Summary
Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem tarif
Abstract
C. elegans çok sayıda gen ve gen yolları 1 keşfi ve fonksiyonel karakterizasyonu için değerli bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Daha gelişmiş araçları ve bu sistemde çalışmaları için kaynakların daha ince fenotipleri veya rollere sahip genlerin sürekli keşif kolaylaştırır.
Burada biz C. tanımlamak için adapte genelleştirilmiş bir protokol sunmak RNAi 2 ile ilgi postembryonic fenotipleri ile elegans genleri. Bu işlem kolay olmadığını bir kesme veya bileşik mikroskop ışık veya floresan optik tarafından, tahlil tercih fenotipi değiştirilir. Bu tarama protokolü organizmanın fiziksel varlıkların ve moleküler araçlar C. istifade elegans araştırma topluluğu üretti. Bir örnek olarak, bu normal Lokalizasyon için gerekli olan genlerin tanımlanması için bir RNAi ekranda bir floresan ürünü ifade entegre bir transgen kullanımını göstermektedirgeç dönem larva ve yetişkinlerde ürün. İlk olarak, tam uzunluktaki cDNA uçları ile ticari olarak mevcut genomik RNAi kütüphanesi kullanılabilir. Bu kütüphane aday gen ürününün RNAi indirgenmesiyle birden aday hızlı bir şekilde tespit kolaylaştırmaktadır. İkincisi, biz bir RNAi duyarlı arka planda ilgi bizim fluorecently tagged proteini ifade eden bir entegre transgen oluşturulur. Üçüncüsü, RNAi için yumurtadan hayvanların teşhir ederek, bu ekran aksi ilgi protein düzenleyen bir post-embriyonik rolünü maskeleyeceği hayati bir role sahip embriyonik gen ürünlerinin belirlenmesi izin verir. Son olarak, bu ekran tek hücre çözümü için donanımlı bir bileşik mikroskop kullanır.
Protocol
1. Eleme gerginlik inşaat
Tarama suşunun dikkatli tasarım ekran başarısı için kritik öneme sahiptir ve başka 3 tarif edilmiştir. Bazı araştırmacılar için, transgen görünür bir ürünü ifade eder bir suşu kullanarak deney için gereklidir. Entegre transgenlerin barındıran birçok suşları CGC veya bireysel araştırmacılar mevcuttur. Bir transgenik suşu ekran için gerekli ama mevcut değildir, o zaman bombardıman 4, UV / TMP 5 veya Mos transpozon ekleme 6 gibi bir yayınlanan yöntemi kullanılarak oluşturulabilir. Ilgi bizim proteini canlandırmak için, (yanlarından dbl-1 dizisi kullanılabilir) olgun cDNA sekansı ile çerçeve gfp-kodlama sekansı eklenir. Bu GFP füzyon proteini kapsamı Anatomi ile görünmez olduğu için, görünür olan bir coinjection belirteç kullanılan ve ilgi bizim protein inceleyen etkilemedi (TTX-3p :: rfp 7 bakınız. Daha sonra ekstrakromozomal diziden entegre transgen yarattı. Biz transgen bu bombardımanı ne (Beifuss ve Gumienny, yayınlanmamış) mikroskop fenotipi kurtarıldı ne de GFP-etiketli ürün görünür düzeyde üretilen düşük kopya sayısı entegre hat vermiştir bulundu. Başlangıçta enjeksiyon 8,9 tarafından üretilen bir ekstrakromozal kopya birden dizisinin UV / TMP entegrasyon transgen ürünün seviyeleri (Şekil 3A) kurtarmak, görünür elde edilmiştir. Anti-GFP antikoru ile Western Blot transgen (allel adı texIs100) ifade ve (Beifuss ve Gumienny, yayınlanmamış) doğru işlenir doğruladı. Entegre transgenlerin olursa olsun kaynağı yabancı arka plan mutasyonlar kaldırmak için beş kez outcrossed edilmelidir.
Bizim ekran için, ilgi sadece protein transgenik, etiketli formu olmak istedim. Bu nedenle, fonksiyonel bir endojen g çıkarıldıbir kayıp fonksiyon-mutant dbl-1 alel tanıtarak ene.
RNAi etkilerine Son olarak, duyarlı süzün. Hayvanların uygun bir seçerken ilgi doku (lar) düşünülmelidir RNAi 10,11 etkilerine hayvanlar duyarlaştırır bir mutasyon içeriyorsa kütüphaneden RNAi, çok sayıda gen için, gen ürünü bir daha ciddi azalma üretecek RNAi arka 11 hassasiyet. Biz tarama gerginlik yapmak için kurallı rrf-3 (pk1426) alel kullanılır. RRF-3 normal somatik RNAi 10 inhibe eden bir RNA-yönelimli RNA polimeraz (RdRP) homolog olduğunu. Eri-1 veya eri-1 lin-15b gibi diğer RNAi hypersensitizing genlerindeki mutasyonlar RNAi 11-13 etkinliğini artırmak yerine kullanılabilir.
TexIs100;; dbl-1 (NK3) yaptığımız tarama suşu genotip rrf-3 (pk1426) sahiptir.
2. Seçimi ve hazırlanmasıRNAi kütüphane
Ticari olarak mevcut C. elegans cDNA kütüphanelerinden C'de tahmin edilen genlerin yaklaşık% 55 veya% 87 temsil elegans bireysel (Vidal laboratuar veya Ahringer laboratuar kütüphaneler, sırasıyla). Bireysel klonlar alım (Açık Biosystems, Geneservice, Ltd) için kullanılabilir. Onun klonları çoğunlukla tam uzunlukta cDNAlarının Geçidi klonlanmış ve downstream uygulamaları (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) hazır çünkü Vidal laboratuar (Açık Biosystems) tarafından inşa ORF-RNAi kütüphane seçti. Orijinal Ahringer laboratuar genomik cDNA kütüphanesi aşağı karakterizasyon çalışmaları 14,15 için yaygın olarak yararlı değildir cDNA parçacıklarını içerir. Her ikisi kütüphane eki (Şekil 1) sınırdaş iki T7 promotor içeren bir vektör kullanın. Yapıları izopropil-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) indüksiyon üzerine T7 polimeraz ifade bakterinin HT115, yetiştirilmektedir. Kütüphane klonlarını içeren bakterilerin IPTG ile indüklenirdsRNA (Adım 3.4) üretirler.
Aldıktan sonra tüm arşivinizi çoğaltın ve tüm deneyler için yinelenen kullanın. Orijinal ve yinelenen kütüphaneler elektrik hatları ayırmak bağlı farklı -80 ° C derin dondurucularda muhafaza edilmelidir.
3. Kütüphane klonları ile bakteri hazırlanması
- Seçilen besleme kütüphane klon yanı sıra pozitif ve negatif kontroller, etiketli LB-karbenisilin / tetrasiklin tabaklarda (biz 100 mm plaka başına 8 kültürleri büyümek) den Streak bakteri (iki deney ay içinde) ve 37 ° C de bir gece (inkübe > 16 saat) (Şekil 1). Her 24-iyi plaka için iki kontrolleri kullanın. Pozitif kontrol, bli-4 (K04F10.4), doza bağımlı bir post-embriyonik pheontype 16,17 üretir. Negatif kontrol, C06C3.5, öngörülen bir sözde (yani WormBase.org hiçbir gözlenen fenotipleri (Beifuss ve Gumienny, yayınlanmamış) neden olur). 50 mcg / ml karbenisilin ve 1mM IPTG - (deney iki ay içinde, tercihen er) 25 içeren 24-iyi Nematodu Büyüme Orta (NGM) tabak hazırlayın. 4 ° C'de depolamak
- (Gün 1) Her klon, standart steril tekniği kullanarak damarlı plaka (lar) (Adım 3.1) tek bir koloni ile 50 mcg / ml karbenisilin içeren 2 ml LB medya aşılamak. 37 inkübe ° C de bir gece (> 16 saat) bir çalkalayıcı 220 set - 240 rpm (Şekil 1). Çözelti 16 saat sonra bulanık bir olmalıdır.
- (2 gün) Ertesi sabah, 1 mM nihai bir konsantrasyona kültürlere IPTG ilave edilerek RNA (dsRNA) üretimi çift indüklemek. 5 saat - ek bir 4 için 240 rpm, - 37 ° C'de, 220 de kültürler inkübe. Bu adımda NGM plakası (Basamak 3.5) ile agar sadece IPTG dayanarak daha gen ürününün daha tutarlı ve sağlam RNAi indüklenen demonte sağlar.
- Her kaynaklı bakteriyel cu Spot 30 ul50 mcg / ml karbenisilin ve 1mM IPTG (Şekil 1, RNAi denemeleri izlemek için kullanılan şablon için bakınız Şekil 4) - 25 içeren 24-iyi NGM RNAi plakası ayrı kuyulara lture. 20 dakika steril bir akış başlık veya bakteriyel lekeler kuru hale gelene kadar ortaya çıkarılan plakalar, koyun. Overdry yapmayın. Aşırı kurumasını agar kenarları sonuçlanan yarıklar şeklinde tarama halinde onarılamaz olacak plakası ve hayvanlar çekilmesine neden olur.
4. Nematodlar hazırlanması
Nematod aşamalı bir nüfus ile başlayın. Hayvanlar Sahneleme kontrol ve deney RNAi çalışmalar arasında görülen farklılıklar (RNAi bir gelişimsel gecikme neden olursa ancak, bu (Şekil 2) screener tarafından unutulmamalıdır) sadece hayvanların gelişim aşamasında farklılıklar nedeniyle olduğu olasılığını azaltır . Ayrıca, L1 larvaları ile RNAi deney başlangıç gen ile RNAi tarafından embriyonik letalitesinin potansiyel karıştırıcı etkileri ortadan kaldırıres olması da ilgi postembryonic roller oynayabilir.
Evreleme ilk tek yumurta kabuğu korumalı embriyoların hayatta tarama suşu, karışık bir dönem nüfus beyazlatma sağlanır. 20 ° C'de yaklaşık 12 saat veya 16 ° C'de 18 azından yaklaşık 18 saat içinde, bu aşamada hayvanlar. Için daha sıkı aşamada hayvanlar, gıda olmadan M9 ortamda embriyolar yumurtadan vererek ilk larva evresi (L1) tutuklu hayvanlar. Starved L1 hayvanlar 19 aynı başlangıç yaşı gıda özgeçmiş büyümesi üzerine yerleştirilir.
- (Gün 1) beslenen üç 100 mm plakalar, gravida yetişkin ve embriyo içeren temiz tarama suşu hayvan kullanın. Hayvanlar ve embriyo gevşetmek için yavaşça plaka yüzeyi boyunca sıvı pipeting tarafından steril M9 kullanarak plakalardan hayvanlar yıkayın. Vidalı kapaklı steril 15 ml tüp içine yıkama aktarın.
- Yıkama 3.5 ml büyükse, hayvanlar (30 saniye ~ 3000 rpm) aşağı spin ve 3.5 ml sıvı çıkarın. Yıkama l ise3.5 ml daha ess, 3.5 ml toplam tüp H 2 0 veya M9 ekleyin.
- Kimyevi maddeler ise uygun koruyucu giysiler (laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük) kullanın. 1 ml taze çamaşır suyu (% 5 sodyum hipoklorit, eski 1 yıldan az) ile 0,5 ml 5 N NaOH karıştırın. 3.5 ml nematod yıkama için bu karışımı ekleyin. Sayan zamanlayıcı başlatın. Bu işlem 10 dakikadan fazla sürmemelidir. Eğer, daha sonra embriyoların tehlikeye edilecek ve verim azalabilir veya çamaşır suyu eski ve değiştirilmesi gerekir.
- Yaklaşık 10 saniye Vortex tüp. Vorteksleme 4 ila 10 dakika boyunca her iki dakikada bir tekrarlayın. Her vorteksleme sonra, hayvan leşleri için bir kesme kapsamında çözüm gözlemlemek.
- Embriyo yayımlanan ve yetişkinler (6 - 8 dakika) parçalanmış Bir masa üstü santrifüj (~ 3000 rpm, 30 saniye) tüpün iplik tarafından pelet, embriyoların.
- Pelet bozmadan mümkün olduğu kadar çok süpernatan aspire. Dikkatli olun, değilaçgözlü.
- ~ 10ml steril M9 ekleyin. Vorteks kısaca veya pelletini iyi sallayın.
- Spin ve tekrar supernatant çıkarın. Çamaşır suyu kokusu tüp tespit edilebiliyorsa, gerekli durulama tekrarlayın.
- 10. Pastör pipetiyle embriyosu - 15 ml steril M9 ve küçük (25 ml) bir Erlenmeyer şişesinde (havalandırma için) transfer. Gece (20> 16 saat ° C). - Zorlanma ve deney için uygun sıcaklıkta (25 ° C 15) de Shake Bu süre içinde, tüm hayvanlara yumurtadan ve L1 diapause tutuklu.
- 1 ml M9 (~ 3000 rpm, 30 sn.) - (Gün 2) 0.5, 15 ml tüp ve Pastör pipetiyle L1 sahne hayvanlar aşağı Spin. Ayrı bir plaka üzerinde 5 uL çözüm yerleştirin ve hayvanların sayısını. 10 uL çözüm - gerekirse 30 solucanlar / 3 elde etmek için, ses ayarlamalar yapın.
- Hazırlanan 24-kuyulu plakanın her olarak bakteriler üzerinde yaklaşık 30 hipoklorit senkronize L1 aşaması hayvanları ayırt. Çok fazla moayrıca başına 30 hayvanlardan daha yeniden olgunluk ulaşmadan açlıktan nüfusu neden olabilir. Kapakları askew kuru plaka edelim. Kapağı yerine takın ve lastik bir bant ile tutturun. Plakası tersine ve istenen aşamada skor için gerekli süre için uygun bir sıcaklıkta yerleştirin. Rrf-3 (pk1426) bir ısıya duyarlı alel olduğu için, tarama gerginlik hayvanlar 15 yetiştirilmiştir - 17 ° C üç dört gün için yetişkin sahne hayvanlar (Şekil 1) L4 gözlemlemek.
5.. Nematodların Gözlem
Nematodlar istenen aşamada (Şekil 2A) büyüdü sonra (Gün 5), pozitif ve negatif kontrollerin bir mikroskop kullanılarak beklenen fenotipler üretirler onaylayın. Bu doza bağımlı bir post-embriyonik kusurları üretir, çünkü RNAi etkinlik için bir kontrol olarak bli-4 kullanmanız kabarmış yetişkin (hafif RNAi fenotipi gösterilmemiştir) aralık gelişimsel tutuklandı, küçük larvaları (güçlü, expected RNAi fenotip) (Şekil 2B). Sonra iyi RNAi (Şekil 2C) ile oluşturulan bir mikroskop ve not belirgin anormal fenotipleri kullanarak her bir deneysel hayvan gözlemlemek. Denetimleri doğruladı ve brüt fenotipleri belirtilmiştir sonra, ilgilenilen fenotipleri için RNAi deneyler gizliyorum. Biz denetimleri (Şekil 3) ile başlayan, floresans ve her RNAi deney en az beş hayvan gözlemlemek için bir 63x objektif ile donatılmış bir bileşik mikroskop kullanın.
- % 4 agar pad (H 2 O% 4 agar) yaparak bir slayt (standart 75 x 25 mm) hazırlayın. Agar pad üniform bir kalınlık sağlamak için, iki ara parçaları (her boşluk üzerinde laboratuvar bant iki kat olan bir mikroskop slayt yapılır) arasında temiz bir cam slayt yerleştirin. Temiz cam slayt merkezi üzerine erimiş% 4 agar 100 uL (cam pasteur pipeti iki ila üç damla) hakkında Pipet. Spacerların üst bir hızla fakat nazikçe yerleştirilmiş ek bir slayt kullanarak erimiş agar kaplayarak bir agar pedi Formund erimiş agar. Yavaşça pedi bir slayt bağlı kalarak bırakarak, apart cam slaytlar kaydırarak agar pad Açığa.
- Agar pad üzerinde bir anestezik ~ 5 uL damla (levamizol veya sodyum azid, örneğin) yerleştirin. Dağı 8 - anestezik 12 hayvan. 22 x 22 mm # 1.5 coverslip (veya en iyi bileşik mikroskop için uygun lameller kalınlığı) ve bileşik mikroskop kullanılarak hayvanlar gözlemlemek ile kaplayın.
- Her bir deney için kayda RNAi geni, gözlenen hayvan sayısı ve fenotip sonuçlanır. Bir ekran için, yapmak ve bir standart şablon (bkz. örnek, Şekil 5) kullanın.
- Mümkünse, ve deney yineleyerek, bir başka, ikincil fenotipi RNAi üretilen fenotip doğrulayın. (Örneğin, örnek ekranda ikinci bir ekran 20 olarak birincil ekran ve vücut ölçüleri gibi GFP-tagged DBL-1 yerelleştirme değiştirilmesi kullanılır gibi gösterilmektedir.) Bakteri kadar aynı çizgi (4 ° C'de saklanır) ile kullanılabilir iki ay. Eski çizgiler r olabilirSıvı gecede kültürlerde ve kötü büyüme esult ilk restreaked edilmelidir.
- Sıra en az bir ekleme kütüphane etiket (Ahringer kütüphane yapılan bir güvenirlik analizi olmuştur; görmek eşleşen doğrulamak için cDNA'nın sonu http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/ ) 21. 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3 've 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (M13f20 astar): önerilen primerler (ya kütüphanesinden uçlar için) L4440-türevi vektör ve yan ekleme sitesi sitelerde tavlama.
Bu yöntemi kullanarak, tek bir kişinin makul sahnelemek ve deneyler iki ila dört takım her hafta izleyebilirsiniz. Örneğin, hayvanlar Pazartesi günü sahnelenecek ve Salı günü ise, Perşembe ve Cuma görülebilir ve yine pazartesi ve salı gözlem için Cuma ve Cumartesi günleri sahnelenecek edilebilir. Her gün taranması fenotip (ler) bağlı olarak, bir dizi bileşik mikro tarafından bir 24-kuyulu plakalı içerebilecektirSkopi veya fenotip hızla tespit ise daha fazla. Böylece, en azından 88 farklı RNAi deneyler hesabı pozitif ve negatif kontroller ve tarama hızı dikkate alınarak, bir hafta içinde görülebilir. Bir kesme kapsamı ekran görüntüleme için slayt üzerinde hayvan montaj için gerek kalmadan, çok daha hızlı yapılabilir. Birden fazla kişi aynı zamanda birden fazla mikroskoplar kullanılarak şaşırtıcı programları ve / veya bir laboratuvar verimi artırabilir. Agar ince bir film üzerinde hayvan büyüyen ve görüntüleme için bir slayt doğrudan hayvanların bulunduğu agar bir dilim aktarmak için alternatif bir yöntem zamandan tasarruf edebilir. Bu varyasyon başarıyla 400x büyütme at 22 erkek kuyruk anormallikleri taranması için kullanılmıştır.
6. Temsilcisi Sonuçlar
GFP-etiketli DBL-1 normal ve değiştirilmiş Lokalizasyon örnekleri, Şekil 3 'de gösterilmiştir. GFP-tagged DBL-1 Normal ifade ventral sinir kordonu hücre gövdeleri ve punctae (Şekil 3A) bir satır içerir. DBL-1 is hayvanların RNA beslendiği zaman ciddi zayıflatılmış dbl-1 mRNA çeviri engeller (Şekil 3B). dbl-1 (RNAi) de, bu örnekte (veriler gösterilmemiştir), ikincil ekran küçük hayvanlar üretir. DBL-1 yerelleştirme etkileyen genler kolaylıkla Bu ekran (Şekil 3C) için tasarlanmış bir yük kullanarak RNAi ile tanımlanır.
Şekil 1.. Ekran düzeni DBL-1 sinyal dışı düzenleyiciler tanımlamak için. Besleme kütüphanesinden bakteriler, bir gece boyunca yetiştirilen IPTG ile uyarılan, ve bakteriler çift sarmal RNA (dsRNA) üretmek için izin vermek için ek bir 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Endüklenen bakteriyel kültür 30 ul 25 ug / ml karbenisilin ve 1 mM IPTG ihtiva eden bir 24-kuyucuklu NGM (nematodu büyüme medyumu) plakası üzerine sıra başına gördü ve steril bir akış davlumbaz kurumaya bırakılır. Biz hipoklorit ile tedavi edilen embr sağlayarak ilk larva evresi (L1) larvalarının sahneleyecekyo bir L1 diapause (tutuklandı geliştirme) indükler gıda olmadan medyada çıkar. Yaklaşık 30 senkronize L1 aşamasında hayvanların büyümesini devam ettirmek ve bakteriler 23 tarafından oluşturulan dsRNA tüketmek hayvanların sahnelenen sağlar RNAi kütüphane, her bir kuyunun içeren bakteriler üzerine kaplanır. 15 ° C, genç erişkin solucanlar görünür bir fenotip için taranmaktadır az 72 saat sonra. Bu yaşta, vücut büyüklüğü kusurları belirgindir ve floresan texIs100 transgen ifadeden parlak.
Şekil 2. Tarama öncesinde tanımlamak için fenotipleri örnekler. Bir tabak hayvanların tüm görüntüler iyi bir mikroskop kullanılarak aynı büyütme alındı. Hayvanlar bütün hasret L1 larva gibi kaplama sonrası 72 saat görüntülendi. Tüm görüntüler aynı şekilde tedavi edildi. A) Hiçbir brüt morfolojik bozukluk veren bir genin RNAi. Hayvanlar vahşi tip görünür. B) RNBli-4 Ai. Hayvanlar dpy-13 RNAi) tutuklandı gelişmeler gösteren ve paneli A. C hayvanlara kıyasla çok düşük. Hayvanlar panelinde bir hayvan gibi aynı gelişim aşamasında olan, ancak bir "bodur" beden morfolojiye sahiptir.
Şekil 3. Floresan etiketli protein örnekleri ve nasıl RNAi spesifik genlerin lokalizasyon desen değiştirir. Tüm görüntüler iplik Disk konfokal mikroskopi, 5 sn ile 630x büyütme alındı. pozlama. Ölçek çubuğu = 10 mikron. Tüm görüntüler aynı şekilde tedavi edildi. Açık ok uçları hücre gövdeleri göstermektedir. Oklar punctae hattı işaretleyin. Dolgulu ok uçları bazı aberrantly lokalize GFP-tagged DBL-1 gösterir. A) RNAi beslenen sözde C06C3.5 ("wild-tip"). B) dbl-1 (RNAi) kontrolü. C) GFP-tagged DBL-1 normal yerleşim için gerekli bir genin RNAi.
Şekil 4. 24-iyi plakaları RNAi deneyler (kütüphane klonlar) izlemek için Şablon örneği. Bu şablon, doğrudan levhalar etiketleme aksine deney kalıcı bir kayıt oluşturmak için kullanılabilir.
Şekil 5. Kayıt RNAi fenotipleri için Şablon örneği. Gerektiği gibi genişletin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan RNAi tarama yöntemi, normal bir (ya da transgenik) postembryonic fenotipi için gerekli gen ürünlerinin hassas ve hızlı bir analizi sağlar. Gösterilen örnek bir floresan etiketli proteinin hücre içi lokalizasyonu ilgili genler için bir ekran. Ancak, bu protokolün diğer ilgi postembryonic fenotipleri etkileyen genleri tanımlamak için değiştirilebilir.
Bu yöntem, bir RNAi kütüphanesi kullanarak bir aday gen yaklaşımı yararlanır. Mutagenez tekniklerini kullanarak İleri genetik ekranlar rastgele uyarılan romanı allel tespit, ancak bu alleller 24 tanımlamak için önemli bir zaman, çaba ve / veya fonlar gerektirir. CDNA kütüphanesi ile birlikte, diğer yandan, ilgilenilen bir fenotip RNAi hızla aday gen teyit neden cDNA ucun sekanslama. Ayrıca, klonlama hazır cDNA ekler belirlenen adayların aşağı analizleri kolaylaştırmak. Mutasyona uğramış zaman ölümcül Ayrıca, genbelirlendi ve RNAi kullanılarak analiz edilebilir. Endüklenen bakteriler üzerinde kuluçkadan hayvanlar yerleştirerek, bu yöntem ayrıca önemli bir rol oynarlar embriyonik genleri için postembryonic kusurların gözlem izin verir.
Gözlenen hayvanlar açlıktan olmadığını teyit etmek için özen gösterin. Açlık hayvanın fenotipi etkileyebilir. Roman RNAi fenotipleri aç hayvanlarda belirlenirse, fenotip RNAi değil açlıktan bir sonucu olduğunu onaylamak için tekrarlayın. Açlık önlemek için, sabit faz (besi çok "bulutlu" olduğu) için büyüdü edilmiş taze bakteri kullanıyoruz, ve iyi başına sadece ~ 30 hayvan kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar bir enjeksiyon işaretleyici için dbl-1 cDNA ve Dr Christopher Rongo (Waksman Enstitüsü, Rutgers Üniversitesi, NJ) ve hediye için Dr Rick Padgett (Waksman Enstitüsü, Rutgers Üniversitesi, NJ) teşekkür etmek istiyorum. Dr Barth Grant'ın laboratuvar gfp etiketli dbl-1 inşasının düşük kopya sayısı entegrasyonu için gen tabancası bombardımanı yapıldı. Rene Garcia laboratuar texIs100 oluşturulması sırasında teknik yardım sağladı. Rene Garcia, Robyn Lints ve Hongmin Qin laboratuarlar üretken tavsiye sağladı. Bu çalışma, Moleküler ve Hücresel Tıp TAMHSC Bölümü start-up fonları tarafından finanse edildi. Bileşik kapsamı ve iplik diske konfokal departmanı ve Dekan Tıp Ofisi TAMHSC Koleji tarafından sağlanan fonlar ile satın alındı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
||
| Agar-Agar | EMD Millipore | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | BD Biosciences | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma-Aldrich | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any Supplier | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Supplier | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any Supplier | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any Supplier | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 | Use tubing and settings appropriate for the machine |
References
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
- Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetics. , (2011).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
- Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetics. , 129-195 (1991).
- Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
