Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans Published: February 13, 2012 doi: 10.3791/3442
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M University System Health Science Center

Summary

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה ב

Abstract

סי אלגנס הוכיחה להיות מערכת מודל ערך לגילוי ואפיון פונקציונלי של גנים רבים ושבילים גנים 1. כלים מתוחכמים יותר ומשאבים ללימודי במערכת זו יש להקל על הגילוי המתמשך של גנים עם פנוטיפים או תפקידים יותר עדינים.

כאן אנו מציגים פרוטוקול כללית התאמנו לזיהוי ג elegans גנים עם פנוטיפים postembryonic בעלי עניין באמצעות RNAi 2. הליך זה שונה בקלות assay הפנוטיפ של בחירה, בין אם על ידי אופטיקה אור פלואורסצנטי או על מיקרוסקופ לנתח או תרכובת. זה פרוטוקול ההקרנה מנצל את הנכסים הפיזיים של האורגניזם וכלים מולקולריים ג הקהילה elegans המחקר הפיק. כדוגמה, אנחנו מדגימים את השימוש transgene משולבת המבטאת מוצר ניאון במסך RNAi לזהות גנים הנדרשים לוקליזציה רגיל לכךהמוצר הזחלים בשלב מאוחר ומבוגרים. ראשית, השתמשנו ספריה זמינים מסחרית RNAi גנומית עם באורך מלא מוסיף cDNA. ספריה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מועמדים רבים על ידי הפחתת RNAi של המוצר הגן המועמד. שנית, אנו שנוצר transgene משולב המבטא חלבון מתויג fluorecently שלנו עניין ברקע RNAi רגיש. שלישית, על ידי חשיפת בעלי החיים בקעו כדי RNAi, מסך זה מאפשר זיהוי של מוצרים גנים שיש להם תפקיד חיוני עובריים שאחרת להסוות תפקיד שלאחר עובריים בוויסות חלבון של עניין. לבסוף, המסך הזה עושה שימוש במיקרוסקופ המתחם מצויד לפתרון תא בודד.

Protocol

1. זן הקרנת הבנייה

תכנון קפדני של זן ההקרנה היא קריטית להצלחה של המסך תוארה במקומות אחרים 3. עבור חוקרים מסוימים, באמצעות מאמץ המבטא מוצר גלוי מ transgene דרוש הניסוי. זנים רבים מחסה transgenes משולבים זמינים לחוקרים CGC או אדם פרטי. אם זן מהונדס נדרש המסך אבל הוא לא זמין, אז זה יכול להיות שנוצר באמצעות שיטת שפורסם כמו 4 הפצצה, UV / tmp 5, או מוס transposon הכנסת 6. כדי להמחיש החלבון שלנו של עניין, הכנסנו את רצף ה-GFP קידוד במסגרת רצף cDNA בוגרת (השתמשנו dbl-1 ברצף). כי זה חלבון היתוך GFP אינו גלוי על ידי לנתח היקף, השתמשנו סמן coinjection כי היה גלוי לא השפיע על הצפייה של החלבון שלנו עניין (TTX-3P :: RFP 7). לאחר מכן יצר transgene משולב ממערך extrachromosomal. מצאנו כי ההפצצות של transgene הניבה מספר נמוך עותק קו משולב לא הציל את הפנוטיפ מיקרוסקופ לנתח ולא הפיק רמות הגלויים של מוצר ה-GFP-מתויג (Beifuss ו Gumienny, לא פורסם). UV / tmp שילוב של מערך עותק מספר extrachromosomal עשה במקור על ידי הזרקת 8,9 הניב גלוי, הצלת רמות של המוצר transgene (איור 3 א). כתם המערבי עם נוגדן אנטי-GFP אישר כי transgene (שם אלל texIs100) באה לידי ביטוי ומעובד כראוי (Beifuss ו Gumienny, לא פורסם). Transgenes משולבים יש outcrossed חמש פעמים להסיר מוטציות רקע זרים ללא קשר למקור.

על המסך שלנו, רצינו את החלבון רק עניין להיות בצורה מהונדס, מתויג. לכן, הסרנו גרם אנדוגני תפקודיתמזרח על ידי החדרת אובדן-of-פונקציה מוטציה dbl-1 אלל.

לבסוף, אנחנו זן רגיש להשפעות של RNAi. RNAi מהספריה יהיה, כי גנים רבים, לייצר ירידה חמורה יותר אם המוצר גן חיות מכילים מוטציה מגרה את החיות להשפעות של RNAi 10,11 רקמות (ים) של עניין יש לשקול בעת בחירת מתאים RNAi רגישות רקע 11. השתמשנו אלל הקנונית rrf-3 (pk1426) לעשות מאמץ ההקרנה שלנו. RRF-3 הוא RNA-RNA מכוונת (RdRP) פולימראז homolog שבדרך כלל מעכב סומטי RNAi 10. מוטציות בגנים אחרים RNAi hypersensitizing כמו ערי-1 או ערי-1-15 ב לין ניתן להשתמש במקום כדי להגביר את האפקטיביות של RNAi 11-13.

זן ההקרנה עשינו יש גנוטיפ rrf-3 (pk1426); texIs100; dbl-1 (nk3).

2. בחירת והכנתRNAi הספריה

זמינה באופן מסחרי ג elegans ספריות cDNA מייצגים כ 55% או 87% מהגנים החזויים ב C. elegans בנפרד (וידאל במעבדה או Ahringer ספריות מעבדה, בהתאמה). שיבוטים אישיות זמינים לרכישה (פתח Biosystems, Geneservice בע"מ). בחרנו את הספרייה ORF-RNAi נבנה על ידי המעבדה וידאל (פתח Biosystems) כי שיבוטים שלה הם בעיקר באורך מלא cDNAs Gateway משובטים ומוכן יישומים במורד הזרם (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). הספרייה המקורי Ahringer במעבדה הגנטית cDNA מכיל שברי cDNA כי הם לא שימושי נרחב עבור ניסויים אפיון במורד הזרם 14,15. ספריות הן להשתמש וקטור המכיל שני היזמים T7 משני צדי הוספה (איור 1). בונה את מגדלים זן חיידקי HT115, המבטא פולימראז T7 על ידי אינדוקציה איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). חיידקים המכילים שיבוטים הספרייה המושרה עם IPTG ללייצר dsRNA (ראה שלב 3.4).

לשכפל את הספרייה עם קבלת ולהשתמש כפול עבור כל הניסויים. ספריות המקורי כפול יש לאחסן שונים -80 מעלות צלזיוס מקפיאים המחוברים להפריד בין קווי חשמל.

3. הכנת חיידקים עם ספריה שיבוטים

  1. (תוך חודשיים של הניסוי) חיידקים פס מן הנבחרים הספרייה שיבוטים האכלה, כמו גם בקרות חיוביות ושליליות, על LB-carbenicillin / טטרציקלין צלחות שכותרתו (אנו גדלים 8 תרבויות בכל צלחת 100 מ"מ) דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ( > 16 שעות) (איור 1). על צלחת של 24 גם זה, אנו משתמשים שני פקדים. שליטה חיובית, BLI-4 (K04F10.4), מייצרת תלויה במינון שלאחר עובריים pheontype 16,17. הביקורת השלילית, C06C3.5, הוא pseudogene חזה ( WormBase.org ) הגורמת אין פנוטיפים שנצפו (Beifuss ו Gumienny, לא פורסם). (תוך חודשיים של הניסוי, רצוי במוקדם) הכן 24 גם צמיחה נמטודות בינוני (NGM) לוחות המכילים 25 - 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 1 מ"מ carbenicillin IPTG. לאחסן ב 4 ° C.
  2. (יום 1) עבור כל שיבוט, מחסן 2 מדיה מ"ל ליברות המכילות 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​carbenicillin עם מושבה אחת מהצלחת מפוספס (ים) (בשלב 3.1), תוך שימוש בטכניקה סטרילית סטנדרטי. דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (> 16 שעות) בקבוצת שאכר אל 220-240 סל"ד (איור 1). הפתרון צריך להיות מעונן לאחר 16 שעות.
  3. (יום 2) למחרת בבוקר, לגרום להכפיל גדילי RNA (dsRNA) הייצור על ידי הוספת IPTG על תרבויות לריכוז הסופי של 1 מ"מ. דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס, 220 - 240 סל"ד, במשך 4 נוסף - 5 שעות. צעד זה מבטיח עקבי ויציב יותר RNAi-Induced מציאה של המוצר גן להסתמך אך ורק על IPTG ב אגר הצלחת NGM (בשלב 3.5).
  4. במקום 30 μl של כל מ"ק חיידקים המושרהlture לתוך בארות נפרדות של צלחת 24-RNAi גם NGM המכיל 25 - 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 1 מ"מ carbenicillin IPTG (איור 1, איור 4 עבור התבנית בשימוש כדי לעקוב אחר הניסויים RNAi). שים צלחות, חשף, בשכונה זרימת סטרילי במשך 20 דקות או עד הנקודות חיידקים יבשים. לא overdry. Overdrying גורם שולי אגר להתרחק מהצלחת ובעלי חיים יהיה הפיך אם הם זוחלים לתוך הסדקים וכתוצאה מכך.

4. הכנת נמטודות

התחל עם האוכלוסייה מבוימת של נמטודות. קביעת בעלי חיים מקטין את הסיכוי כי ההבדלים שנצפו בין שליטה לבין ניסויים ניסויים RNAi הם פשוט בשל הבדלים בשלב ההתפתחותי של בעלי החיים (עם זאת, אם RNAi גורם עיכוב התפתחותי, זה יש לציין ידי המסנן (איור 2)) . יתר על כן, החל את הניסוי RNAi עם הזחלים L1 מונעת תופעות מבלבלים הקטלניות האפשריות של העובר על ידי RNAi של אלוףes כי גם היא משחקת תפקיד postembryonic של עניין.

ההיערכות נעשית על ידי 1 הלבנת האוכלוסייה מעורב בשלב של זן ההקרנה, אשר רק קליפת המוגנים העוברים לשרוד. שלבים אלה בעלי חיים עד למרחק של כ 12 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס או כ -18 שעות ב 16 ° C 18. יותר חזק חיות במה, בעלי חיים מעצר בשלב הזחל הראשונה (L1) על ידי נותן האץ' עוברים בתווך M9 בלי אוכל. חיות L1 מורעבים דגש על צמיחה קורות חיים מזון מגיל 19 החל אותו.

  1. (יום 1) השתמש שלוש צלחות 100 מ"מ של הפד, נקיים זן ההקרנה חיים המכילים מבוגרים הרה להולדת ועוברים. לשטוף את בעלי החיים מהצלחות באמצעות M9 סטרילית ידי pipeting נוזלים על פני השטח את הצלחת בעדינות כדי לשחרר בעלי חיים ועוברים. מעבירים את הכביסה לתוך צינור סטרילי 15 מ"ל עם מכסה בורג.
  2. אם הכביסה עולה על 3.5 מ"ל, לסובב את בעלי החיים (~ 3000 סל"ד למשך 30 שניות) ולהסיר נוזל 3.5 מ"ל. אם הכביסה הוא אניESS מ 3.5 מ"ל, מוסיפים H 2 0 או M9 לצינור לסך 3.5 מ"ל.
  3. ללבוש ציוד מגן מתאים (חלוק, כפפות, משקפי מגן) במהלך טיפול בכימיקלים. ערבבו 0.5 מ"ל 5 N NaOH עם אקונומיקה 1 מ"ל טרי (hypochlorite נתרן 5%, פחות מ 1 שנה). להוסיף את תערובת כדי לשטוף מ"ל 3.5 נמטודות. להתחיל לספור את שעון העצר. תהליך זה לא אמור לקחת יותר מ -10 דקות. אם כן, אז עוברים יהיה בסכנה תשואה עשוי להיות מופחת, או אקונומיקה ישן וצריך להחליף.
  4. המערבולת צינור במשך 10 שניות. חזור על vortexing כל שתי דקות במשך 4 עד 10 דקות. לאחר vortexing כל, לבחון את הפתרון מתחת היקף לנתח את פגרי בעלי חיים.
  5. כאשר עוברים משתחררים ומבוגרים מקוטעת (6 - 8 דקות), גלולה את העוברים על ידי ספינינג צינור בצנטריפוגה הטבלה העליונה (~ 3000 סל"ד, 30 שניות).
  6. Aspirate גם של supernatant ככל האפשר מבלי להפריע גלולה. תיזהר, לאחמדן.
  7. הוסף M9 סטרילי אל ~ 10 מ"ל. מערבולת בקצרה תנער היטב resuspend גלולה.
  8. ספין ולהסיר supernatant שוב. אם ריח של אקונומיקה ניתן להבחין בצינור, חזור על לשטוף הצורך.
  9. עוברים Resuspend ב 10 - 15 מ"ל סטרילי M9 והעברה בקבוק קטן Erlenmeyer (25 מ"ל) (על אוורור). ללחוץ בטמפרטורה מתאימה זן ולהתנסות (15-25 מעלות) למשך הלילה (> 16 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס). בזמן זה, בעלי החיים לא כל הפתח מעצרו ב diapause L1.
  10. (יום 2) ספין למטה L1 חיות שלב שפופרת 15 מ"ל ו resuspend ב 0.5 - 1 מ"ל M9 (~ 3000 סל"ד, 30 שניות.). מניחים 5 פתרון μL על צלחת נפרדת לספור את מספר בעלי החיים. לבצע התאמות בהיקף, במידת הצורך, כדי להניב 30 תולעים / 3 - 10 פתרונות μL.
  11. לזהות כ 30 מסונכרנים hypochlorite L1 הבמה חיות על גבי החיידקים ב גם כל צלחת 24 גם מוכן. יותר מדי מומחדש מ -30 חיות לכל גם עלול לגרום לאוכלוסייה הרעבה לפני שהגיע לבגרות. תן את הצלחת יבש באלכסון העפעפיים. החלף את המכסה לאבטח אותו עם גומייה. הפוך את הצלחת ומניחים אותו בטמפרטורה המתאימה בפעם צריכה להבקיע בשלב הרצוי. בגלל rrf-3 (pk1426) הוא האלל רגישים לטמפרטורה, מתח ההקרנה שלנו בעלי החיים גדלו ב 15-17 ° C במשך שלושה עד ארבעה ימים כדי לבחון L4 לבעלי חיים בשלב מבוגרים (איור 1).

5. תצפית של נמטודות

(יום 5) לאחר נמטודות גדלו לשלב הרצוי (איור 2 א), לאשר את בקרות חיוביות ושליליות לייצר את פנוטיפים צפויים באמצעות מיקרוסקופ לנתח. אנו משתמשים BLI-4 כביקורת על יעילות RNAi, כי זה מייצר תלויה במינון שלאחר עובריים מומים נע בין מבוגרים השלפוחיות (פנוטיפ קל RNAi, לא מוצג) כדי הזחלים, נעצר מבחינה התפתחותית קטן (ה חזקה,xpected פנוטיפ RNAi) (איור 2 ב). ואז לראות את בעלי החיים בכל ניסוי גם באמצעות מיקרוסקופ לנתח ומובן מאליו הערה פנוטיפים חריגים המושרה על ידי RNAi (איור 2 ג). לאחר הפקדים אישר פנוטיפים ברוטו ציין, המסך ניסויים RNAi עבור פנוטיפים של עניין. אנו משתמשים במיקרוסקופ המתחם מצויד הקרינה ואת המטרה 63x לשמור לפחות חמישה בעלי החיים של כל ניסוי RNAi, החל בקרות (איור 3).

  1. הכן את השקופית (תקן 75 x 25 מ"מ) על ידי יצירת משטח אגר 4% (אגר 4% H 2 O). על מנת להבטיח עובי אחיד של כרית אגר, הצב שקופית זכוכית נקייה בין שני מפרידי (כל Spacer עשוי המיקרוסקופ שקופית עם שתי שכבות של סרט במעבדה על זה). פיפטה על μL 100 (שנתיים עד שלוש טיפות של pipet כוס פסטר) של אגר 4% מותכת על גבי במרכז שקופיות זכוכית נקייה. מכירה לוח אגר אגר על ידי כיסוי מותכת באמצעות שקופית נוספת להציב במהירות אך בעדינות על גבי מפרידי אתND אגר מותכת. לחשוף את משטח אגר בעדינות על ידי הזזה של שקופיות זכוכית בנפרד, לצאת משטח עמידה שקופית 1.
  2. הנח ~ 5 ירידה μL של הרדמה (levamisole או אזיד הנתרן, למשל) על משטח אגר. הר 8 - 12 בעלי חיים הרדמה. מכסים 22 מ"מ x 22 # 1.5 coverslip (או את עובי coverslip מתאימה במיוחד מיקרוסקופ דריבית) ולצפות בבעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ המתחם.
  3. הגן הקובע, מספר בעלי חיים שנצפו, וגם הפנוטיפ התוצאות עבור כל ניסוי RNAi. על המסך, לבצע להשתמש בתבנית רגילה (ראו למשל, איור 5).
  4. בדוק את הפנוטיפ RNAi, המיוצר על ידי הפנוטיפ, עוד תיכון, אם אפשר, על ידי חזרה על הניסוי. (למשל, המסך למשל הוצגו בשימוש שינוי לוקליזציה dbl-1-GFP מתויג כמסך הראשי ואת גודל הגוף כמסך משני 20). חיידקים יכולים לשמש מן פס זהה (מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס) עד חודשיים. פסים מבוגרים עלולים Result בצמיחה עניים בתרבויות לילה נוזליים ויש restreaked 1.
  5. רצף לפחות קצה אחד של הכנס cDNA כדי לאשר הוספת תואם את התווית הספרייה (ספריית Ahringer יש לו ניתוח אמינות ביצוע, ראה http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/ ) 21. Primers מומלצים (עבור מוסיף מהספריה או) לחשל באתרים האתר L4440-derived הכניסה וקטור האגף: 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG 3 'ו 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3 "(M13f20 פריימר).

באמצעות שיטה זו, אדם אחד יכול לצפות באופן סביר הבמה שניים עד ארבעה סטים של ניסויים מדי שבוע. למשל, בעלי חיים מבוים בימים שני ושלישי ניתן לצפות חמישי ושישי, בהתאמה, והוא יכול להיות מבוים שוב ביום שישי ושבת ליום שני ושלישי התצפית. בהתאם הפנוטיפ (ים) הוקרן כל יום, קבוצה רשאים לכלול 1 24 גם צלחת של תרכובת מיקרוscopy או יותר אם הפנוטיפ מזוהה במהירות. כך, לפחות 88 ניסויים שונים RNAi ניתן לראות בשבוע אחד, תוך בקרות חשבון חיוביות ושליליות ושיעור ההקרנה. מסך היקף לנתח יכול להתבצע במהירות רבה יותר, ללא צורך גובר חיות בשקופיות לצפייה. מספר אנשים יכולים גם להגדיל את התפוקה של המעבדה על ידי לוחות זמנים מדהימים ו / או שימוש מיקרוסקופים רבים. שיטה חלופית לגידול בעלי חיים על סרט דק של אגר והעברת פרוסת אגר המכיל חיות ישירות לשקופית לצפייה יכול לחסוך זמן. גרסה זו שימשה בהצלחה לסינון הפרעות זנבו של הזכר בהגדלה 400x 22.

6. נציג תוצאות

דוגמאות לוקליזציה רגיל שונה של ה-GFP-מתויג dbl-1 מוצגים באיור 3. הביטוי הרגיל של ה-GFP-מתויג dbl-1 כולל הגחון חוט העצב סלולריים גופים שורה של punctae (איור 3 א). Dbl-1 אניזה נחלש קשות כאשר בעלי החיים ניזונים RNA שמונע תרגום dbl-1-mRNA (איור 3 ב). dbl-1 (RNAi) מייצרת גם בעלי חיים קטנים, המסך המשני בדוגמה זו (מידע לא מוצג). גנים המשפיעים dbl-1 לוקליזציה מזוהים בקלות על ידי RNAi באמצעות זן המיועד מסך זה (איור 3 ג).

איור 1
באיור 1. ערכת מסך לזהות הרגולטורים של איתות תאיים dbl-1. חיידקים מן הספרייה האכלה גדלים בן לילה, המושרה עם IPTG ו מודגרות על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות נוספות כדי לאפשר לחיידקים לייצר RNA תקועים כפולה (dsRNA). 30 μl של התרבות חיידקי המושרה הוא הבחין בכל טוב על הצלחת 24 גם (צמיחה בינוני נמטודות) NGM המכיל 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 1 מ"מ carbenicillin IPTG ו להתייבש בשכונה זרימת סטרילית. אנחנו בשלב הראשון הזחלים הזחל (L1) שלב אחר לתת hypochlorite שטופלו embrYOS לבקוע בתקשורת ללא מזון, אשר גורם diapause L1 (פיתוח נעצר). כ 30 מסונכרנים הבמה חיות L1 הם מצופה על כל חיידקים המכילים גם מספריית RNAi, המאפשר מבוים חיות לחדש את הצמיחה לצרוך dsRNA נוצר על ידי חיידקים 23. אחרי שעה 72 על 15 ° C, על תולעים בוגרות צעירות מוקרנים על הפנוטיפ גלוי. בגיל זה, גודל הגוף פגמים ניכרים ואת הקרינה הוא בהיר מביטוי texIs100 transgene.

איור 2
איור 2. דוגמאות פנוטיפים לזהות לפני ההקרנה. כל התמונות של בעלי חיים בצלחת גם צולמו בהגדלה אותה באמצעות מיקרוסקופ לנתח. בעלי חיים היו צילמו כל כ 72 שעות לאחר ציפוי כמו זחלים מורעבים L1. כל התמונות קיבלו טיפול זהה. א) RNAi של הגן אשר מעניקה שום פגמים מורפולוגיים ברוטו. בעלי חיים בטבע מופיעים סוג. ב) RNאיי של BLI-4. בעלי חיים להציג פיתוח נעצר, הם זעירים לעומת בעלי החיים בלוח א 'ג) RNAi של dpy-13. בעלי חיים נמצאים בשלב דומה של התפתחות כמו בעלי החיים בלוח, אבל להציג את המורפולוגיה "גוצה" הגוף.

איור 3
איור 3. דוגמאות החלבון מתויג fluorescently וכיצד RNAi של גנים ספציפיים משנה דפוס לוקליזציה. כל התמונות צולמו בהגדלה 630x עם מיקרוסקופיה דיסק מסתובב confocal, 5 שניות. חשיפה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. כל התמונות קיבלו טיפול זהה. ראשי חץ פתוחים מצביעים גופי התא. החצים מסמנים קו punctae. ראשי חץ מלאים עולה כמה GFP-מתויג מקומי aberrantly dbl-1. א) RNAi-fed pseudogene C06C3.5 ("סוג פראי"). ב) dbl-1 (RNAi) שליטה. ג) RNAi של גן הדרוש לוקליזציה רגיל של ה-GFP-מתויג dbl-1.

"איור באיור 4. תבנית דוגמא למעקב אחר ניסויים RNAi (שיבוטים הספרייה) ב 24 גם הצלחות. תבנית זו ניתן להשתמש כדי ליצור תיעוד קבוע של הניסויים, שלא כמו סימון ישירות צלחות.

איור 5
איור 5. תבנית דוגמא פנוטיפים הקלטה RNAi. להרחיב לפי הצורך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת ההקרנה RNAi המוצג כאן מאפשר ניתוח רגיש ומהיר של מוצרי גנים הנדרשים הפנוטיפ (או המהונדס) רגיל postembryonic. הדוגמה המוצגת היא המסך של גנים המעורבים בלוקליזציה subcellular של חלבון מתויג fluorescently. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לזהות את הגנים המשפיעים על פנוטיפים postembryonic אחרים בעלי עניין.

שיטה זו מנצלת את גישת הגן המועמד באמצעות הספרייה RNAi. מסכי קדימה גנטיות באמצעות טכניקות mutagenesis לזהות אללים הרומן המושרה באופן אקראי, אבל אללים אלה דורשים זמן, מאמץ משמעותי, ו / או קרנות לזהות 24. עם ספריית cDNA, לעומת זאת, רצף של הכנס cDNA שגרם פנוטיפ RNAi עניין במהירות מאשר את הגן המועמד. כמו כן, שיבוט מוכנים מוסיף cDNA להקל על ניתוח במורד הזרם של מועמדים שזוהו. יתר על כן, הגנים הם קטלניים כאשר מוטציהניתן לזהות ולנתח באמצעות RNAi. על ידי הצבת חיות בקעו על חיידקים המושרה, שיטה זו מאפשרת תצפית של פגמים postembryonic עבור גנים גם בעלי תפקידים חיוניים עובריים.

תשמרי על עצמך כדי לוודא חיות שנצפו לא מורעבים. רעב יכול להשפיע על הפנוטיפ של בעל החיים. אם הרומן פנוטיפים RNAi מזוהים אצל בעלי חיים רעבים, חזרו לאשר כי הפנוטיפ הוא תוצאה של RNAi ולא מרעב. כדי למנוע רעב, השתמש חיידקים טריים כי כבר גדל לשלב נייח (מדיום הגידול הוא מאוד "עכור"), ולהשתמש רק ~~~HEAD=NNS 30 חיות בכל טוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו מה למסור.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות ד"ר ריק פאדג'ט (וקסמן המכון, אוניברסיטת רוטגרס, ניו ג'רזי) על המתנה של dbl-1 cDNA וד"ר כריסטופר Rongo (מכון וקסמן, אוניברסיטת רוטגרס, ניו ג'רזי) לסמן זריקה. המעבדה ד"ר Barth של גרנט ביצעה את האקדח גן הפצצה לשילוב מספר נמוך עותק של מבנה ה-GFP-מתויג-1 dbl. גרסיה רנה המעבדה סיוע טכני במהלך היצירה של texIs100. גרסיה רנה, Lints רובין, ו Hongmin צ'ין מעבדות סיפק ייעוץ פרודוקטיבי. עבודה זו מומנה על ידי הזנק קרנות מהמחלקה TAMHSC לרפואה מולקולרית תאית. היקף המתחם confocal דיסק מסתובב נרכשו במימון מחלקת ומכללת TAMHSC המשרד לרפואה של דין.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NGM Agar Nematode growth medium IPM Scientific, Inc Can be prepared following NGM agar protocol25
M9 Medium 22mM KH2PO4,
42mM Na2HPO4,
86mM NaCl,
1 mM MgSO4
Agar-Agar EMD Millipore 1.01614.1000 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter).
Bacto Peptone BD Biosciences 211677 0.25%
IPTG Research Products International Corp. I56000-5.0 1 mM final concentration
carbenicillin Research Products International Corp. C46000-5.0 50 μg/ml working dilution
LB Broth Lennox BD Biosciences 240230 20 g/liter
tetracycline Sigma-Aldrich 268054 12.5 μg/ml working dilution
sodium hypochlorite Any Supplier 5% household bleach Use fresh bleach.
sodium hydroxide Any Supplier CAS 1310-73-2 5 N stock
M9 medium Wormlab Recipe Book http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab 26
levamisol Sigma-Aldrich 31742 100 μM - 1 mM working dilution
sodium azide Fisher Scientific S227 10 mM in M9 working dilution
24-well plate Greiner Bio-One 662160 VWR distributor
microscope slides Any Supplier 75 x 25 x 1 mm
microscope cover slips Any Supplier 22 x 22 mm No.1.5 Use the thickness recommended by the microscope manufacturer.
compound microscope Carl Zeiss, Inc. A1m Use objectives and filters to match the needs of the experiment.
media pump Manostat Varistaltic pump Kate model #72-620-000 Use tubing and settings appropriate for the machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
  2. Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
  3. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
  4. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  5. Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
  6. Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
  7. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
  8. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  9. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  10. Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
  11. Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetics. , (2011).
  12. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
  13. Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
  14. Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  15. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  16. Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetics. , 129-195 (1991).
  17. Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
  18. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  20. Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
  21. Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
  22. Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
  23. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  24. Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
  25. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Tags

בביולוגיה התפתחותית גיליון 60 RNAi מסך ספריה, Postembryonic פיתוח
RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב<em> ג elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi … More

Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442, doi:10.3791/3442 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter