Summary
我们描述了协议使用
Abstract
RNA干扰是一个功能强大的方法来了解基因功能，尤其是当在整个基因组的规模和在定量的情况下进行。 在 C 线虫基因功能可以被撞倒，简单而有效地喂养与对应一个特定的基因1表达双链RNA的细菌的蠕虫。而RNAi技术克隆库的建立覆盖大部分的C.线虫基因组2,3开真正的功能基因组研究（例如4-7）的方式，最成熟的方法是费力。莫伊和他的同事们已经开发出了半自动化的协议，促进全基因组的屏幕8。该方法依赖于显微成像和图像分析。
在这里，我们描述为一种高通量的基因组全屏幕的替代协议，根据机器人细菌RNA干扰克隆，定量分析使用的COPAS的Biosort（联盟Biometrica（充氧））的处理，以及集成软件：MBioLIMS（MODUL生物实验室信息管理系统）技术，提供数据管理和样品跟踪吞吐量增加。该方法允许屏幕固体培养基平板上进行。这是特别重要的一些研究，如处理宿主-病原体相互作用在 C， 线虫 ，因为某些微生物不有效地感染蠕虫液体培养。
我们展示如何使用该方法可用于量化C.先天免疫在抗真菌基因的重要性线虫 。在这种情况下，该方法依赖于利用携带GFP的抗菌肽基因NLP 29的启动和红色荧光记者的控制下表皮感染诱导荧光报告基因，转基因的菌株组成，表示在表皮。后者提供了一个功能完整的表皮的内部控制和非特异性基因沉默9。当控制蠕虫是由真菌感染荧光绿色。 NLP 29日在感染后减弱荧光表达结果需要一个基因的RNAi击倒。目前，该协议允许每周进行测试和分析了3000多RNAi的克隆，开放在不到2个月的全基因组筛选的可能性。
Protocol
分为五个连续两天（图1）的步骤如下所述的协议。如上所述，某些步骤可以做到在不同的日子。每一个步骤，以及材料的数量所需的时间（如蠕虫病毒，细菌，媒体）将取决于每个实验治疗的96孔板。
第1天
1。 96 NGM的RNA干扰板的制备
改编自以下协议的蠕虫文化牌10的标准方法，其中包括不同的解决方案的杀菌技术细节。
- 10-12 96孔板，准备100毫升去离子H 2 O线虫的生长介质（NGM的）：1.7克BactoAgar g氯化钠，0.29，0.25克蛋白胨，100μL，胆固醇（5毫克/毫升的乙醇）。
- NGM的高压灭菌器（5分钟，在121°C的100毫升; 30分钟，在121°4升Ç），让它冷却，直到它在50℃（只是冷静ENOUGH持有）。重要的是，NGM的保持足够的热情，因此，它不巩固的。
- 地址：100毫升2.5毫升磷酸盐缓冲PH6（1M），100μL 硫酸镁 （1M）， 氯化钙 （1M），100μL，400μL，经IPTG（1M），100μL氨苄青霉素（100毫克/毫升），100μL四环素（12.5 mg / ml的乙醇）。
- 分发到每一个96平底板以及75μLNGM的。为了避免凝固的介质，它需要被免除迅速的，它是方便使用重复的饮水机（如Repeatman，Eppendorf公司）。一定有井目前没有气泡。
- 存放在潮湿室（如用湿纸巾在底部的特百惠盒子）板，立即在4°C
注：板可准备提前一个星期，并保存于4°C，这样可以使后续步骤的组织更容易。
2。自动编制96深井泵LB平板
- 在4°C，添加封面，每盘和存储为了跟踪每96孔板，一个独特的标签或条码应补充说，在这个阶段，或在其后。
注：板可准备提前2至3天，并保存于4°C，这样可以使后续步骤的组织更容易。
3。成长中的96深井泵LB平板（过夜培养）RNAi的细菌克隆
- 为便于后续处理，当原来的RNAi库克隆384的格式，第一再分配克隆到标签或条形码编码标准的96孔板含100微克/毫升安培LB和12.5微克/毫升ţ甘油（终浓度10％）等补充。当原来的384孔板不必在所有井的克隆，是最常用的“Ahringer”库的情况下，有几种选择，组织的女儿板。克隆可以重新分配，以便有没有空井子板。这可以最大限度地减少板到屏幕上。然而，理想的情况下，在复制过程中，每个子盘上几个井应为空，因此，这些随后可以填补与标准控制克隆（正面和负面的），促进跨板块比较。这些96的女儿板，然后用种子96深井泵LB平板过夜（ON）的文化。
所有液体处理步骤最好是用机器人液体处理系统（如Tecan公司），但可以进行手动使用，例如，一个96针复制。如果已经在96格式的RNAi库克隆到3.5加强。
第2天
4。种子的RNA干扰细菌克隆到96 NGM的RNAi技术板块
在文化，这一步应在上午进行。
- 从4 NGM的板96°C和让他们温暖和干燥无菌层流柜下为5-15分钟。不要离开太久引擎盖下（最长不超过30分钟）板，否则NGM的随后可能打击。加入适当的标签/条码，每块板。
- 检索培养皿从37°C 96-深井泵记录任何井空（空井是完全透明的）的立场，这些将被排除后续分析。
- 离心96深孔板5分钟在4000转。
- 转动盘大幅倒挂，干纸巾上的板块边缘迅速关闭上清提示。作为文化的重组菌，上清必须按照地方性法规（如蒸压）治疗。
- 悬浮细菌沉淀中残留的液体（约50微升），涡旋式，最好使用专用搅拌器（如Tecan公司），使每个板块正是收到同样的待遇。它是可以测量外径600每口井的规范正是为后续步骤中的细菌接种，但是这是不是必不可少的，我们不进行这样的检查。
- 转移到96 NGM的板使用的是8或12通道多吸取5μL的再悬浮的细菌。要小心，不要触摸或渗透的NGM的。手动执行此步骤，但可以使用机器人，如的Liquidator96（RAININ）优化，使96 RNA干扰克隆分布在一个步骤。
- 让细菌干燥，无菌层流柜下，定期检查，以避免NGM的变得过于干燥。这一步应该约需2小时。
- 在37°C孵育96 RNAi技术NGM的板在潮湿室。
5。准备一个同步的蠕虫人口
对于这一步，我们使用携带报告基因（S）的利益（如感染诱导的P级NLP-29 :: GFP结构，内部控制，构带够COL-12 ::红色荧光的转基因构造）的转基因蠕虫。因为随着时间的转基因表达的观察减少，我们解冻新鲜的批次，每6周的蠕虫。在使用前至少2代，我们文化的蠕虫，确保蠕虫以前从未检测饿死。如果该协议的第2天是星期二，我们准备9厘米NGM的与OP50细菌传播板放置30个年轻的成虫上周五的蠕虫在20°C;他们将在星期二（见表1）准备好漂白剂。
- 漂白蠕虫按照标准的协议10。
- 让孵化在M9上搅拌得到同步的L1幼虫的人口在25°C。
第3天
6。分布在96-RNAi技术NGM的喂养和RNAi板蠕虫
这一步应该在早晨进行。 L1级同步的蠕虫分发到每个饲养和RNAi的96孔细菌克隆。
- 检索从37°C 96以及RNAi技术NGM的板，离开他们在室温下降温。
- 检索从25°C漂白蠕虫估计每2μL的蠕虫数量和与M9的调整，有大约100-120蠕虫每2μL（约一滴）。
- 分发手动2μLL1阶段，在每口井使用重复饮水机的蠕虫。检查每个井蠕虫（你应该看到在液体中游泳的蠕虫）。
- 让板干燥，在无菌层流柜（最多1小时）。定期检查板，蠕虫必须爬行并不会游泳。要小心，NGM的不能干太多，否则会开裂。
- 在25°C放置在潮湿的腔板。
7。有效的感染测试的Drechmeria coniospora孢子
这一步是目前屏幕的具体。它包括测试不同批次选择高度传染性的孢子。因此，应尽可能接近前4天，每天感染。这是必要的，要提前准备足够的L3-L4蠕虫，这些试验（见表1）。 四要求的详细方法其他地区11 coniospora文化已被描述。
<OL>第4天
8。感染与D. RNA干扰暴露蠕虫coniospora孢子
这一步是执行30小时后的RNAi喂养时，蠕虫已经达到L3 - L4阶段。
- 确定使用分发4μL，每口井的孢子体积。
- 收集新鲜D。 coniospora孢子从选定一批M9的缓冲区。一个9厘米孢子板用8-10毫升的M9。 <李>重复饮水机分发到每口井4μL孢子。检查每个孢子（你可以看到在液体中的蠕虫游泳）以及。
- 让板干燥，在无菌层流柜（约1小时）。板定期检查，直到开始爬行的蠕虫。要小心，NGM的不能干太多，否则会开裂。
- 放置在潮湿的腔感染板在25°C间。
第5天
9。自动定量分析的前板的观察和存储
这一步开始在感染后18小时，并在第5天进行。蠕虫预计将开始下蛋的青壮年。在此步骤中的表型视觉得分：要么虫荧光绿色对应到一个正常的情况下感染后，诱导GFP的改变，这意味着在一个给定的良好基因沉默的变化感染的反应。
- <李>快速荧光解剖显微镜下观察板块。如果板块表现出良好的一般GFP的感应然后进行下一步，否则等到下午一个更好的感应，只要仍然有蠕虫留下的食物。
- 视觉得分每板具有明显的表型（如没有GFP的表达），并注意任何良好。通过检查可能已添加任何控制的RNAi克隆得到的结果，这第一次的初步分析，给出了一个试验是否已成功的迹象。
- 使用8个或12个通道的多吸取100μL氯化钠50毫米海卫0.05％转让蠕虫，新的相应标记/ 96圆底板条形码。冻结板在-80°C，直到分析。
- 在当天的分析，在室温下化冻板和使用COPAS Biosort进行自动分析。分拣机分析，在22分钟的单盘。板不应该是在室温下，分析前一个小时多，他们不能再被冻结。
- 从COPAS Biosort获得的信息转录成Excel文件的一个粗略的数据质量核查。由COPAS Biosort（光密度（灭绝），眼轴长度（飞行时间），荧光的排放量，同时由三个不同的探测器）测量不同参数的原始数据，然后存放在一个专用的LIMS包（MBio的LIMS，MODUL生物），随后详细的定量分析。
10。代表结果
鉴于上述情况，在实验结束后，大多数井，蠕虫病毒和细菌的数量，使用的动物都应该已发展到成年，仍然应该在所有井留下了一些食物。在这些条件下，大多数井也应该包含鸡蛋。应该足够数量的成年人在每个数据Biosort得到f或至少有50个人的蠕虫病毒。另一方面，如果是有效的RNAi，RNAi技术克隆大量将挑起可见的表型。例如，蠕虫可能是不协调的，或者更明显，无菌，或在其发展中被捕。这应该经常发生，因此，一般每96孔板至少一个包含一个明显的RNAi型蠕虫。当利益型的GFP报告基因的表达，与GFP（RNAi）技术克隆井提供了强大的控制（图2）。其他的表型，如改变大小，可以很容易地测量与Biosort（图3A）。我们观察到，蠕虫病毒可以在甚低频（<1％，BS，未公布结果）迁移到相邻的井时，在一个良好的食品没有用完。
撞倒不同类别的基因的功能，可以影响转基因表达在 C 线虫 。一些非专门为转基因表达12。其他，如作为组织特异性转录因子，例如表皮转录因子GATA因素ELT-3 13，将需要在特定的细胞亚群。这是列入非相关构的表皮细胞基因记者构造（P COL-12 ::红色荧光）在当前协议所使用的应变的原因之一。这使得这种基因，特别是在涉及的基因，正在研究监管过程（图3B和C）的区别。该基因的表达在所有的幼虫阶段。如果一个试验涉及不同的控制报告基因检测胚胎的基因表达是必须的。
本协议的创新之一是使用冷冻板，推迟他们的分析。使冻结板存储长达两个星期，没有大幅改变的结果。虽然测量荧光的绝对值可能会改变，他们的相对比例保持相似（图4）。在加时赛她的手，RNAi是一种内在变量的实验步骤14。为了获得强大的结果，并消除了许多潜在的误报，RNAi屏幕需要被复制的，至少一次。如果试验顺利进行，应该有一个板块在不同的日子测试的结果之间的合理关系。特别，有很强的作用的基因，应该是清晰可辨，其精确的定量效果，即使是重复板（图5）之间的不相同。
图1为一个典型的实验的总体方案。
图2。控制RNA干扰靶向GFP的表达克隆 。转基因蠕虫expressi吴组成AP COL-12 :: DsRed的记者和诱导P级NLP 29 :: GFP的记者在96孔板固体培养基上观察使用GFP与一个过滤器，允许一套红色和绿色荧光的同时观察解剖显微镜。蠕虫暴露控制（上板）或绿色荧光蛋白的RNAi克隆（底板）48小时。在左边的面板是未受感染的蠕虫病毒，这些正确的蠕虫，感染18小时后， 与 D coniospora。比例尺为1毫米。
图3。 96孔板定量分析 。 COPAS Biosort生成每个蠕虫的数值数据分析。图表显示平均值和标准偏差的飞行时间（TOF，A）对应的蠕虫15日 ，红色荧光（B）和绿色荧光的比率（X100），飞行时间（三）转基因窝的大小RMS表示组成AP COL-12 :: DsRed的记者和诱导P级NLP 29 :: GFP的记者已在固体培养基上培养与不同的RNAi克隆在96孔板，48小时，18小时后，感染与 D coniospora。某些克隆，比如用箭头突出（一），惹的生长缺陷和/或影响带够COL-12 :: DsRed的表达。他人，特别是影响GFP的表达，强调在（C）的箭头。这种特殊的克隆基因1 NSY，以前显示的NLP 29 13调控的重要目标。绿色，红色荧光和TOF测量任意的，而是不断的单位。
图4。比赛埃里森与现场和冷冻样品取自同一实验数据。 L4的蠕虫板，携带带够NLP-29 :: GFP和P COL-12 ::红色荧光的转基因与 D被感染coniospora或没有。 18小时后，每块板大致分为2;一半立即进行了分析和半冻结在-80°C，24小时前解冻和分析。计算每个样本的平均TOF（蠕虫规模），EXT（光密度）和绿色和红色荧光值。图表显示的平均比例感染分为非感染样本，冷冻和现场样品（N = 7638和5096，8634和3850的蠕虫病毒，分别）。
图5。重复96孔板的比较分析 。归荧光比率（平均荧光强度（在这里，100 *绿色/ TOF）每口井除以为每一个有代表性的96孔板的重复分析以及修剪（25 日至75 百分位数）为每块板的意思）。
| 材料 | 实验时间轴 |
| 星期四
|
表1。与30板的一个周期的实验范例。
这里介绍的材料需要从第1步的实验步骤12举办9天为一个周期，30个板块的实验和时间轴。
线虫的生长介质（NGM），100毫升：
| 0。3克 | 氯化钠 |
| 0.25Ğ | BactoPeptone |
| 2克 | BactoAgar |
| 加入100μL | 5毫克/毫升的胆固醇在乙醇 |
| 加入去离子水至100 mL | |
| 5分钟的反应釜在121°C和晾凉，然后加入： | |
| 加入100μL | 1米硫酸镁4 |
| 加入100μL | 1个M氯化钙2 |
| 2.5毫升 | 1米KPO 4 pH值6.0 |
NGM的96孔板，100毫升的RNAi治疗：
| 0.29Ğ | 氯化钠 |
| 0.25Ğ | BactoPeptone |
| 1.7Ğ | BactoAgar |
| 加入100μL | 5毫克/毫升的胆固醇在乙醇 |
| 新增的离子水100毫升 | |
| 5分钟的反应釜在121°C和晾凉，然后加入： | |
| 加入100μL | 1米硫酸镁4 |
| 加入100μL | 1个M氯化钙2 |
| 2.5毫升 | 1米KPO 4 pH值6.0 |
| 400微升 | 1中号经IPTG |
| 加入100μL | 100毫克/ mL氨苄青霉素 |
| 加入100μL | 12.5毫克/毫升四环素 |
漂白液5ML：
2.5毫升H 2 O
2.3毫升漂白
0.2毫升氢氧化钠50％
氢氧化钠50％，100毫升：
50克氢氧化钠
加入去离子水至100 mL
氯化钠50MM海卫0.05％，400毫升：
4毫升氯化钠5米
1毫升海卫一20％
加入去离子水400毫升。
2毫升的Triton X-100
8 mL去离子水
M9的缓冲区，1L
6公克，钠2 HPO 4（MW：178）
3克KH 2 PO 4（MW：136）
5克氯化钠
加入去离子水至1 L
釜
加入1毫升硫酸镁 1米
卢里亚肉汤（LB），1L：
10ĞBactoTryptone
20克酵母提取物
10克氯化钠
加入去离子水至1 L
釜
1米4，300毫升硫酸镁：
73.95Ğ硫酸镁4
加入去离子水300毫升。
在室温高压灭菌器和存储
5毫克/毫升的胆固醇，200毫升：
1克胆固醇
加入100％乙醇200毫升
在室温，过滤消毒和储存
1个M 氯化钙 ，500毫升：
27。75克氯化钙2
加入去离子水500毫升。
在室温，过滤消毒和储存
1米KPO 4 pH值6.0，4升：
517ĞKH 2 PO 4（MW：136）
207 G K 2 HPO 4（MW：174）
加入去离子水4升。
100毫克/毫升氨苄青霉素（Amp），10毫升：
1Ğ氨苄青霉素
加入去离子水至10毫升
储存在-20°C
1米异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），10毫升：
2.38Ğ经IPTG
加入去离子水至10毫升
储存在-20°C
12.5 mg / mL的四环素，100毫升
1.25Ğ四环素
加入100％乙醇100毫升
表2。解决方案。
Discussion
Disclosures
的Ewbank实验室合作联盟Biometrica和MODUL生物。
Acknowledgments
我们感谢他们的贡献D. Braendle，CL库尔兹和F.Montañana-桑奇斯。这个项目是由ANR和行政法院区域PACA的，（INSERM）和国家科学研究中心的机构资金补助支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BactoAgar | BD Biosciences | 214010 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| BactoPeptone | BD Biosciences | 211677 | |
| CaCl2 | Any Supplier | ||
| AeraSeal adhesive film | Dutscher | 760214 | |
| Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | AB-0481 | |
| K2HPO4 | Any Supplier | ||
| KH2PO4 | Any Supplier | ||
| MgSO4 | Any Supplier | ||
| NaCl | Any Supplier | ||
| Na2HPO4 | Any Supplier | ||
| NaOH | Any Supplier | ||
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | AB-0932 | |
| 96 well flat plate | Falcon BD | 353072 | |
| 96 well round plate | Falcon BD | 353077 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T8032 | |
| Triton X-100 | Any Supplier | ||
| TECAN robot | Tecan Group Ltd. | ||
| Liquidator96TM | Rainin | ||
| COPAS Biosort | Union Biometrica | ||
| LIMS | Modul-Bio |
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