Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

आरएनएआई स्क्रीनिंग में Postembryonic phenotypes पहचानें सी. एलिगेंस Published: February 13, 2012 doi: 10.3791/3442
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M University System Health Science Center

Summary

हम अवगत में प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण के postembryonic नियामकों की पहचान विधि का वर्णन

Abstract

सी एलिगेंस और कई जीनों और जीन एक रास्ते की खोज और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली साबित हो गया है. अधिक परिष्कृत उपकरण और इस प्रणाली में अध्ययन के लिए संसाधनों का अधिक सूक्ष्म phenotypes या भूमिकाओं के साथ जीन की निरंतर खोज की सुविधा कर रहे हैं.

यहाँ हम हम सी. पहचान के लिए अनुकूलित एक सामान्यीकृत प्रोटोकॉल के वर्तमान 2 आरएनएआई का उपयोग ब्याज की postembryonic phenotypes साथ एलिगेंस जीन. इस प्रक्रिया को आसानी से पसंद की परख फेनोटाइप विदारक या यौगिक सूक्ष्मदर्शी पर प्रकाश या प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी द्वारा, चाहे संशोधित किया गया है. इस स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के जीव के भौतिक संपत्ति और आणविक सी. उपकरण पर capitalizes एलिगेंस अनुसंधान समुदाय का उत्पादन किया गया है. एक उदाहरण के रूप में, हम एक एकीकृत transgene है कि एक आरएनएआई स्क्रीन में एक फ्लोरोसेंट उत्पाद व्यक्त के उपयोग के प्रदर्शन के लिए इस के सामान्य स्थानीयकरण के लिए आवश्यक जीन की पहचानदेर चरण लार्वा और वयस्कों में उत्पाद. सबसे पहले, हम पूरी लंबाई सीडीएनए आवेषण के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीनोमिक आरएनएआई पुस्तकालय का इस्तेमाल किया. इस पुस्तकालय उम्मीदवार जीन उत्पाद की आरएनएआई कमी से कई उम्मीदवारों की तेजी से पहचान की सुविधा है. दूसरा, हम एक एकीकृत transgene है कि एक आरएनएआई संवेदनशील पृष्ठभूमि में हमारे हित के fluorecently टैग प्रोटीन व्यक्त उत्पन्न. तीसरा, आरएनएआई रची जानवरों को उजागर करने के द्वारा, इस स्क्रीन उत्पादों है कि एक महत्वपूर्ण भ्रूण भूमिका है कि अन्यथा ब्याज की प्रोटीन को विनियमित करने में एक भूमिका के बाद भ्रूण मुखौटा होता है जीन की पहचान करने की अनुमति देता है. अन्त में, इस स्क्रीन एक यौगिक एकल कक्ष संकल्प के लिए सुसज्जित खुर्दबीन का उपयोग करता है.

Protocol

1. स्क्रीनिंग तनाव निर्माण

स्क्रीनिंग तनाव के सावधान डिजाइन स्क्रीन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है और कहीं और 3 में वर्णित किया गया है. कुछ शोधकर्ताओं के लिए एक तनाव है कि एक transgene से एक दिखाई उत्पाद व्यक्त का उपयोग प्रयोग के लिए की जरूरत है. कई उपभेदों एकीकृत transgenes शरण CGC या व्यक्तिगत शोधकर्ताओं से उपलब्ध हैं. यदि एक ट्रांसजेनिक तनाव स्क्रीन के लिए आवश्यक है, लेकिन उपलब्ध नहीं है, तो यह 4 बमबारी, यूवी / TMP 5, या राज्य मंत्री transposon 6 प्रविष्टि की तरह प्रकाशित पद्धति का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है. आदेश में ब्याज की हमारे प्रोटीन कल्पना करने के लिए, हम परिपक्व सीडीएनए अनुक्रम के साथ फ्रेम में अनुक्रम डाला GFP कोडन (हम DBL-1 अनुक्रम). क्योंकि इस GFP संलयन प्रोटीन गुंजाइश विदारक दृश्य नहीं है, हम एक coinjection मार्कर है कि दिखाई दे रहा था इस्तेमाल किया और हमारे हित के प्रोटीन की देखने को प्रभावित नहीं (TTX-3p :: आरएफपी 7 देखें). हम तो extrachromosomal सरणी से एक एकीकृत transgene बनाया. हमने पाया है कि बमबारी transgene की एक कम प्रतिलिपि संख्या एकीकृत लाइन मिले कि न तो विदारक माइक्रोस्कोप फेनोटाइप बचाया न GFP टैग उत्पाद के दृश्य स्तर का उत्पादन (Beifuss और Gumienny, अप्रकाशित). एक एकाधिक प्रतिलिपि extrachromosomal मूल 8,9 इंजेक्शन द्वारा बनाई गई सरणी के एकीकरण यूवी / TMP दिखाई झुकेंगे, transgene उत्पाद (चित्रा 3) के स्तर का बचाव. विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा पुष्टि की है कि transgene (एलील texIs100 नाम) व्यक्त की है और सही ढंग से संसाधित (Beifuss और Gumienny, अप्रकाशित). एकीकृत transgenes पांच बार outcrossed बाहरी पृष्ठभूमि म्यूटेशनों हटाने के स्रोत की परवाह किए बिना किया जाना चाहिए.

हमारे स्क्रीन के लिए, हम ब्याज का केवल प्रोटीन ट्रांसजेनिक, टैग के फार्म का होना चाहता था. इसलिए, हम कार्यात्मक अंतर्जात जी हटा दियाएक नुकसान के समारोह उत्परिवर्ती DBL 1 एलील शुरू करने से पहले कभी.

अन्त में, हम आरएनएआई के प्रभाव को अवगत तनाव. पुस्तकालय से आरएनएआई, कई जीनों के लिए, जीन उत्पाद में एक और अधिक गंभीर कमी का उत्पादन करेगा अगर पशुओं एक परिवर्तन कि आरएनएआई 10,11 के प्रभाव के लिए जानवरों sensitizes होते हित के ऊतक (ओं) को जब चुनने एक उचित विचार किया जाना चाहिए 11 पृष्ठभूमि सुग्राही आरएनएआई. हम विहित RRF 3 (pk1426) एलील का इस्तेमाल करने के लिए हमारी स्क्रीनिंग तनाव. 3 RRF के एक शाही सेना के निर्देशन आरएनए पोलीमरेज़ (RdRP) के Homolog की है कि सामान्य रूप से दैहिक 10 आरएनएआई रोकता है. इरी-1 या लिन इरी-1-15b जैसे अन्य आरएनएआई hypersensitizing जीन में उत्परिवर्तन के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है 11-13 आरएनएआई की प्रभावशीलता को बढ़ाने के.

texIs100, DBL-1 (nk3) हम बना स्क्रीनिंग तनाव के जीनोटाइप RRF 3 (pk1426) है.

2. चुनना और एक की तैयारीआरएनएआई पुस्तकालय

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सी. एलिगेंस सीडीएनए पुस्तकालयों के बारे में 55 या सी में भविष्यवाणी की जीन के 87% का प्रतिनिधित्व करते हैं एलिगेंस अलग - अलग (विडाल प्रयोगशाला या Ahringer के प्रयोगशाला पुस्तकालयों, क्रमशः). व्यक्तिगत क्लोन खरीद (ओपन Biosystems, Geneservice, लिमिटेड) के लिए उपलब्ध हैं. हम ओआरएफ आरएनएआई विडाल प्रयोगशाला (ओपन Biosystems) द्वारा निर्मित पुस्तकालय चुना क्योंकि इसके क्लोनों ज्यादातर पूर्ण लंबाई cDNAs गेटवे क्लोन और अनुप्रवाह अनुप्रयोगों (Invitrogen निगम, Carlsbad, CA) के लिए तैयार हैं. मूल Ahringer प्रयोगशाला जीनोमिक सीडीएनए लाइब्रेरी सीडीएनए टुकड़े है कि के रूप में व्यापक रूप से नीचे की ओर लक्षण वर्णन 14,15 प्रयोगों के लिए उपयोगी नहीं हैं शामिल हैं. दोनों पुस्तकालयों एक सदिश है कि दो T7 डालने (चित्रा 1) flanking प्रमोटरों का उपयोग करें. constructs बैक्टीरियल तनाव HT115, जो प्रेरण पर isopropyl β-डी thiogalactopyranoside (IPTG) द्वारा T7 पोलीमरेज़ व्यक्त में बड़े हो रहे हैं. पुस्तकालय क्लोन वाले बैक्टीरिया IPTG साथ प्रेरित कर रहे हैंउत्पादन dsRNA (3.4 चरण देखें).

प्राप्त होने पर पूरे पुस्तकालय डुप्लिकेट और सभी प्रयोगों के लिए डुप्लिकेट का उपयोग करें. मूल और डुप्लिकेट पुस्तकालयों अलग -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर कि विद्युत लाइनों को अलग करने के लिए जुड़े हुए हैं में संग्रहित किया जाना चाहिए.

3. पुस्तकालय क्लोनों के साथ जीवाणुओं की तैयार

  1. चयनित पुस्तकालय खिला क्लोन, के रूप में अच्छी तरह से सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, पर लेबल / पौंड कार्बेनिसिलिन के टेट्रासाइक्लिन प्लेट (हम 100 मिमी थाली के प्रति 8 संस्कृतियों बढ़ने) से स्ट्रीक बैक्टीरिया (प्रयोग के दो महीने के भीतर) और 37 ° रात भर सी (सेते हैं > 16 घंटे) (चित्रा 1). प्रत्येक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए, हम दो नियंत्रण का उपयोग करें. सकारात्मक नियंत्रण, BLI 4 (K04F10.4), एक खुराक पर निर्भर के बाद भ्रूण 16,17 pheontype पैदा करता है. नकारात्मक नियंत्रण, C06C3.5, एक भविष्यवाणी (pseudogene WormBase.org ) है कि नहीं मनाया phenotypes (Beifuss और Gumienny, अप्रकाशित) का कारण बनता है. 50 μg / से मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन और 1mm IPTG - (प्रयोग के दो महीने के भीतर, अधिमानतः जल्दी) 24 अच्छी तरह निमेटोड विकास मध्यम (एन जी एम) 25 युक्त प्लेटों की तैयारी. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  2. (1 दिन) प्रत्येक क्लोन के लिए, 2 मिलीलीटर लेग रेखादार प्लेट (ओं) (3.1 चरण में) मानक बाँझ तकनीक का उपयोग कर से एक भी कॉलोनी के साथ 50 μg / मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन है युक्त मीडिया को टीका लगाना. 37 में सेते हैं डिग्री सेल्सियस रातोंरात (> 16 घंटे) एक प्रकार के बरतन सेट में 220 - 240 आरपीएम (चित्रा 1). समाधान 16 घंटे के बाद बादल होना चाहिए.
  3. (2 दिन) अगली सुबह, 1mm की अंतिम एकाग्रता संस्कृतियों IPTG जोड़ने के द्वारा असहाय शाही सेना (dsRNA) उत्पादन दोगुना प्रेरित. 5 घंटे 240 आरपीएम, के लिए एक अतिरिक्त 4 - 37 डिग्री सेल्सियस, 220 पर संस्कृतियों सेते हैं. यह कदम एन जी एम थाली (3.5 चरण में) अगर IPTG पर पूरी तरह भरोसा से एक अधिक संगत और मजबूत आरएनएआई प्रेरित जीन उत्पाद की पछाड़ना सुनिश्चित करता है.
  4. स्पॉट हर प्रेरित बैक्टीरियल घन के 30 μl50 μg / से मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन और 1mm IPTG (चित्रा 1, आरएनएआई प्रयोगों पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया टेम्पलेट के लिए देखें चित्र 4) - 24 - अच्छी तरह से एन जी एम आरएनएआई 25 युक्त थाली के अलग कुओं में LTURE. 20 मिनट के लिए एक बाँझ प्रवाह हुड में या जब तक जीवाणु स्पॉट सूख रहे हैं प्लेटें, खुला, रखो. Overdry मत करो. Overdrying कारण अगर के किनारों थाली और जानवरों से दूर खींचने के लिए अप्रतिकार हो सकता है अगर वे परिणामस्वरूप दरारों में क्रॉल जाएगा.

4. नेमाटोड की तैयारी

नेमाटोड के मंचन जनसंख्या के साथ शुरू करो. जानवरों मचान मौका है कि नियंत्रण और प्रायोगिक आरएनएआई परीक्षण के बीच मनाया मतभेद सिर्फ जानवरों के विकास के चरण में मतभेद के कारण कर रहे हैं (हालांकि, अगर आरएनएआई एक विकासात्मक देरी का कारण बनता है, इस screener द्वारा उल्लेख किया जाना चाहिए (चित्रा 2)) कम हो जाती है . इसके अलावा, L1 के लार्वा के साथ आरएनएआई प्रयोग शुरू आरएनएआई द्वारा जनरल के भ्रूण मारक क्षमता confounding प्रभाव obviatesते कि भी ब्याज की postembryonic भूमिका निभा सकते हैं.

मचान पहले स्क्रीनिंग तनाव है, जो केवल खोल संरक्षित भ्रूण बच के एक मिश्रित मंच जनसंख्या विरंजन द्वारा पूरा किया है. 20 ° सेल्सियस के बारे में 12 घंटे या 16 ° 18 सी के बारे में 18 घंटे के भीतर इस चरण के लिए जानवरों. और अधिक मजबूती चरण पशुओं, M9 के मध्यम में भोजन के बिना भ्रूण हैच दे द्वारा पहली लार्वा मंच (L1) में गिरफ्तारी पशुओं. भूखे L1 जानवरों ही शुरू 19 साल की उम्र से भोजन फिर से शुरू वृद्धि पर रखा.

  1. (1 दिन) खिलाया के तीन 100 मिमी प्लेटें, साफ स्क्रीनिंग तनाव जानवरों है कि गर्भवती वयस्क और भ्रूण का प्रयोग करें. बाँझ M9 के प्लेट का उपयोग कर से थाली की सतह भर में तरल धीरे pipeting जानवरों और भ्रूण को ढीला करके जानवरों धो. पेंच टोपी के साथ एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में धोने का स्थानांतरण.
  2. यदि धोने 3.5 मिलीग्राम से अधिक है, जानवरों (~ 30 सेकंड के लिए 3000 आरपीएम) स्पिन और 3.5 मिलीलीटर तरल हटाने के. अगर धोने एल है3.5 मिलीग्राम से ईएसएस, ट्यूब को जोड़ने के लिए एच 2 0 या M9 के 3.5 मिलीग्राम कुल.
  3. उचित सुरक्षात्मक गियर (प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और काले चश्मे) पहनते हैं, जबकि रसायन से निपटने. 1 मिलीलीटर ताजा. ब्लीच (5% सोडियम hypochlorite, कम से कम 1 साल पुराने) के साथ 0.5 मिलीलीटर 5 एन NaOH मिश्रण. 3.5 मिलीलीटर निमेटोड धोने के लिए इस मिश्रण जोड़ें. एक घड़ी की गिनती शुरू करो. यह प्रक्रिया 10 मिनट से अधिक नहीं लेना चाहिए. यदि ऐसा है, तो भ्रूण और खतरे जाएगा उपज कम किया जा सकता है, या ब्लीच पुराना है और प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए.
  4. ट्यूब भंवर के बारे में 10 सेकंड के लिए. Vortexing 4 से 10 मिनट के लिए हर दो मिनट दोहराएँ. प्रत्येक vortexing के बाद, जानवरों के शवों के लिए एक विदारक गुंजाइश के तहत समाधान निरीक्षण करते हैं.
  5. जब भ्रूण जारी कर रहे हैं और वयस्कों (6 - 8 मिनट) खंडित कर रहे हैं, गोली एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र (~ 3000 rpm, 30 सेकंड) में ट्यूब कताई द्वारा भ्रूण.
  6. गोली परेशान बिना के रूप में संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला के बहुत महाप्राण (व्यंजन). सावधान रहो, नहीं,लालची.
  7. जोड़ें ~ 10ml बाँझ M9. भंवर संक्षिप्त या अच्छी तरह से मिलाने के लिए गोली resuspend.
  8. स्पिन और सतह पर तैरनेवाला फिर से हटाने के. अगर ब्लीच की गंध ट्यूब में पाया जा सकता है, के रूप में आवश्यक कुल्ला दोहराना.
  9. 10 में resuspend भ्रूण - 15 मिलीलीटर बाँझ M9 के और एक छोटे (25 मिलीलीटर) Erlenmeyer कुप्पी (वातन लिए) करने के लिए स्थानांतरण. रातोंरात (> 20 में 16 घंटे डिग्री सेल्सियस). तनाव और प्रयोग के लिए उचित तापमान (25 डिग्री सेल्सियस 15) पर शेक इस समय में, सभी जानवरों हैच और L1 diapause में गिरफ्तारी जाएगा.
  10. 1 मिलीलीटर M9 (3000 ~ rpm के 30 सेकंड) (2 दिन) एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और resuspend के L1 में 0.5 मंच जानवरों नीचे स्पिन. 5 μL समाधान एक अलग प्लेट पर रखें और पशुओं की संख्या गिनती. मात्रा समायोजन करें, अगर जरूरत, 30 कीड़े / 3 उपज 10 μL समाधान.
  11. लगभग 30 हाइपोक्लोराइट 24 अच्छी तरह से तैयार प्लेट की हर अच्छी तरह से में सिंक्रनाइज़ L1 के बैक्टीरिया पर मंच जानवरों स्पॉट. बहुत कई मोअच्छी तरह से 30 प्रतिशत पशुओं की तुलना में फिर से परिपक्वता तक पहुँचने से पहले भूख से मर आबादी में परिणाम हो सकते हैं. Lids के साथ शुष्क थाली टेढ़ेपन से चलो. ढक्कन की जगह है और यह एक रबर बैंड के साथ सुरक्षित. थाली पलटना और उचित तापमान पर यह वांछित स्तर पर स्कोर करने के लिए आवश्यक समय के लिए जगह है. क्योंकि RRF 3 (pk1426) एक तापमान संवेदनशील एलील है, हमारे तनाव जानवरों स्क्रीनिंग 15 में बड़े हो रहे थे - 17 डिग्री सेल्सियस तीन से चार दिन के लिए वयस्क चरण जानवरों (चित्रा 1) L4 निरीक्षण करने के लिए.

5. सूत्रकृमि का अवलोकन

(5 दिन) एक बार नेमाटोड वांछित चरण (2A चित्रा) हो गई है, पुष्टि करें कि सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके की उम्मीद phenotypes. हम आरएनएआई प्रभावकारिता के लिए एक नियंत्रण के रूप में BLI-4 का उपयोग करें, क्योंकि यह खुराक पर निर्भर के बाद भ्रूण दोष पैदा करता है कि से blistered वयस्कों (हल्के आरएनएआई phenotype, नहीं दिखाया) रेंज के developmentally गिरफ्तार, छोटे (लार्वा को मजबूत ई,xpected आरएनएआई phenotype) (चित्रा 2B). तो प्रत्येक प्रयोगात्मक में अच्छी तरह से एक विदारक माइक्रोस्कोप और नोट स्पष्ट असामान्य phenotypes आरएनएआई (चित्रा 2C) के द्वारा प्रेरित का उपयोग पशुओं का पालन. के बाद नियंत्रण की पुष्टि की और सकल phenotypes उल्लेख किया है, ब्याज की phenotypes के लिए आरएनएआई प्रयोगों स्क्रीन. हम एक यौगिक खुर्दबीन प्रतिदीप्ति और एक 63x उद्देश्य प्रत्येक आरएनएआई प्रयोग से कम से कम पांच पशुओं का पालन के साथ सुसज्जित का उपयोग करें, नियंत्रण (चित्रा 3) के साथ शुरू.

  1. 4% अगर पैड (एच 2 हे में 4% अगर) बनाने के द्वारा एक स्लाइड (मानक 75 x 25 मिमी) तैयार है. अगर पैड के एक समान मोटाई को सुनिश्चित करने के लिए, दो spacers (प्रत्येक स्पेसर एक खुर्दबीन स्लाइड के उस पर दो प्रयोगशाला टेप की परतों के साथ किया जाता है) के बीच एक साफ गिलास स्लाइड जगह. विंदुक साफ गिलास स्लाइड के केंद्र पर पिघला हुआ अगर 4% की 100 μL (कांच पाश्चर pipet से दो से तीन बूँदें) के बारे में. पिघला हुआ अगर कवर एक अतिरिक्त जल्दी लेकिन धीरे spacers के शीर्ष पर रखा स्लाइड का उपयोग अगर पैड फार्मपिघला हुआ अगर एन डी. धीरे गिलास स्लाइड के अलावा, एक स्लाइड करने के लिए पालन पैड फिसलने छोड़ने से अगर पैड बेनकाब.
  2. ~ 5 संवेदनाहारी की μL (अगर पैड पर levamisole या सोडियम azide, उदाहरण के लिए) ड्रॉप प्लेस. 8 पर्वत - संवेदनाहारी में 12 पशुओं. एक 22 x 22 मिमी # coverslip (या यौगिक सूक्ष्मदर्शी के लिए सबसे अच्छा अनुकूल coverslip की मोटाई) 1.5 और एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग पशुओं का पालन के साथ कवर.
  3. एक आरएनएआई प्रयोग के लिए रिकॉर्ड जीन, मनाया पशुओं की संख्या, और phenotype परिणाम है. एक स्क्रीन के लिए बना है, और एक मानक टेम्पलेट (उदाहरण देखें, चित्रा 5) का उपयोग करें.
  4. एक और, माध्यमिक phenotype के द्वारा यदि संभव हो, और प्रयोग दोहरा फेनोटाइप आरएनएआई उत्पादन, सत्यापित करें. (उदाहरण के लिए, उदाहरण स्क्रीन GFP एक प्राथमिक और माध्यमिक 20 स्क्रीन के रूप में शरीर के आकार स्क्रीन के रूप में टैग स्थानीयकरण DBL-1 के परिवर्तन का इस्तेमाल दिखाया गया है.) जीवाणु एक ही लकीर (डिग्री सेल्सियस 4 में संग्रहीत) से अप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दो महीने. वृध्द धारियाँ आर हो सकता हैतरल रातोंरात संस्कृतियों में और गरीबों के विकास में esult पहले restreaked किया जाना चाहिए.
  5. अनुक्रम कम से कम एक सीडीएनए पुष्टि करने के लिए है कि डालने के पुस्तकालय (Ahringer पुस्तकालय विश्वसनीयता विश्लेषण प्रदर्शन किया गया है, देखो लेबल से मेल खाता है डालने के अंत http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/ ) 21. 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG 3 'और 5'के GTAAAACGACGGCCAGT-3' (M13f20 प्राइमर) की सिफारिश की प्राइमरों (या तो पुस्तकालय से आवेषण के लिए) L4440 व्युत्पन्न वेक्टर और पार्श्व प्रविष्टि साइट में साइटों पर पानी रखना.

इस पद्धति का उपयोग करके, एक ही व्यक्ति यथोचित मंच और हर हफ्ते दो से चार प्रयोगों के सेट का पालन कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, पशुओं के लिए सोमवार को किया और मंगलवार गुरुवार और शुक्रवार को मनाया जा सकता है, क्रमशः, और फिर शुक्रवार और शनिवार को सोमवार और मंगलवार को अवलोकन के लिए मंचन किया जा सकता है. फेनोटाइप (ओं) को हर दिन की जांच के आधार पर, एक सेट यौगिक सूक्ष्म से एक प्लेट 24 अच्छी तरह से शामिल हो सकता हैscopy या अधिक अगर फेनोटाइप जल्दी पहचान की है. इस प्रकार, एक सप्ताह में 88 कम से कम विभिन्न आरएनएआई प्रयोगों मनाया जा सकता है, खाते सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण और स्क्रीनिंग की दर में ले. एक विदारक गुंजाइश स्क्रीन बहुत तेजी से किया जा सकता है देखने के लिए स्लाइड पर जानवरों के बढ़ते के लिए आवश्यकता के बिना,. एकाधिक लोगों को भी चौंका देने वाला कार्यक्रम और / या एकाधिक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग द्वारा एक प्रयोगशाला के throughput बढ़ाने सकता है. अगर की एक पतली फिल्म पर जानवरों से बढ़ रही है और अगर की एक टुकड़ा पशुओं से युक्त देखने के लिए स्लाइड करने के लिए सीधे स्थानांतरित करने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति समय बचा सकते हैं. इस बदलाव का सफलतापूर्वक 400x बढ़ाई 22 पुरुष पूंछ असामान्यताएं स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था.

6. प्रतिनिधि परिणाम

GFP टैग DBL-1 के सामान्य और बदल स्थानीयकरण के उदाहरण 3 चित्र में दिखाया जाता है. GFP टैग DBL-1 की सामान्य अभिव्यक्ति उदर तंत्रिका कॉर्ड सेल के शरीर और punctae (चित्रा 3A) की एक पंक्ति शामिल है. मैं DBL - 1है गंभीर रूप से तनु जब जानवरों शाही सेना से तंग आ चुके हैं कि DBL-1 mRNA के अनुवाद रोकता (3B चित्रा) DBL-1. (आरएनएआई) भी छोटे जानवरों का उत्पादन, इस उदाहरण (नहीं दिखाया डेटा) में माध्यमिक स्क्रीन. जीन है कि DBL एक स्थानीयकरण प्रभावित आरएनएआई द्वारा इस स्क्रीन (चित्रा -3 सी) के लिए डिजाइन तनाव का उपयोग आसानी से पहचान कर रहे हैं.

चित्रा 1
आकृति 1. स्क्रीन योजना DBL-1 संकेतन की बाह्य नियामकों की पहचान करने के लिए. खिला पुस्तकालय से बैक्टीरिया रातोंरात बड़े हो रहे हैं, IPTG साथ प्रेरित, और एक अतिरिक्त 4 घंटे के लिए 37 ° सी में incubated रहे बैक्टीरिया डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) उत्पादन करने की अनुमति है. प्रेरित बैक्टीरिया संस्कृति की 30 μl प्रति अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से एन जी एम (निमेटोड विकास मध्यम) 25 μg / - मिलीग्राम कार्बेनिसिलिन और 1mm IPTG युक्त थाली पर देखा जाता है और एक बाँझ प्रवाह हुड में सूखे की अनुमति दी. हम हाइपोक्लोराइट के इलाज embr देने से पहले लार्वा चरण लार्वा (L1) मंचyos भोजन है, जो एक L1 diapause गिरफ्तार विकास लाती बिना मीडिया में पक्षियों के बच्चे हैं. आरएनएआई पुस्तकालय है, जो पशुओं का मंचन वृद्धि को फिर से शुरू करने के लिए और 23 जीवाणुओं द्वारा बनाई गई dsRNA उपभोग की अनुमति देता से लगभग 30 से सिंक्रनाइज़ L1 चरण जानवरों प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त बैक्टीरिया पर चढ़ाया जाता है. 15 डिग्री सेल्सियस, युवा वयस्क कीड़े दिखाई phenotype के लिए जांच कर रहे हैं पर 72 घंटे के बाद. इस उम्र में, शरीर के आकार दोष स्पष्ट कर रहे हैं और प्रतिदीप्ति texIs100 transgene अभिव्यक्ति से उज्ज्वल है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Phenotypes के उदाहरण के लिए स्क्रीनिंग से पहले पहचान. एक थाली में पशुओं के सभी छवियों को अच्छी तरह ही एक विदारक खुर्दबीन का उपयोग कर बढ़ाई ले जाया गया. पशु सब भूखे L1 के लार्वा के रूप में चढ़ाना के बाद के बारे में 72 घंटे imaged किया गया. सभी छवियों को समान रूप से इलाज किया गया. ए) आरएनएआई एक जीन है कि कोई सकल morphological दोष देता है. पशु जंगली प्रकार दिखाई देते हैं. बी) आर.एन.BLI-4 के ऐ. पशु गिरफ्तार विकास प्रदर्शित, और पैनल ए सी में पशुओं की तुलना में छोटे हैं) dpy-13 के आरएनएआई. पशु एक पैनल में जानवरों के रूप में विकास का एक ही स्तर पर कर रहे हैं, लेकिन एक "उदासी" शरीर आकारिकी प्रदर्शित.

चित्रा 3
चित्रा 3. Fluorescently टैग प्रोटीन के उदाहरण और विशिष्ट जीन की आरएनएआई कैसे स्थानीयकरण पैटर्न बदल. सभी छवियों 630x बढ़ाई कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी, 5 सेकंड के साथ ले जाया गया. जोखिम. पैमाने बार = 10 माइक्रोन. सभी छवियों को समान रूप से इलाज किया गया. ओपन तीर सेल शरीर से संकेत मिलता है. तीर punctae की लाइन के निशान. भरा तीर कुछ aberrantly स्थानीयकृत GFP टैग DBL-1 से संकेत मिलता है. ए) आरएनएआई खिलाया pseudogene C06C3.5 (जंगली प्रकार "). बी) के नियंत्रण DBL-1 (आरएनएआई). सी) एक सामान्य GFP टैग DBL-1 के स्थानीयकरण के लिए आवश्यक जीन की आरएनएआई.

"चित्रा चित्रा 4. 24 अच्छी तरह से प्लेट में आरएनएआई प्रयोगों (पुस्तकालय क्लोन) पर नज़र रखने के लिए टेम्पलेट उदाहरण. इस टेम्पलेट के प्रयोगों की एक स्थायी सीधे प्लेट लेबलिंग के विपरीत, रिकॉर्ड बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. रिकॉर्डिंग आरएनएआई phenotypes के लिए टेम्पलेट उदाहरण. विस्तार के रूप में की जरूरत है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

आरएनएआई स्क्रीनिंग विधि यहाँ प्रस्तुत जीन एक सामान्य (या ट्रांसजेनिक) के postembryonic phenotype के लिए आवश्यक उत्पादों की एक संवेदनशील और तेजी से विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. उदाहरण दिखाया एक प्रोटीन fluorescently टैग की subcellular स्थानीयकरण में शामिल जीनों के लिए एक स्क्रीन है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल के लिए ब्याज की अन्य postembryonic phenotypes को प्रभावित जीन की पहचान करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

यह विधि एक उम्मीदवार जीन दृष्टिकोण के एक आरएनएआई पुस्तकालय का उपयोग करके लाभ लेता है. आगे आनुवंशिक mutagenesis के तकनीक का उपयोग कर स्क्रीन बेतरतीब ढंग से प्रेरित किया उपन्यास alleles की पहचान है, लेकिन उन alleles पर्याप्त समय, प्रयास, और / या धन की आवश्यकता होती है के लिए 24 की पहचान. सीडीएनए लाइब्रेरी के साथ, दूसरे हाथ पर, सीडीएनए डालने के कारण होता है कि ब्याज की एक आरएनएआई phenotype के तेजी से उम्मीदवार जीन की पुष्टि के अनुक्रमण. इसके अलावा, क्लोनिंग के लिए तैयार सीडीएनए आवेषण पहचान उम्मीदवारों के बहाव के विश्लेषण की सुविधा. इसके अलावा जीन, कि घातक हैं जब उत्परिवर्तितपहचाना जा सकता है और आरएनएआई का उपयोग विश्लेषण. प्रेरित बैक्टीरिया पर रची पशुओं को रखने के द्वारा, इस विधि का जीन है कि यह भी महत्वपूर्ण भ्रूण भूमिकाओं के लिए postembryonic दोषों का अवलोकन परमिट.

ध्यान रखना पुष्टि करते हैं कि मनाया पशुओं भूखे नहीं कर रहे हैं. भुखमरी जानवर के phenotype प्रभावित कर सकते हैं. यदि उपन्यास आरएनएआई phenotypes भूखे पशुओं में पहचान कर रहे हैं है, दोहराना पुष्टि करते हैं कि phenotype आरएनएआई और भुखमरी नहीं की एक परिणाम है. भुखमरी को रोकने के लिए, ताजा बैक्टीरिया है कि स्थिर चरण (विकास मध्यम "बादल" बहुत है) हो गया है का उपयोग करें, और केवल ~ अच्छी तरह से 30 प्रतिशत पशुओं का उपयोग करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों DBL 1 सीडीएनए और एक इंजेक्शन मार्कर के लिए डॉ. क्रिस्टोफर Rongo (Waksman संस्थान, Rutgers विश्वविद्यालय, न्यू जर्सी) के उपहार के लिए डा. रिक Padgett (Waksman संस्थान, Rutgers विश्वविद्यालय, न्यू जर्सी) को धन्यवाद देना चाहूंगा. डा. बार्थ अनुदान प्रयोगशाला GFP टैग DBL-1 का निर्माण कम प्रतिलिपि संख्या एकीकरण के लिए जीन बंदूक बमबारी प्रदर्शन किया. रेने गार्सिया प्रयोगशाला texIs100 के निर्माण के दौरान तकनीकी सहायता प्रदान की है. रेने गार्सिया, Robyn Lints के के, Hongmin और किन प्रयोगशालाओं उत्पादक सलाह प्रदान की है. यह काम शुरू हुआ धन द्वारा TAMHSC सेलुलर और आण्विक चिकित्सा विभाग से वित्त पोषित किया गया था. परिसर गुंजाइश और कताई डिस्क confocal विभाग और चिकित्सा डीन के कार्यालय की TAMHSC कॉलेज द्वारा प्रदान की गई धनराशि के साथ खरीदे थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NGM Agar Nematode growth medium IPM Scientific, Inc Can be prepared following NGM agar protocol25
M9 Medium 22mM KH2PO4,
42mM Na2HPO4,
86mM NaCl,
1 mM MgSO4
Agar-Agar EMD Millipore 1.01614.1000 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter).
Bacto Peptone BD Biosciences 211677 0.25%
IPTG Research Products International Corp. I56000-5.0 1 mM final concentration
carbenicillin Research Products International Corp. C46000-5.0 50 μg/ml working dilution
LB Broth Lennox BD Biosciences 240230 20 g/liter
tetracycline Sigma-Aldrich 268054 12.5 μg/ml working dilution
sodium hypochlorite Any Supplier 5% household bleach Use fresh bleach.
sodium hydroxide Any Supplier CAS 1310-73-2 5 N stock
M9 medium Wormlab Recipe Book http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab 26
levamisol Sigma-Aldrich 31742 100 μM - 1 mM working dilution
sodium azide Fisher Scientific S227 10 mM in M9 working dilution
24-well plate Greiner Bio-One 662160 VWR distributor
microscope slides Any Supplier 75 x 25 x 1 mm
microscope cover slips Any Supplier 22 x 22 mm No.1.5 Use the thickness recommended by the microscope manufacturer.
compound microscope Carl Zeiss, Inc. A1m Use objectives and filters to match the needs of the experiment.
media pump Manostat Varistaltic pump Kate model #72-620-000 Use tubing and settings appropriate for the machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
  2. Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
  3. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
  4. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  5. Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
  6. Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
  7. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
  8. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  9. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  10. Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
  11. Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetics. , (2011).
  12. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
  13. Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
  14. Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  15. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  16. Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetics. , 129-195 (1991).
  17. Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
  18. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  20. Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
  21. Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
  22. Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
  23. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  24. Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
  25. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Tags

विकास जीवविज्ञान 60 अंक आरएनएआई पुस्तकालय स्क्रीन,
आरएनएआई स्क्रीनिंग में Postembryonic phenotypes पहचानें<em> सी. एलिगेंस</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi … More

Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442, doi:10.3791/3442 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter