Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans Published: February 13, 2012 doi: 10.3791/3442
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M University System Health Science Center

Summary

Vi beskriver en sensitivisert metode for å identifisere postembryonic regulatorer av protein uttrykk og lokalisering i

Abstract

C. elegans har vist seg å være en verdifull modell system for oppdagelsen og funksjonell karakterisering av mange gener og gen stier 1. Mer sofistikerte verktøy og ressurser for studier i dette systemet legger til rette for fortsatt funn av gener med mer subtile fenotyper eller roller.

Her presenterer vi en generalisert protokoll vi tilrettelagt for identifisering C. elegans gener med postembryonic fenotyper av interesse å bruke RNAi to. Denne prosedyren er enkelt endres til analysen fenotypen av valget, enten ved lys eller fluorescens optikk på en dissekere eller sammensatt mikroskop. Dette screening protokollen kapitaliserer på de fysiske eiendeler i organismen og molekylære verktøy C. elegans forskningsmiljøet har produsert. Som et eksempel, demonstrerer vi bruk av en integrert transgenet som uttrykker en fluorescerende produkt i en RNAi skjermen for å identifisere gener som kreves for normal lokalisering av denneprodukt i sent stadium larver og voksne. Først brukte vi en kommersielt tilgjengelig genomisk RNAi bibliotek med full lengde cDNA innsatser. Dette biblioteket muliggjør rask identifisering av flere kandidater ved RNAi reduksjon av kandidaten genproduktet. Second, genererte vi en integrert transgenet som uttrykker vår fluorecently tagget protein av interesse i en RNAi-sensitive bakgrunn. Tredje, ved å utsette klekket dyr til RNAi, tillater dette skjermbildet identifisering av genprodukter som har en viktig embryonale rolle som ellers ville maskere en post-embryonisk rolle i regulering av protein av interesse. Til slutt bruker denne skjermen et sammensatt mikroskop utstyrt for enkelt celle oppløsning.

Protocol

1. Screening belastning konstruksjon

Den forsiktige utformingen av screening belastning er kritisk for suksess på skjermen og har blitt beskrevet tidligere tre. For noen forskere, bruker en påkjenning som uttrykker en synlig produkt fra en transgenet nødvendig for forsøket. Mange stammer huser integrerte transgener er tilgjengelige fra CGC eller individuelle forskere. Hvis en transgen belastningen er nødvendig for skjermen, men er ikke tilgjengelig, så det kan genereres ved hjelp av en publisert metode som bombardement 4, UV / TMP 5, eller Mos transposon innsetting 6. For å visualisere vår protein av interesse, satt vi GFP-kodende sekvens i ramme med modne cDNA sekvensen (vi brukte dbl-1 sekvens). Fordi denne GFP fusjon proteiner er ikke synlig ved dissekere omfang, brukte vi en coinjection markør som var synlig og påvirket ikke visning av vår protein av interesse (TTX-3P :: RFP 7). Deretter har vi laget en integrert transgenet fra extrachromosomal array. Vi fant at bombardement av transgene ga en lav-kopi nummer integrert linje som verken reddet dissekere mikroskop fenotypen eller produseres synlige nivåer av GFP-merket produkt (Beifuss og Gumienny, upublisert). UV / TMP integrering av flere eksemplar extrachromosomal array opprinnelig laget ved injeksjon 8,9 ga synlig, redning nivåer av transgene produkt (figur 3A). Western blot med anti-GFP antistoff bekreftet at transgene (allelet navn texIs100) uttrykkes og behandles riktig (Beifuss og Gumienny, upublisert). Integrerte transgener bør outcrossed fem ganger for å fjerne overflødig bakgrunn mutasjoner uansett kilde.

For skjermen vår, ville vi bare protein av interesse til å være transgene, tagget form. Derfor fjernet vi den funksjonelle endogene gene ved å innføre en tap-av-funksjon mutant dbl-1 allel.

Til slutt, vi sensitivisert belastningen for virkningene av RNAi. Den RNAi fra biblioteket vil for mange gener, produsere en mer alvorlig reduksjon i genproduktet hvis dyrene inneholder en mutasjon som sensitizes dyrene til virkningene av RNAi 10,11 Vevet (e) av interesse bør vurderes når man velger en passende RNAi allergifremkallende bakgrunn 11. Vi brukte den kanoniske RRF-3 (pk1426) allelet for å gjøre vår screening belastning. RRF-3 er en RNA-directed RNA polymerase (RdRP) homolog som normalt hemmer somatisk RNAi 10. Mutasjoner i andre RNAi hypersensitizing gener som eri-1 eller eri-1 LIN-15b kan brukes i stedet for å øke effektiviteten av RNAi 11-13.

Den screening belastningen vi gjorde har genotype RRF-3 (pk1426); texIs100, dbl-1 (nk3).

2. Velge og forbereder enRNAi bibliotek

Kommersielt tilgjengelig C. elegans cDNA bibliotekene utgjør ca 55% eller 87% av den anslåtte gener i C. elegans individuelt (Vidal lab eller Ahringer lab biblioteker, henholdsvis). Individuelle kloner er tilgjengelig for kjøp (Open Biosystems, Geneservice, Ltd). Vi valgte ORF-RNAi bibliotek konstruert av Vidal lab (Open Biosystems) fordi kloner er stort sett full lengde cDNAs Gateway klonet og klar for nedstrøms applikasjoner (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California). Den opprinnelige Ahringer lab genomisk cDNA bibliotek inneholder cDNA fragmenter som ikke er så mye nyttig for nedstrøms karakterisering eksperimenter 14,15. Begge bibliotekene bruker en vektor som inneholder to T7 arrangører flankerer innsatsen (figur 1). Begrepene er dyrket i bakteriestammen HT115, som uttrykker T7 polymerase ved induksjon av isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Bakterier som inneholder bibliotek kloner er indusert med IPTG tilprodusere dsRNA (se trinn 3.4).

Dupliser hele biblioteket ved mottak og bruk den dupliserte for alle eksperimenter. De originale og like bibliotekene bør lagres i ulike -80 ° C frysere som er koblet til å skille elektriske linjer.

3. Utarbeidelse av bakterier med bibliotek kloner

  1. (Innen to måneder etter forsøket) Streak bakterier fra utvalgte fôring bibliotek kloner, samt positive og negative kontroller, på merket LB-carbenicillin / tetracyclin plater vi vokse 8 kulturer per 100 mm plate) og inkuber ved 37 ° C over natten ( > 16 timer) (figur 1). For hver 24-brønn plate, bruker vi to kontroller. Den positive kontrollen, BLI-4 (K04F10.4), produserer en doseavhengig post-embryonale pheontype 16,17. Den negative kontrollen, C06C3.5, er en predikert pseudogene ( WormBase.org ) som forårsaker ingen observerte fenotyper (Beifuss og Gumienny, upublisert). (Innen to måneder etter forsøket, helst før) Forbered 24-vel nematode vekstmedium (NGM) plater som inneholder 25 - 50 mikrogram / ml carbenicillin og 1mm IPTG. Oppbevares ved 4 ° C.
  2. (Dag 1) For hver klone, vaksinere 2 ml LB medier som inneholder 50 mikrogram / ml carbenicillin med en enkelt koloni fra stripete plate (r) (i trinn 3.1) ved hjelp av standard steril teknikk. Inkuber ved 37 ° C over natten (> 16 timer) i en shaker satt til 220-240 rpm (figur 1). Løsningen bør være klart etter 16 timer.
  3. (Dag 2) Det neste morgen, indusere doble strandet RNA (dsRNA) produksjon ved å legge IPTG til kulturer til en endelig konsentrasjon på 1mm. Inkuber kulturer ved 37 ° C, 220 - 240 rpm, for en ytterligere 4 - 5 timer. Dette trinnet sikrer en mer konsekvent og robust RNAi-indusert knockdown av genproduktet enn å stole utelukkende på IPTG i agar av NGM plate (i trinn 3.5).
  4. Spot 30 mL av hver induserte bakterielle culture i separate brønner på en 24-brønns NGM RNAi plate som inneholder 25 - 50 mikrogram / ml carbenicillin og 1mm IPTG (figur 1, se figur 4 for malen brukes til å spore RNAi eksperimenter). Sett plater, avdekket, i et sterilt flyt hette i 20 minutter eller til de bakterielle stedene er tørre. Ikke Overtørkingsbeskyttelse. Uttørring fører til at kantene på agar for å trekke vekk fra platen og dyr vil være uopprettelig hvis de kryper inn i de resulterende sprekkene.

4. Utarbeidelse av nematoder

Start med en iscenesatt befolkning på nematoder. Staging dyr minsker sjansen for at forskjellene observert mellom kontroll og eksperimentelle RNAi forsøkene er rett og slett skyldes forskjeller i utviklingsstadiet av dyrene (men hvis RNAi fører til en forsinket utvikling, bør dette noteres av Screener (figur 2)) . Videre starter RNAi eksperimentere med L1 larver obviates mulige konfunderende effekter av embryonale letalitet ved RNAi av genes som også kan spille postembryonic roller av interesse.

Staging gjøres ved første bleking en blandet-trinns bestanden av screening stammen, som bare eggeskall-beskyttede embryoer overleve. Dette scener dyr til innen ca 12 timer ved 20 ° C eller ca 18 timer ved 16 ° C 18. For mer tett stadium dyr, arrestere dyr i første larvestadiet (L1) ved å la embryoer luke i M9 medium uten mat. Sultet L1 dyr plasseres på mat CV vekst fra samme start alder 19.

  1. (Dag 1) Bruk tre 100 mm plater av fôret, rene screening belastningsskader dyr som inneholder Gravid voksne og befruktede egg. Vask dyr fra plater ved hjelp av sterile M9 av pipeting væske over platen overflaten forsiktig for å løsne dyr og embryoer. Overfør vask i en steril 15 ml tube med skrukork.
  2. Hvis vask er større enn 3,5 ml, spinner ned dyrene (~ 3000 rpm i 30 sekunder) og fjerne væske til 3,5 ml. Hvis vask er lESS enn 3,5 ml, tilsett H 2 0 eller M9 til røret til totalt 3,5 ml.
  3. Bruk egnet verneutstyr (frakk, hansker og beskyttelsesbriller) mens bruk av kjemikalier. Bland 0,5 ml 5 N NaOH med 1 ml fersk blekemiddel (5% natriumhypokloritt, mindre enn 1 år gammel). Legg denne blandingen til 3,5 ml nematode vask. Start en tidtaker telle opp. Denne prosessen bør ikke ta mer enn 10 minutter. Hvis den gjør det, da embryo vil bli satt i fare, og yield kan reduseres, eller blekemiddel er gammelt og bør byttes.
  4. Vortex røret i ca 10 sekunder. Gjenta virvling annethvert minutt for 4 til 10 minutter. Etter hver virvling, observere løsningen under en dissekere rom for dyreskrotter.
  5. Når embryoer blir frigitt og voksne er fragmentert (6 - 8 minutter), pellets embryoene ved å snurre røret i en bordplate sentrifuge (~ 3000 rpm, 30 sekunder).
  6. Sug så mye av supernatanten som mulig uten å forstyrre pelleten. Vær forsiktig, ikkegrådig.
  7. Legg steril M9 til ~ 10ml. Vortex kort eller rist godt å resuspendere pelleten.
  8. Spinn og fjern supernatanten igjen. Dersom lukten av blekemiddel kan påvises i røret, gjenta skyll som nødvendig.
  9. Resuspender embryo i 10 - 15 ml sterilt M9 og overføring til en liten (25 ml) erlenmeyerkolbe (for lufting). Rist ved riktig temperatur for belastningen og eksperimentere (15 - 25 ° C) over natten (> 16 timer ved 20 ° C). I denne tiden vil dyrene alle klekkes og arrest i L1 diapause.
  10. (Dag 2) Spinn ned L1 sceniske dyr i en 15 ml tube og resuspender i 0,5 - 1 ml M9 (~ 3000 rpm, 30 sek.). Plasser 5 mL løsning på en egen plate, og telle antall dyr. Foreta justeringer i volum, om nødvendig, å gi 30 ormer / 3 - 10 mL løsning.
  11. Spot ca 30 hypoklorittoppløsninger synkroniserte L1 sceniske dyr på bakterier i hver brønn av den tilberedte 24-brønn plate. For mange more enn 30 dyr per brønn kan resultere i at befolkningen sulter før de nådde modenhet. La platen tørke med lokk skjevt. Sett på lokket og fest den med en strikk. Vend platen og legg den på riktig temperatur for den tiden som trengs for å score på ønsket tidspunkt. Fordi RRF-3 (pk1426) er en temperatur følsom allel, ble våre screening belastningsskader dyrene dyrket ved 15 - 17 ° C i tre til fire dager for å observere L4 til voksne stadiet dyr (Figur 1).

5. Observasjon av nematoder

(Dag 5) Når nematoder har vokst til ønsket scene (figur 2a), bekrefter at de positive og negative kontroller produsere de forventede fenotyper ved hjelp av en dissekere mikroskop. Vi bruker BLI-4 som en kontroll for RNAi effekt, fordi den produserer doseavhengige post-embryonale defekter som spenner fra blemmer voksne (mild RNAi fenotype, ikke vist) til utviklingshemmede arrestert, bittesmå larver (sterk, expected RNAi fenotype) (figur 2B). Så observere dyrene i hver eksperimentell brønn med dissekere mikroskop og note åpenbare unormale fenotyper indusert av RNAi (Figur 2C). Etter kontrollene er bekreftet og brutto fenotyper bemerket, skjerme de RNAi eksperimenter for fenotyper av interesse. Vi bruker et sammensatt mikroskop utstyrt med fluorescens og en 63x mål å observere minst fem dyr fra hver RNAi eksperiment, som begynner med kontroller (figur 3).

  1. Forbered et lysbilde (standard 75 x 25 mm) ved å lage en 4% agar pad (4% agar i H 2 O). For å sikre en jevn tykkelse på agar pad, plassere et rent glass lysbilde mellom to avstandsstykker (hver spacer er laget av et objektglass med to lag av lab tape på det). Pipetter ca 100 mL (to til tre dråper fra et glass Pasteur pipette) av smeltet 4% agar på midten av rent glass lysbildet. Form en agar pad ved å dekke den smeltede agar med en ekstra lysbilde plassert raskt, men forsiktig på toppen av avstandsstykkene ennd smeltet agar. Utsett agar puten ved å skyve den glassplater fra hverandre, slik at puten å følge en lysbilde.
  2. Plasser en ~ 5 mL dråpe bedøvelse (levamisole eller natriumazid, for eksempel) på agar pad. Mount 8 - 12 dyr i narkosen. Dekk med en 22 x 22 mm # 1.5 dekkglass (eller tykkelsen på dekkglass best egnet for det sammensatte mikroskop) og observere dyrene ved hjelp av en sammensatt mikroskop.
  3. Record genet, antall dyr observert, og fenotype resultater for hver RNAi eksperiment. For en skjerm, lage og bruke en standard mal (se eksempel figur 5).
  4. Kontroller RNAi-produsert fenotype av en annen, sekundær fenotype, hvis mulig, og ved å gjenta eksperimentet. (For eksempel, vist i eksempelet skjermen brukes endring av GFP-merket DBL-1 lokalisering som en primær skjerm og kroppsstørrelse som en sekundær skjerm 20.) Bakterier kan brukes fra samme strek (lagret ved 4 º C) i inntil to måneder. Eldre striper kan result i dårlig vekst i likvide natten kulturer og bør restreaked først.
  5. Sequence minst den ene enden av cDNA innsatsen for å bekrefte at innsatsen matcher biblioteket etiketten (den Ahringer bibliotek har hatt en pålitelighetsanalyse utført, se http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/ ) 21. Anbefalt primere (for innstikk fra enten bibliotek) anneal på nettsteder i L4440-avledet vektor og flanke innstikkstedet: 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3 'og 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (M13f20 primer).

Ved hjelp av denne metoden, kan en enkelt person rimelig scenen og observerer to til fire sett av eksperimenter hver uke. For eksempel, iscenesatt dyr på mandag og tirsdag kan observeres torsdag og fredag, henholdsvis, og kan igjen bli avholdt på fredag ​​og lørdag til mandag og tirsdag observasjon. Avhengig av fenotypen (e) screenes hver dag, kan et sett omfatte en 24-brønns plate med sammensatte mikroscopy eller mer dersom fenotypen er raskt identifisert. Dermed kan minst 88 ulike RNAi eksperimenter bli observert i en uke, tar hensyn til positive og negative kontroller og hastighet av screening. En dissekere omfang skjermen kunne utføres mye raskere, uten behov for montering dyr på lysbilder for visning. Flere personer kan også øke en laboratoriets gjennomstrømning av svimlende tidsplaner og / eller bruke flere mikroskoper. En alternativ metode for dyrking av dyr på en tynn film av agar og forflytning av en bit av agar inneholder dyrene direkte til et lysbilde for visning kan spare tid. Denne variasjonen ble brukt til screening mannlige hale unormalt ved 400x forstørrelse 22.

6. Representative Resultater

Eksempler på normal og endret lokalisering av GFP-merket DBL-1 er vist i figur 3. Normal uttrykk for GFP-merket DBL-1 omfatter ventrale nerve ledningen celle organer og en rad av punctae (figur 3A). DBL-1 is sterkt svekket når dyrene fôres RNA som hindrer dbl-1 mRNA oversettelse (Figur 3B). dbl-1 (RNAi) produserer også små dyr, den sekundære skjermen i dette eksempelet (data ikke vist). Gener som påvirker DBL-1 lokalisering er lett identifiseres ved RNAi bruke en påkjenning designet for denne skjermen (Figur 3C).

Figur 1
Figur 1. Screen ordningen til å identifisere ekstracellulære regulatorer av DBL-1 signalering. Bakterier fra fôring biblioteket er vokst over natten, indusert med IPTG, og inkuberes ved 37 ° C i ytterligere 4 timer å la bakterier til å produsere dobbelt strandet RNA (dsRNA). 30 mL av den induserte bakteriekultur er flekket per brønn på en 24-brønns NGM (nematode vekst medium) plate som inneholder 25 mikrogram / ml carbenicillin og 1mm IPTG og lov til å tørke i et sterilt flyt hette. Vi iscenesette første larvestadiet (L1) larver ved å la hypokloritt-behandlet embryos klekkes i media uten mat, som induserer en L1 diapause (pågrepet utvikling). Omtrent 30 synkroniserte L1 sceniske dyr er belagt på hver brønn inneholder bakterier fra RNAi bibliotek, som tillater iscenesatt dyr å gjenoppta vekst og å konsumere dsRNA skapt av bakterier 23. Etter 72 timer ved 15 ° C, de unge voksne ormer blir undersøkt for en synlig fenotype. I denne alderen, kroppsstørrelse defekter er tydelig og fluorescens er lys fra texIs100 transgene uttrykk.

Figur 2
Figur 2. Eksempler på fenotyper å identifisere før screening. Alle bilder av dyr i en plate vel ble tatt på samme forstørrelse med en dissekere mikroskop. Dyrene ble alle fotografert ca 72 timer etter plating som utsultet L1 larver. Alle bildene ble behandlet likt. A) RNAi av et gen som gir ingen brutto morfologiske defekter. Dyr vises vill type. B) RNAi av BLI-4. Dyr vise arrestert utvikling, og er liten i forhold til dyrene i panel A. C) RNAi av dpy-13. Dyr er på samme utviklingstrinn som dyr i panel A, men vise en "dumpy" kropp morfologi.

Figur 3
Figur 3. Eksempler på fluorescently tagget protein og hvordan RNAi av spesifikke gener endrer lokalisering mønster. Alle bildene ble tatt på 630x forstørrelse med spinning disk konfokalmikroskopi, 5 sek. eksponering. Scale bar = 10 mikrometer. Alle bildene ble behandlet likt. Åpne pilspisser indikerer celle organer. Piler markere linjen punctae. Fylte pilspisser indikere noe abnormt lokaliserte GFP-merket DBL-1. A) RNAi-matet pseudogene C06C3.5 ("villtype"). B) dbl-1 (RNAi) kontroll. C) RNAi av et gen som kreves for normal lokalisering av GFP-merket DBL-1.

"Figur Figur 4. Mal eksempel for sporing RNAi eksperimenter (bibliotek kloner) i 24-brønns plater. Denne malen kan brukes til å lage en permanent registrering av forsøkene, i motsetning til direkte merking plater.

Figur 5
Figur 5. Mal eksempel for opptak RNAi fenotyper. Utvid etter behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den RNAi screening metoden presentert her gir en sensitiv og rask analyse av genprodukter som kreves for en normal (eller transgen) postembryonic fenotype. Eksempelet som vises er en skjerm for gener som er involvert i subcellulære lokalisering av en fluorescently tagget protein. Men dette kan protokollen endres for å identifisere gener som påvirker andre postembryonic fenotyper av interesse.

Denne metoden utnytter en kandidat genet tilnærming ved hjelp av en RNAi bibliotek. Videresend genetiske skjermer bruker mutagenese teknikker identifisere tilfeldig indusert romanen alleler, men disse allelene kreve betydelig tid, krefter og / eller midler til å identifisere 24. Med cDNA bibliotek, derimot, sekvensering av cDNA innsatsen som forårsaket en RNAi fenotype av interesse raskt bekrefter kandidaten genet. Også kloning-klare cDNA settes lette nedstrøms analyser av de identifiserte kandidatene. Videre gener som er dødelig når mutertkan identifiseres og analyseres ved hjelp av RNAi. Ved å plassere klekket dyr på de induserte bakterier, tillater denne metoden observasjon av postembryonic defekter i gener som også har viktige embryonale roller.

Vær nøye med å bekrefte at observerte dyr ikke er utsultet. Sult kan påvirke fenotypen av dyret. Hvis romanen RNAi fenotyper er identifisert i sultne dyr, gjenta for å bekrefte at fenotypen er et resultat av RNAi og ikke sult. For å hindre sult, bruker friske bakterier som har blitt dyrket til stasjonær fase (vekstmediet er veldig "overskyet"), og bruk kun ~ 30 dyr per brønn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Dr. Rick Padgett (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) for gave dbl-1 cDNA og Dr. Christopher rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) for en injeksjon markør. Dr. Barth Grants lab utført genet pistolen bombardementet for lavt kopi nummer integrering av GFP-merket dbl-1 konstruksjon. Den René Garcia laboratoriet gitt teknisk assistanse under opprettelsen av texIs100. Den René Garcia, Robyn Lints, og Hongmin Qin laboratorier gitt produktiv råd. Dette arbeidet ble finansiert av oppstart midler fra TAMHSC Institutt for molekylær-og Cellular Medicine. Den sammensatte omfang og spinning disk confocal ble kjøpt med midler gitt av instituttet og TAMHSC College of Medicine kontor Dean.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NGM Agar Nematode growth medium IPM Scientific, Inc Can be prepared following NGM agar protocol25
M9 Medium 22mM KH2PO4,
42mM Na2HPO4,
86mM NaCl,
1 mM MgSO4
Agar-Agar EMD Millipore 1.01614.1000 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter).
Bacto Peptone BD Biosciences 211677 0.25%
IPTG Research Products International Corp. I56000-5.0 1 mM final concentration
carbenicillin Research Products International Corp. C46000-5.0 50 μg/ml working dilution
LB Broth Lennox BD Biosciences 240230 20 g/liter
tetracycline Sigma-Aldrich 268054 12.5 μg/ml working dilution
sodium hypochlorite Any Supplier 5% household bleach Use fresh bleach.
sodium hydroxide Any Supplier CAS 1310-73-2 5 N stock
M9 medium Wormlab Recipe Book http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab 26
levamisol Sigma-Aldrich 31742 100 μM - 1 mM working dilution
sodium azide Fisher Scientific S227 10 mM in M9 working dilution
24-well plate Greiner Bio-One 662160 VWR distributor
microscope slides Any Supplier 75 x 25 x 1 mm
microscope cover slips Any Supplier 22 x 22 mm No.1.5 Use the thickness recommended by the microscope manufacturer.
compound microscope Carl Zeiss, Inc. A1m Use objectives and filters to match the needs of the experiment.
media pump Manostat Varistaltic pump Kate model #72-620-000 Use tubing and settings appropriate for the machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
  2. Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
  3. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
  4. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  5. Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
  6. Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
  7. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
  8. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  9. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  10. Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
  11. Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetics. , (2011).
  12. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
  13. Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
  14. Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  15. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  16. Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetics. , 129-195 (1991).
  17. Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
  18. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  20. Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
  21. Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
  22. Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
  23. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  24. Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
  25. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Tags

Developmental Biology RNAi bibliotek skjerm, Postembryonic utvikling
RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i<em> C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi … More

Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442, doi:10.3791/3442 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter