Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans doi: 10.3791/3448 Published: February 27, 2012

Summary

We beschrijven een protocol met behulp van

Abstract

RNA-interferentie is een krachtige methode om genfunctie begrijpen, vooral wanneer uitgevoerd bij een hele genoom schaal en in een kwantitatieve context. In C. elegans kan genfunctie worden neergeslagen eenvoudig en efficiënt door toevoer wormen bacteriën expressie van een dsRNA overeenkomt met een specifiek gen 1. Hoewel het oprichten van bibliotheken van RNAi-klonen die het grootste deel van de C. elegans genoom 2,3 opende de weg voor echte functionele genomische studies (zie bijvoorbeeld 4-7), de meeste gevestigde methoden zijn omslachtig. Moy en collega's hebben ontwikkeld, semi-automatische protocollen waarmee de toegang genoom-brede schermen 8. De aanpak is gebaseerd op microscopische beeldvorming en beeldanalyse.

Beschrijven we een alternatieve protocol voor een hoge-doorvoer screen genoom, gebaseerd op robot behandeling van bacteriële RNAi klonen kwantitatieve analyse met COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)) en eengeïntegreerde software: de MBioLIMS (Laboratory Information Management System van Modul-Bio) een technologie die een verhoogde doorvoersnelheid voor gegevensbeheer en monster tracking biedt. De methode maakt het mogelijk schermen te voeren op een vast medium platen. Dit is bijzonder belangrijk voor een aantal studies, zoals adressering gastheer-pathogeen interacties C. elegans, aangezien bepaalde microben niet efficiënt infecteren wormen in vloeibare cultuur.

We tonen hoe de werkwijze kan worden gebruikt om het belang van genen kwantificeren schimmelwerende aangeboren immuunsysteem in C. elegans. In dit geval benadering berust op het gebruik van een transgene stam die een epidermale infectie induceerbare fluorescerende reportergen met GFP onder controle van de promotor van het antimicrobiële peptide gen nlp 29 en een rood fluorescent reporter die constitutief wordt uitgedrukt in de epidermis. Deze laatste bevat een interne controle voor de functionele toestand van de huiden niet-specifieke transgene zwijgen 9. Bij de besturing wormen zijn geïnfecteerd door de schimmel ze fluoresceren groen. Kloppen de door RNAi een gen die nodig zijn voor NLP 29 expressie resulteert in verminderde fluorescentie na infectie. Op dit moment wordt in dit protocol maakt het mogelijk meer dan 3.000 RNAi klonen worden getest en geanalyseerd per week, het openen van de mogelijkheid van een screening van het volledige genoom in minder dan 2 maanden.

Protocol

Het protocol, zoals hieronder beschreven wordt verdeeld in stappen van vijf achtereenvolgende dagen (Fig. 1). Zoals opgemerkt kunnen bepaalde stappen worden uitgevoerd op verschillende dagen. De duur van elke trede en de hoeveelheid materiaal nodig (bijv. wormen, bacteriën, media) afhankelijk van het aantal platen met 96 putjes behandeld per experiment.

Dag 1

1. Voorbereiding van de 96-wells platen RNAi NGM

Het volgende protocol is een bewerking van de standaard methode voor het maken worm cultuur platen 10, waarin de details van de sterilisatie technieken voor de verschillende oplossingen omvat.

  1. 10-12 96-well platen, bereiden 100 ml Nematode kweekmedia (NGM) in gedeïoniseerd H2O: 1.7 g BactoAgar, 0,29 g NaCl, 0,25 g pepton, 100 ul cholesterol (5 mg / mL in EtOH).
  2. Autoclaaf NGM (5 min bij 121 ° C 100 ml, 30 min bij 121 ° C gedurende 4 L) en laat afkoelen tot het bij ongeveer 50 ° C (enkel koel enough te houden). Het is belangrijk dat de NGM blijft warm genoeg zodat het niet stollen.
  3. Toevoegen van 100 ml: 2,5 ml fosfaatbuffer PH6 (1 M), 100 ul MgSÜ4 (1 M), 100 ul CaCl2 (1 M), 400 pi IPTG (1 M), 100 ul ampicilline (100 mg / ml), 100 ul Tetracycline (12,5 mg / ml in EtOH).
  4. Verdelen 75 pi van NGM aan elk putje van een 96-well platte-bodem platen. Om te voorkomen stollen van het medium moet snel worden afgegeven, is het gemakkelijk om een ​​zich herhalend dispenser (bijvoorbeeld Repeatman, Eppendorf) te gebruiken. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de putten.
  5. Onmiddellijk Bewaar de platen in een vochtige kamer (bijvoorbeeld een Tupperware doos met natte papieren handdoeken op de bodem) bij 4 ° C.

Opmerking: platen kunnen worden bereid tot een week vooraf opgeslagen bij 4 ° C, dit kan de inrichting van volgende stappen vergemakkelijken.

2. Geautomatiseerde voorbereiding van de 96-deepwell LB-platen

  1. Voeg een deksel om elke plaat en bewaren bij 4 ° C. Om elke 96-well plaat te volgen, moet een uniek label of barcode worden toegevoegd, in dit stadium of later.

Opmerking: platen kunnen worden bereid 2 tot 3 dagen vooraf en bewaard bij 4 ° C, dit kan de inrichting van volgende stappen vergemakkelijken.

3. Groei van de RNAi bacteriële klonen in de 96-deepwell LB-platen ('s nachts cultuur)

  1. Voor de daaropvolgende hanteerbaarheid bij de oorspronkelijke library RNAi klonen in een 384-well formaat eerste verdelen de klonen in gelabelde of barcode standaard 96-well platen met LB met 100 pg / ml Amp en 12,5 ug / ml Tet aangevuld met glycerol (10% eindconcentratie). Wanneer de oorspronkelijke 384 putjes geen klonen in alle wells, zoals het geval is voor de meest gebruikte "Ahringer" library zijn er verschillende opties voor het organiseren de dochter platen. Klonen kunnen zodanig worden verdeeld, dat er geen lege putten in de dochter platen. Dit minimaliseert het aantal platen op scherm. Het is echter het tijdens replicatie, moet een aantal putjes op elke plaat worden dochter leeg, zodat deze vervolgens worden gevuld met standaard controle klonen (positieve en negatieve) dat over-plaat vergelijkingen te vergemakkelijken. Deze 96-wells dochter platen worden dan gebruikt om het zaad van de 96-deepwell LB-platen voor een overnachting (ON) cultuur.

Alle liquid handling stappen zijn best gedaan met een robot liquid handling systeem (bijv. Tecan), maar kan handmatig uitgevoerd worden met behulp van, bijvoorbeeld, een 96-pin replicator. Als de RNAi-bibliotheek klonen zijn al in een 96-well formaat gaat tot 3,5 stap.

    Incubeer de 96-wells platen RNAi dochter bij 37 ° C onder roeren (200 rpm) 14-15 uur.
  1. Controleer of de bacteriën goed groeide en identificeren van klonen die niet groeien. Deze worden uitgesloten later analyses. Idealiter wordt de OD gemeten 600 in elk putje, maar dit kan door eenvoudige controle.
  2. Bewaar de 96-wells platen RNAi dochter bij -80 ° C voor gebruik.
  3. Ontdooi de 96-well platen met de RNAi klonen bij kamertemperatuur. De platen kunnen daarna op 4 ° C tot gebruik.
  4. Verdelen 3 pi van elke bacteriële kloon van een 96-wells plaat repliceren de 96 putjes van de overeenkomstige gelabelde / streepjescode 96 deepwell LB platen met 1,5 ml van LB met 100 pg / ml Amp en 12,5 ug / ml Tet. Bacteriële klonen RNAi efficiency, zoals GFP (RNAi) kloon in dit voorbeeld en negatieve controles te beheersen kan handmatig worden opgenomen in elke beschikbare lege put.
  5. Bedek de 96-deepwell plates met een zelfklevende film (bijv. AeraSeal cellulaire cultuur film van Dutscher). Vervang de gebruikte 96-well plaat herhaalde bij -80 ° C.
  6. De 96 deepwell gelabelde platen worden vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C onder roeren (200 rpm gedurende 14-15 uur).

Dag 2

4. Zaad van de RNAi bacteriële klonen op de 96-wells platen RNAi NGM

Deze stap moet worden gedaan in de morgen na de op de cultuur.

  1. Neem de 96-wells NGM platen van 4 ° C en laat ze op te warmen en drogen voor 5-15 min onder een steriele laminaire flow kast. Laat de platen te lang onder de motorkap (maximaal 30 min), omdat anders de NGM vervolgens kan gaan barsten. Voeg de juiste etiket / barcode op elke plaat.
  2. Haal de 96-deepwell op de cultuur platen van 37 ° C. Noteer de standpunten van een lege putten (een lege put is volledig doorzichtig), deze zullen worden uitgesloten van verdere analyses.
  3. Centrifugeer de 96-Deepwell platen 5 min bij 4000 tpm.
  4. Tip uit het supernatant door het draaien van de plaat sterk op zijn kop en snel droog de randen van de plaat op een papieren handdoek. Omdat de culturen zijn van recombinante bacteriën, het supernatant moet worden behandeld in overeenstemming met lokale wetgeving (bijvoorbeeld geautoclaveerd).
  5. Resuspendeer de bacteriële pellet in de resterende vloeistof (ongeveer 50 pi) en door vortexen, bij voorkeur met behulp van een speciale agitator (bijv. Tecan), zodat elke plaat precies dezelfde behandeling krijgt. Het is mogelijk om de OD 600 meten van elk putje nauwkeurig de bacteriële inoculum voor de volgende stap standaardiseren, maar dit is niet noodzakelijk, en we niet aan een dergelijke controle.
  6. Overdracht 5 pi van de geresuspendeerde bacteriën op de 96-wells NGM platen met behulp van een 8 of 12-kanaals Multi-pipet. Zorg dat er geen aan te raken of doordringen in de NGM. Deze stap wordt manueel, maar dan met een robot zoals Liquidator96 (Rainin) worden waarmee deverdeling van 96 RNAi klonen in een stap.
  7. Laat de bacteriën droog onder een steriele laminaire flow kast, het controleren regelmatig om te voorkomen dat de NGM te droog wordt. Deze stap duurt ongeveer 2 uur.
  8. Incubeer de 96-wells RNAi-NGM platen bij 37 ° C op in een vochtige kamer.

5. Maak een gesynchroniseerde bevolking van wormen

Voor deze stap maken we gebruik van transgene wormen die het reporter-gen (en) van belang (bijvoorbeeld een infectie-induceerbare p nlp-29 :: GFP-construct en, als een interne controle, een constitutieve p col-12 :: DsRed transgen te bouwen) . Door de daling van transgenexpressie de tijd wij ontdooien verse loten van wormen 6 weken. We cultuur wormen minstens 2 generaties voor gebruik, en ervoor zorgen dat de wormen nog nooit uitgehongerd voor de test. Als dag 2 van het protocol is dinsdag, bereiden we wormen op vrijdag door het plaatsen van 30 jonge volwassen wormen op een 9 cm NGM plaat verspreid met OP50 bacteriënbij 20 ° C, ze zullen klaar om bleekwater te zijn op dinsdag (zie tabel 1).

  1. Bleach wormen naar aanleiding van de standaard protocol 10.
  2. Laat de eitjes komen in de M9 bij 25 ° C ON met opwinding tot een gesynchroniseerde bevolking van L1 larven te krijgen.

Dag 3

6. Verdeel de wormen op de 96-wells RNAi-NGM platen voor voeding en RNAi

Deze stap moet worden gedaan in de ochtend. L1-stage gesynchroniseerde wormen zijn verspreid op elke 96-wells bacteriële kloon voor voeding en RNAi.

  1. Haal de 96-wells RNAi-NGM platen van 37 ° C en laat ze op kamertemperatuur afkoelen.
  2. Haal de gebleekte wormen van 25 ° C. Schatting van het aantal wormen per 2 pl en aan te passen met M9 tot ongeveer 100-120 wormen per 2 pl (ongeveer een enkele druppel) hebben.
  3. Verdeel handmatig 2 pl L1-stage wormen in elk putje met een repetitieve dispenser. Controleer elke goed voor wormen (je zou moeten zien wormen zwemmen in vloeistof).
  4. Laat de platen droog onder een steriele laminaire flow kast (maximaal 1 uur). Controleer regelmatig of de platen, de wormen moeten kruipen en niet zwemmen. Let op: de NGM mag niet te veel drogen, anders zal het te kraken.
  5. Plaats de platen bij 25 ° C in een vochtige kamer.

7. Test de Drechmeria coniospora sporen voor een effectieve infectie

Deze stap is specifiek voor dit scherm. Het bestaat in het testen van verschillende charges van sporen op zeer infectieuze die selecteren. Daarom moet zo dicht mogelijk gedaan dag 4 dag van infectie. Het is noodzakelijk om voldoende L3-L4 wormen bereiden vooraf deze tests (Tabel 1). De gedetailleerde methoden die nodig zijn voor de D. coniospora cultuur zijn elders 11 beschreven.

<ol>
  • Verzamel sporen van een monster van elke schimmel cultuur in een klein volume van de M9.
  • Plaats een druppel van elk sporensuspensie op een 35 mm NGM plaat bezaaid met OP50, en laat het drogen.
  • Voeg 30-40 L3-L4 wormen die het reporter-gen van belang (bijvoorbeeld p ​​nlp-29 :: GFP).
  • Plaats de besmette platen bij 25 ° C ON.
  • De volgende dag, controleer dan de wormen voor het GFP-inductie en selecteer de partij van schimmel die de helderste, breedste en meest homogene inductie van groene fluorescentie geeft.
  • Dag 4

    8. Infecteren de RNAi blootgestelde wormen met D. coniospora sporen

    Deze stap wordt uitgevoerd 30 uur na het voeden van RNAi als wormen zijn de L3-L4 stadium.

    1. Bepaal de hoeveelheid sporen te gebruiken 4 ul per putje verdelen.
    2. Verzamel verse D. coniospora sporen uit de geselecteerde partij met M9 buffer. Gebruik 8-10 ml M9 voor een 9 cm plaat van sporen.
    3. <li> Verdeel 4 ul van sporen aan elk putje met een repetitieve dispenser. Controleer elke goed voor sporen (u kunt de wormen zien zwemmen in vloeistof).
    4. Laat de platen droog onder een steriele laminaire flow kast (~ 1 uur). Controleer regelmatig of de platen tot de wormen te beginnen kruipen. Let op: de NGM mag niet te veel drogen, anders zal het te kraken.
    5. Plaats de geïnfecteerde platen bij 25 ° C in een vochtige kamer.

    Dag 5

    9. Waarneming en opslag van de platen voor automatische kwantitatieve analyse

    Deze stap start 18 uur na infectie uitgevoerd tijdens dag 5. Worms wordt verwacht dat ze jonge volwassenen beginnen om eieren te leggen. Tijdens deze stap de fenotype visueel gescoord: een worm fluoresceren groene die overeenkomt met een normale situatie na infectie of de inductie van GFP wordt gewijzigd in een bepaalde goed waardoor de zwijgen genveranderingen de respons op infectie.

      <li> Snel houden aan de platen onder de fluorescentie stereomicroscoop. Als de platen tonen een goede algemene GFP inductie ga dan naar de volgende stap, anders wachten tot de middag voor een betere inductie, zolang er nog voedsel over voor de wormen.
    1. Visueel scoren elk bord en noteer elke goed met een duidelijke fenotype (bijv. geen expressie van GFP). Aan de hand van de resultaten verkregen met enkele controle RNAi klonen die is toegevoegd, deze eerste voorlopige analyse geeft een indicatie van de vraag of het experiment succesvol is geweest.
    2. Een 8 of 12-kanaals Multi pipet overdracht de wormen met 100 pi 50 mM NaCl-Triton 0,05%, een nieuw overeenkomstig gemerkt / streepjescode 96-rondbodemkolf plaat. Bevries de platen bij -80 ° C tot analyse.
    3. Op de dag van de analyse, ontdooien de platen bij kamertemperatuur en overgaan tot de geautomatiseerde analyse met behulp van de COPAS Biosort. De sorter analyseert een enkele plaat in 22 minuten. Platen moeten nietbij kamertemperatuur gedurende meer dan een uur voor analyse en kunnen niet opnieuw worden ingevroren.
    4. De informatie verkregen uit de COPAS Biosort worden omgezet in een Excel-bestand voor vluchtige controle van de kwaliteit van de gegevens. De ruwe data van de verschillende parameters gemeten door de COPAS Biosort (optische dichtheid (extinctie), axiale lengte (tijd vlucht), fluorescentie-emissie tegelijkertijd door drie verschillende detectors) worden vervolgens opgeslagen in een LIMS pakket (MBio LIMS, Modul- Bio) voor de volgende gedetailleerde kwantitatieve analyses.

    10. Representatieve resultaten

    De hoeveelheden van wormen en bacteriën hierboven aan het einde van het experiment, in de meeste bronnen worden de dieren alle hebben volwassen en er nog enige voedsel meer in alle wells. Onder deze omstandigheden zou de meeste bronnen bevatten eieren. Er moet een voldoende aantal volwassenen in iedere goed, zodat Biosort data wordt f verkregenof ten minste 50 afzonderlijke wormen. Aan de andere kant, als de RNAi efficiënt, een groot aantal klonen RNAi leiden tot een zichtbaar fenotype. Zo kan wormen niet homogeen of meer uiteraard steriel of aangehouden in de ontwikkeling. Dit vaak voorkomen, zodat het algemeen ten minste een goed per plaat met 96 putjes wormen met een duidelijke RNAi fenotype bevat. Wanneer het fenotype van belang is de expressie van een reportergen GFP, putjes met een GFP (RNAi) kloon een stevige controle (Fig. 2). Andere fenotypen, zoals een verandering van grootte kan gemakkelijk worden gemeten met Biosort (Fig. 3A). We zagen dat wormen kan naar de aangrenzende putten migreren bij zeer lage frequentie (<1%, BS, niet gepubliceerde resultaten) als het eten in een goed deed op zijn.

    Neerhalen van de functie van de verschillende klassen van genen kunnen van invloed zijn transgenen uitdrukking in C. elegans. Sommige zijn niet-specifieke vereisten van de transgenen expressie 12. Anderen, zoalsals weefselspecifieke transcriptiefactoren, zoals de epidermale GATA factor ELT-3 13 nodig name subsets van cellen. Dit is een van de redenen voor de opname van een niet-verwante en constitutieve epidermale cel transgene reporter-construct (p col-12 :: DsRed) in de stam gebruikt voor het huidige protocol. Hierdoor deze genen te onderscheiden van de specifiek bij het genregulerend proces onder studie (Fig. 3B en C). Dit transgen wordt uitgedrukt in alle larvale stadium. Als een test omvat het detecteren genexpressie in embryo's een andere controle reportergen nodig zou zijn.

    Een van de innovaties van dit protocol is het gebruik van bevriezing platen om hun analyse uit te stellen. Invriezen kan platen worden opgeslagen voor maximaal twee weken zonder wezenlijke wijziging van de resultaten. Hoewel de absolute waarden gemeten fluorescentie zijn veranderd, de relatieve verhoudingen blijven dergelijke (fig. 4). Op de othaar hand, RNAi is een intrinsiek variabele experimentele procedure 14. Om robuuste resultaten te verkrijgen en te elimineren de vele mogelijke false positives, RNAi schermen herhaald moeten worden, ten minste een keer. Als de experimenten met succes uitgevoerd, moet er een redelijke correlatie tussen de resultaten van een plaat getest op verschillende dagen. Vooral moet de genen die een sterk effect duidelijk herkenbaar zijn, zelfs als de nauwkeurige kwantitatieve effect niet identiek tussen duplo platen (Fig. 5).

    Figuur 1.
    Figuur 1. Algemeen schema voor een typisch experiment.

    Figuur 2.
    Figuur 2. Controle RNAi met een kloon te richten GFP expressie. Transgene wormen expressing constitutief ap col-12 :: DsRed verslaggever en een induceerbaar p nlp 29 :: GFP-reporter op een vast medium in een 96-wells plaat gevisualiseerd met behulp van een GFP dissectie microscoop met een filter set waardoor gelijktijdige waarneming van de rode en groene fluorescentie. Wormen werden blootgesteld aan controle (bovenste panelen) of GFP RNAi kloon (bodempanelen) gedurende 48 uur. De panelen aan de linkerkant zijn niet-geïnfecteerde wormen, die op de juiste wormen 18 uur na infectie met D. coniospora. De schaal bar is 1 mm.

    Figuur 3.
    Figuur 3. Kwantitatieve analyse van een 96-wel plaat. De COPAS Biosort genereert numerieke gegevens voor elke worm geanalyseerd. De grafieken tonen de gemiddelde en standaarddeviatie de vluchttijd (TOF; A) die overeenkomt met de grootte van de wormen 15, rode fluorescentie (B) en de verhouding (X100) groene fluorescentie TOF (C) van transgene worms expressie constitutief ap col-12 :: DsRed reporter en een induceerbare p nlp 29 :: GFP reporter dat was op vast medium gekweekt in 96-wells plaat met verschillende klonen RNAi gedurende 48 uur, 18 uur na infectie met D. coniospora. Sommige klonen, zoals die aangegeven met de pijl in (A), provoceren groeistoornissen en / of van invloed op de expressie van P col-12 :: DsRed. Anderen, met name van invloed zijn GFP-expressie, zoals aangegeven door de pijl in (C). Deze bijzondere kloon richt zich op het gen nsy 1, eerder aangetoond belangrijk te zijn voor de regulering van NLP 29 13. Groene, rode fluorescentie en TOF worden gemeten in willekeurige maar constante eenheden.

    Figuur 4.
    Figuur 4. CompArison van gegevens die zijn verkregen met live en bevroren monsters van hetzelfde experiment. Platen van L4 wormen die p nlp-29 :: GFP en p col-12 :: DsRed transgenen werden ofwel besmet met D. coniospora of niet. Na 18 uur werd elke plaat grofweg in 2; helft werd direct geanalyseerd en half ingevroren bij -80 ° C 24 voordat ontdooien en analyse. Waarden voor de gemiddelde TOF (grootte van wormen), EXT (optische dichtheid) en Groen en Rood fluorescentie werden berekend voor elk monster. De grafiek toont de verhouding van de gemiddelde geïnfecteerd gedeeld door niet-geïnfecteerde monsters van de bevroren en levende monsters (n = 7638 en 5096, en 8634 en 3850 wormen, respectievelijk).

    Figuur 5.
    Figuur 5. Vergelijkende analyse van dubbele 96-wells platen. De genormaliseerde fluorescentieverhouding (de gemiddelde fluorescentie ratio (hier 100 * groen / TOF) voor elke wel gedeeld doorde bijgesneden (25 e tot 75 e percentiel) betekenen voor elke plaat) voor elk putje analyses in duplo van een representatieve 96-well plaat.

    Materiaal Experimentele tijdlijn
    • IPTG: ~ 1,4 mL
    • Ampicilline: ~ 5 ml
    • Tetracycline: ~ 5 ml
    • LB: 5 L
    • 96-well vlakke platen: 30 voor NGM
    • 96-wells ronde platen: 30 voor het invriezen van (analyse)
    • 96-deepwell platen: 30 voor op cultuur
    • cultuur film: 30
    • Tips doos: 30 voor bacteriën zaaien
    • 9 cm OP50 platen: ~ 17
    • Worms: 1 vers ontdooide cyrovial per maand
    • Sporen: ~ 2 platen
    • NaCl 50 mM + 0,05% Triton: ~ 300 ml
    Donderdag
    1. Bereid de NGM RNAi 96-wells platen (~ 1 uur + autoclaaf)
    Vrijdag
    1. Bereid de 96-deepwell LB-platen (~ 4 uur)
    2. Bereid wormen (14 platen met 30 jonge volwassen wormen bij 20 ° C + 1 plaat bij 25 ° C)
    Maandag
    1. Overdracht wormen van de plaat bij 25 ° C op nieuwe plaat
    2. Verdeel bacteriën in LB-platen (~ 7 uur)
    3. Op de cultuur om 6 uur
    Dinsdag
    1. Verdeel bacteriën op NGM platen in de ochtend (~ 3 uur+ ~ 2h droging)
    2. Bleach wormen uit platen bij 20 ° C
    Woensdag
    1. Verdeel wormen om 10 uur (~ 1 uur + ~ 1 uur drogen)
    2. Test sporen met wormen van de plaat bij 25 ° C
    Donderdag
    1. Infect wormen op 3 uur (~ 1 uur + ~ 1 uur drogen)
    Vrijdag
    1. Transfer in nieuwe 96-well platen + vries (~ 2 uur)

    Tabel 1. Voorbeeld van een een cyclus experiment met 30 platen.

    Hier wordt voorgesteld het materiaal die nodig is voor een een-cyclus experiment van 30 platen en een tijdlijn voor een experiment van stap 1 tot 12 georganiseerd op 9 dagen stap.

    Nematoden Groei Media (NGM), 100 ml:

    0.3 g NaCl
    0,25 g BactoPeptone
    2 g BactoAgar
    100 ul 5 mg / mL Cholesterol in EtOH
    Voeg gedeïoniseerd water tot 100 ml
    Autoclaaf gedurende 5 minuten bij 121 ° C en laat het afkoelen en voeg dan:
    100 ul 1 M MgSÜ4
    100 ul 1 M CaCl2
    2.5 mL 1 M KPO 4 pH 6,0

    NGM voor RNAi behandeling in 96-wells plaat, 100 ml:

    0,29 g NaCl
    0,25 g BactoPeptone
    1,7 g BactoAgar
    100 ul 5 mg / mL Cholesterol in EtOH
    Voeg de gedeïoniseerd water tot 100 ml
    Autoclaaf gedurende 5 minuten bij 121 ° C en laat het afkoelen en voeg dan:
    100 ul 1 M MgSÜ4
    100 ul 1 M CaCl2
    2.5 mL 1 M KPO 4 pH 6,0
    400 ul 1 M IPTG
    100 ul 100 mg / ml ampicilline
    100 ul 12,5 mg / ml tetracycline

    Bleach oplossing, 5 ml:

    2,5 ml H2O
    2,3 ml Bleach
    0,2 ml 50% NaOH

    NaOH 50%, 100 ml:

    50 g NaOH
    Voeg gedeïoniseerd water tot 100 ml

    NaCl 50 mM-Triton 0,05%, 400 ml:

    4 ml NaCl 5 M
    1 ml 20% Triton
    Voeg gedeïoniseerd water tot 400 ml

    tap "> Triton 20%, 10 ml:

    2 ml Triton X-100
    8 ml gedeïoniseerd water

    M9 buffer, 1L

    6 g Na 2 HPO 4 (MW: 178)
    3 g KH 2 PO 4 (MW: 136)
    5 g NaCl
    Gedeioniseerd water tot 1 liter
    Autoclaaf
    Voeg 1 ml 1 M MgSÜ4

    Luria Broth (LB), 1L:

    10 g BactoTryptone
    20 g gistextract
    10 g NaCl
    Gedeioniseerd water tot 1 liter
    Autoclaaf

    1 M MgSO 4 300 ml:

    73,95 g MgSÜ4
    Voeg gedeïoniseerd water tot 300 ml
    Autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur

    5 mg / mL Cholesterol, 200 ml:

    1 g cholesterol
    Voeg 100% EtOH 200 ml
    Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur

    1 M CaCl2, 500 ml:

    27.75 g CaCl2
    Voeg gedeïoniseerd water tot 500 ml
    Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur

    1 M KPO 4 pH 6,0, 4 L:

    517 g KH 2 PO 4 (MW: 136)
    207 g K 2 HPO 4 (MW: 174)
    Voeg gedeïoniseerd water tot 4 L

    100 mg / ml ampicilline (amp), 10 ml:

    1 g ampicilline
    Voeg gedeïoniseerd water tot 10 ml
    Bewaren bij -20 ° C

    1 M Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml:

    2,38 g IPTG
    Voeg gedeïoniseerd water tot 10 ml
    Bewaren bij -20 ° C

    12,5 mg / ml tetracycline, 100 ml

    1,25 g Tetracycline
    Voeg 100% EtOH 100 ml

    Tabel 2. Solutions.

    Discussion

    Disclosures

    De Ewbank lab werkt samen met Unie Biometrica en Modul-Bio.

    Acknowledgments

    Wij danken D. Braendle, CL Kurz en F. Montañana-Sanchis voor hun bijdragen. Dit project werd ondersteund door subsidies van de ANR en de Conseil Regional PACA en institutionele financiering van INSERM en het CNRS.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BactoAgar BD Biosciences 214010
    Ampicillin Sigma-Aldrich A9518
    BactoPeptone BD Biosciences 211677
    CaCl2 Any Supplier
    AeraSeal adhesive film Dutscher 760214
    Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0481
    K2HPO4 Any Supplier
    KH2PO4 Any Supplier
    MgSO4 Any Supplier
    NaCl Any Supplier
    Na2HPO4 Any Supplier
    NaOH Any Supplier
    96 deep well plate Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0932
    96 well flat plate Falcon BD 353072
    96 well round plate Falcon BD 353077
    Tetracycline Sigma-Aldrich T8032
    Triton X-100 Any Supplier
    TECAN robot Tecan Group Ltd.
    Liquidator96TM Rainin
    COPAS Biosort Union Biometrica
    LIMS Modul-Bio

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
    2. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
    3. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
    4. Lee, S. S. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).
    5. Hamilton, B. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).
    6. Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. Functional genomic analysis of C. elegans molting. PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).
    7. Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes. Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).
    8. O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model. Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).
    9. Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
    10. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1551-8507 (2006).
    11. Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. Methods Mol Biol. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).
    12. Cardoso, C. XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans. Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).
    13. Pujol, N. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).
    14. Simmer, F. Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions. PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).
    15. Couillault, C. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).
    16. Morton, E., Lamitina, T. A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data. Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).
    17. Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans. PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).
    18. Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis. Virulence. 1, 113-122 (2010).
    19. Duverger, Y. A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).
    20. Pierce-Shimomura, J. T. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).
    21. Ruzanov, P., Riddle, D. L. Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).
    22. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).
    23. Okoli, I. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).
    24. Moy, T. I. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).
    25. Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2. Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).
    Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in<em> C. elegans</em
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).More

    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video
    Waiting X
    simple hit counter