוע, ולכן כל פוטון הנפלט פלורסנט מוקצה זמן העיכוב. זה נתוניםניתן להתאים את עקומת דעיכה יחיד או רב מעריכי לקבל הערכה של מקדם fluorophore / s קצב קרינה / s. Deconvolute את הנתונים הגולמיים עם הפונקציה מכשיר התגובה (IRF) של הגלאי: זה מתקבל באמצעות ריכוז נמוך Auramine-O פתרון (אשר מציג לכל החיים פלואורסצנציה של picoseconds כמה) 8.
4. Cell הכרה ומיפוי של ערבוב בתוך טיפות
- Cell הכרה ומיפוי של ערבוב בתוך טיפות
- השתמש למעלה Escherichia coli 10 זן לניסוי assay הכדאיות. התרבות התאים לוריא-Bertani מרק לילה ולהתאים את צפיפות אופטית 0.5 לפני הניסויים.
- השתמש 0.4 מיקרומטר SYTO9 ו 1 מיקרומטר יודיד propidium לאיתור את הכדאיות של התאים. שני ה-DNA intercalating צבעים ועוצמת הקרינה שלהם גדל מעל 20 קפלי על הכריכה ל-DNA. SYTO9 הוא צבע פלואורסצנטי ירוק כי זה אניmbrane חדיר ו יודיד propidium הוא צבע פלואורסצנטי אדום אשר קרום חדיר. לפיכך תאים חיים לזרוח "ירוק" תוך התאים המתים התערוכה הן 'ירוק' ו 'אדום' פליטות.
- השתמש ההתקנה הציג 2.2) לגילוי פלואורסצנטי ירוק / אדום.
- השתמש נייד, מיני מגנטי stirrer (יוטה ביודיזל אספקה, יוטה) לבחוש השעיות תא בתוך מזרק 3mL plastipak BD מצויד בבר ומערבבים 7mm מגנטי על מנת למנוע שקיעה התא.
- מיפוי של אירועים באמצעות ערבוב FLIM
- פוקוס נפח בדיקה אופטי בגובה מחצית microchannel שלאורכו טיפות זורמים.
- טופס טיפות משתי תמיסות מימיות (כמו איור 3c), שכל אחת מהן מכילה fluorophore (ללא אינטראקציה) עם גלגולים שונים ניאון אופייני.
- החל מצד אחד של הערוץ, לבצע כל ניסוי פני כל רוחב של ערוץ 1 ב במרווחים מיקרומטר. ערוץ edGES ניתן לזהות בקלות את עוצמת הקרינה יורדת בצורה דרסטית פעם את קרן הלייזר מתמקדת קרבתם.
- יישם אלגוריתם להבדיל התפרצויות אות (המשויך טיפות) מן הרקע רעש של השלב נפט כדי לקבוע את משך הזמן של כל פרץ.
- יישם אלגוריתם שנייה לחלץ את זמן העיכוב וערכים אינטנסיביות לאורך כל אגל ברוחב מסוים שבו הניסוי בוצע. 9
- ואז להשתמש הערכת סבירות מירבית (MLE) אלגוריתם כדי להעריך את החיים הקרינה על כל טיפה בניסוי. 8 ממוצעים ערכי החיים של כל טיפות בניסוי, מקטין את השגיאה הסופית של חישוב MLE (טיפות יותר נחקר, קטן שגיאה).
- לאחר מסלול חייו התקבל עבור רוחב כל אחד, לשלב את כל המסלולים במפה 2D. מאז כל ערך החיים קשורה particular תערובת של שני fluorophores, ריכוז (או ערבוב) המפה כך ניתן להשיג.
- לחלופין, מפה 3D של אגל ערבוב יכולה להיות מושגת בקלות על ידי חזרה על פרוטוקול זה בנקודות שונות לאורך בגובה של הערוץ microfluidic.
5. ניתוח נתונים
- לפרש את הנתונים הגולמיים ניסיוני קבצים לשפת המחשוב המתאים, כך שהם יכולים להיות מנותח נוסף (כגון קבצי טקסט המכילים את וריאציה של ספירת פוטון לאורך זמן, ניתן לחלץ בקלות לצורך עיבוד וניתוח של נתונים לתוך Matlab). ייתכן שיהיה עליך לכתוב קודים ספציפיים כדי לגשת לנתונים הכלולים בתיקי הניסויים מורכבות יותר (כמו אלה של FLIM) או כדי להריץ אלגוריתמים MLE או לבנות מפות 2D של דפוסי ערבוב בין מסלולי החיים.
6. נציג תוצאות
Cell הכרה
דוגמאות אופייניות של variation של ספירת פוטון כפונקציה של הזמן עבור מבוססי תאים ניסויים מוצגים איורים 4 א ו - ג, על פני תקופה של 200 אלפיות השנייה. חשוב לציין לוריא-Bertani מרק (מדיום LB) משמש רקע חלושות fluorescing המגדיר את הגבולות טיפה מימית, תוך פרצי פוטון מובהק, המתאים נוכחות של תאים בודדים, ניתן להבחין על גבי רקע זה. הרקע LB פלורסנט מאופיינת בחתך מלבני כ (מסומן על ידי קווים מנוקדים אדום וירוק).
רוחב חצי מלא לכל היותר (FWHM) של התפרצויות פלורסנט הנובעים E. תאים coli הוא פי 30 יותר קצרה טיפה רקע האירועים, אשר עולה בקנה אחד עם האורך היחסי של טיפות (40 מיקרון, המתאים לנפח של 30 picolitres) וא ' coli התאים (1.5-2.0 מיקרון). 10
עם ערוץ כפול לזהותיון המערכת, את קיומו של תאים חיים או תאים מתים ניתן להבחין בין ניתוח של ערוצי ירוק ואדום. איורים 4 B ו-D להראות את התפלגות הסתברות המתאר את מספר התאים לכל טיפה.
מיפוי של אירועים באמצעות ערבוב FLIM
החיים פלואורסצנציה מולקולרית היא תכונה מהותית של fluorophore יחיד מושפע רק על ידי הסביבה הכימית שלו. לפיכך המדידות שלו יכול לשמש כדי להשיג מידע סביבתי (כגון פתרון ה-pH, טמפרטורה, הקוטביות ואת צמיגות) עם רזולוציה דיוק מעולה מאשר מדידות זמן משולב הקרינה, אשר תלויים בגורמים ניסיוני (כמו ריכוז, עוצמה עירור, אוסף אופטי יעילות). 9,11
הציג כמו בכל מקום אחר, 8 ניתן למפות את דפוסי ערבוב בתוך טיפות באמצעות שני fluorophores עם דיהחיים ערכים fferent. בתערובת המכילה שני (לא אינטראקציה) מינים פלורסנט ריקבון ייקח בטופס biexponential כפי שמוצג במשוואה 1: 
חיים הפרט מוגדרים τ1 ו τ2 וכן את המשרעת של כל רכיב ניתנת על ידי α1 ו α2 בהתאמה. החיים הממוצע אז יכול להיות מוגדר כדלקמן: 
איפה β1 ו β2 הם שבריר של כל מרכיב ואת מוגדרות כדלקמן: 
מאחר נפח בדיקה קבועה טיפות זורמים על פני העמדה, מסלול חייו של הערכים לאורך טיפות ברוחב מסוים ניתן להשיג כך. מסלול אופייני עבור רוחב מסוים על בסיס ממוצעעורך בין הטיפות 6000, ניתן לראות ציור 5a.
שילוב מסלולים ברחבי רוחב כולו של ערוץ מוביל להיווצרות ריכוז המפה 2D (או ערבוב). תוצאה טיפוסית מוצג באיור 5 ב.
על ידי חישוב ממוצע התוצאות בין מספר רב של טיפות, טעות התקן של התוצאות המתקבלות ניתן לצמצם מאוד (1% של שגיאה סטנדרטית עם מרווח ביטחון של 95% עבור ציור 5a). שיטת קביעת מסלול חייו מניח כי כל טיפות זהים כמעט. זה הוכח כנכון בעיקר משתי סיבות עיקריות: אם הטיפות היו שונים באופן משמעותי, את מסלולי החיים הממוצע שהושג היה שטוח, פחות פרופילים היסטוריות (ואת ההבדלים החדים בחיים לאורך טיפות בממוצע מזוהים באופן עקבי). יתר על כן, התוצאות הן לשעתקו ללא תלות הפרטטיפות או ניתח את כמות טיפות להשתמש בהם בחישובים. 8
1. תרשים זרימה על תהליך ייצור שבבים microfluidic.
איור 2 תרשים) המייצג את משאבות מזרק מזרקים, מחובר השבב microfluidic להיווצרות אגל ב) ייצוג סכמטי של ההתקנה אופטי אופייני לייזר דו - שני fluorophore (ירוק ואדום) עירור וגילוי.. DC = dichroic במראה, EM = מסנן פליטה, L = עדשה, PH = חור פין, APD = גלאי photodiode מפולת שלגים.
איור 3 על שבב היווצרות טיפת אסטרטגיות: א) זרימה התמקדות תצורה, ב) T-בצומת תצורה.. ג) ביום אנקפסולציה שבב droplets של שני ריאגנטים מימית להפריד במקור.
איור 4 readout אופטי של עקבות של 0.2 נרשמה (א) מת (ג) תאים חיים (ספיקה להשעיה תאים: 1 דקות μl -1, שמן: 2 דקות μl -1).. כל אות בצורת קשת מתאים המדיום LB פלורסנט חלושות היוצרת את אגל מימית, עם גבולות אגל מסומן בקווים מקווקווים. אותות הירוק מייצג readout תחת אותות 633nm אדום באורכי גל מעל 633 ננומטר. תאים נבדלים על ידי ספייק האנכי הנובע צבעים DNA intercalating. הסתברות הפצה התפוסה הסלולר בתוך טיפות יחיד (ב) תאים מתים (ד) בתאים חיים.
איור 5) אופיינית למסלול חייו בממוצע לאורך אגל ברוחב מסוים;. ב)ייצוג טיפוסי השילוב של כל מסלולי בממוצע נחקר לרוחב מלא של טיפות לתוך החיים 2D (או ריכוז, כפי שבאה לידי ביטוי Str-AF488% FITC /%) המפה.
Discussion
תיארנו ייצור של המכשיר microfluidic, התקנה ניסיונית ופרוטוקולים הקשורים להיווצרות microdroplet ו אנקפסולציה מגיב זיהוי אופטי של טיפות מעובד. שתי הדוגמאות שנבחרו (זיהוי של תאים בודדים בטיפות ואת מיפוי של תהליכי ערבוב בתוך טיפות זורם) מייצגים יישומים נפוצים כי כרגע נחקרים עם מיקרופלואידיקה רביב.
כמו הניסויים שהוצגו להמחיש, את השימוש של פלטפורמות אגל microfluidic להציג מאפיינים אטרקטיביים מסוימים, כגון תפוקה גבוהה, מעין מושלם הכליאה, שחזור גבוהה ... כמות גדולה של מידע הפיק את המהירות הגבוהה שבה מידע זה שנוצר, אם כי, דורשים שימוש בשיטות זיהוי מהיר עם רזולוציה גבוהה spatiotemporal אם את היתרון המלא תועלת מן הפלטפורמות האלה מיניאטורי. במקרה זה להוכיח כי מדובראפשרי באמצעות מדויק מאוד טכניקות ספקטרוסקופיות ניאון. בפרט, זיהוי FLIM טכניקה (אשר עושה שימוש לייזר פעמו עם תקופות חזרה קצר ככל ns כמה) מגלה את היכולת להשיג מידע מהר מאוד במהירות טיפות זורם (כ 200 לשנייה). במקרה זה ההחלטה זמן של אירועים זוהה היה נמוך כמו 1 μs. במונחים של מגבלות גודל טיפה ריכוז, השימוש בעדשות גדולות צמצם המספרי לייזרים כוח גדול יותר יהיה קל להתיר את גילוי ריכוזים nM בתוך טיפות קטן כמו 5 מיקרומטר (מגבלות גודל טיפה להיות שהוטלו על ידי החלטות של photolithographic תהליך ייצור של השלב מיצוב submicron).
טיפות Microfluidic הם מועמדים אידיאליים לבצע ניסויים בקנה מידה גדול הכוללים כמויות קטנות של חומרים כימיים, אל היעד אירוע יחיד /. המגבלות הנוכחיות של טכנולוגיה זו כרוך קושי ליצור droplets ממגוון גדול (עשרות או מאות) של מקורות שונים באופן תפוקה גבוהה. בנוסף, הקושי להתמקד ולטפל בכל אגל יחיד שנוצר מטיל מגבלות חמורות על תחולת מעשי של טכניקות אלה. לכן, נושאים אלה עומדים במרכז מאמצי מחקר חשוב שנועד לפתח את הפתרונות הטכנולוגיים הדרושים שיאפשרו פלטפורמות אגל microfluidic להיות שיטה התייחסות סטנדרטית של מחקר וניתוח יישומי תפוקה גבוהה.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר את התמיכה של מועצות מחקר ומענקים הבאים: EPSRC, HFSP, קרן המחקר הלאומית של קוריאה (מספר גרנט R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein 5-isothiocyanate (FITC) | Reagent | Sigma-Aldrich | F3651 | |
| Streptavidin-Alexa Fluor 488 | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | S11223 | |
| Perfluorodecalin | Reagent | Sigma-Aldrich | P9900 | |
| 1H,1H,2H,2H-perfluorooctanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Reagent | Premier Farnell UK LTD | 1673921 | |
| auramine-O | Reagent | Sigma-Aldrich | 861030 | |
| 485 nm pulsed diode laser | Equipment | PicoQuant | LDH-P-C-485 | |
| TCSPC Card | Equipment | PicoQuant | TimeHarp 100 | |
| dichroic mirror | Equipment | Chroma Technology Corp. | z488rdc, | |
| Microscope objective | Equipment | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW | |
| Avalanche photodiode | Equipment | PerkinElmer, Inc. | AQR-141 | |
| DMEM | Reagent | Invitrogen | ABCD1234 | |
| SYTO9 | Reagent | Invitrogen | S34854 | |
| Propidium Iodide | Reagent | Invitrogen | P3566 | |
| Escherichia coli top 10 strain | Cells | Invitrogen | C4040-10 |
References
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-368 (2006).
- Zheng, B., Angew, I. smagilov, F, R. A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow. Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).
- Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. Microdroplets: A sea of applications. Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).
- deMello, A. J. Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems. Nature. 442, 394-394 (2006).
- Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).
- Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).
- Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 μs Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging. Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).
- Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging. Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).
- Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chem. Commun. 1218, (2007).
- Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes. J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).
