Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans doi: 10.3791/3448 Published: February 27, 2012

Summary

אנו מתארים באמצעות פרוטוקול

Abstract

התערבות RNA היא שיטה רבת עוצמה כדי להבין תפקוד הגן, במיוחד כאשר נערך בקנה מידה כל הגנום, ובהקשר כמותית. ב C. elegans, תפקוד הגן ניתן הפילו בפשטות וביעילות על ידי האכלה עם תולעים חיידקים המבטאים dsRNA המתאים גן ספציפי 1. תוך יצירת ספריות של שיבוטים RNAi מכסה את רוב ג elegans הגנום 2,3 פתחה את הדרך האמיתיים מחקרים גנומית פונקציונלית (ראה למשל 4-7), רוב השיטות מבוססות הן מייגע. מוי ועמיתיו פיתחו חצי אוטומטיות פרוטוקולים המאפשרים הגנום כולו מסכים 8. הגישה מתבססת על הדמיה מיקרוסקופית וניתוח התמונה.

כאן אנו מתארים את פרוטוקול חלופי המסך הגנום כולו תפוקה גבוהה, המבוססת על טיפול הרובוטית של חיידקי RNAi שיבוטים, ניתוח כמותי באמצעות Biosort COPAS (האיחוד Biometrica (UBI)), ותוכנה משולבת: MBioLIMS (ניהול מעבדה מערכת מידע מ Modul-Bio) טכנולוגיה המספקת תפוקה מוגברת על ניהול נתונים ומעקב אחר המדגם. השיטה מאפשרת מסכי להתנהל על צלחות בינוניים מוצקים. הדבר חשוב במיוחד עבור כמה מחקרים, כגון אלו בין מאכסן לפתוגן אינטראקציות פונה ב C. elegans, מאז חיידקים מסוימים לא יעיל להדביק תולעים בתרבות נוזל.

אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בשיטה כדי לכמת את החשיבות של גנים חסינות אנטי פטרייתי מולד ב C. elegans. במקרה זה, הגישה מתבססת על שימוש זן מהונדס נושאת גן אפידרמיס זיהום מושרה כתב ניאון, עם GFP בשליטת היזם של מיקרוביאלית פפטיד גן NLP 29 ו לכתב ניאון אדום בא לידי ביטוי ב constitutively האפידרמיס. זה האחרון מספק בקרה פנימית על שלמות תפקודית של האפידרמיסו transgene ספציפי להשתיק 9. כאשר התולעים בקרה נגועים על ידי הפטרייה הם לזרוח בירוק. דריסה על ידי RNAi גן נדרש-NLP 29 תוצאות הביטוי של הקרינה פחתה לאחר ההדבקה. נכון לעכשיו, פרוטוקול זה מאפשר יותר מ -3,000 שיבוטים RNAi להיבדק וניתח בשבוע, לפתוח את האפשרות של הקרנת הגנום כולו בתוך פחות מ 2 חודשים.

Protocol

פרוטוקול כמתואר להלן מחולק צעדים על חמישה ימים רצופים (איור 1). כאמור, צעדים מסוימים ניתן לעשות זאת בימים שונים. משך הזמן של כל שלב, וכן את כמות החומר הנדרש (למשל תולעים, חיידקים, מדיה) יהיה תלוי במספר 96 צלחות גם טיפול בכל ניסוי.

יום 1

1. הכנה של 96-NGM גם צלחות RNAi

פרוטוקול הבאה מותאמת השיטה הרגילה ליצירת תרבות צלחות תולעת 10, הכולל פרטים על שיטות עיקור של הפתרונות השונים.

  1. במשך 10-12 צלחות 96 טוב, להכין 100 מ"ל של מדיה צמיחה נמטודות (NGM) ב deionized H 2 O: 1.7 גרם BactoAgar, 0.29 גרם NaCl, 0.25 גרם Peptone, 100 כולסטרול μL (5 מ"ג / מ"ל ב EtOH).
  2. החיטוי NGM (5 דק 'ב 121 מעלות צלזיוס במשך 100 מ"ל, 30 דקות ב 121 מעלות ל 4) ומקררים עד שהוא בסביבות 50 מעלות צלזיוס (Eno מגניב פשוטאיכס להחזיק). חשוב NGM נשאר חם מספיק כדי לא לחזק.
  3. הוסף ל 100 מ"ל: 2.5 מ"ל פוספט חיץ pH6 (1 דקה), 100 MgSO μL 4 (1 דקה), 100 μL CaCl 2 (1 דקה), 400 IPTG μL (1 דקה), 100 ampicillin μL (100 מ"ג / מ"ל), 100 טטרציקלין μL (12.5 מ"ג / מ"ל ​​ב EtOH).
  4. הפץ 75 μL של NGM היטב כל אחד צלחת שטוחה התחתון 96-היטב. כדי למנוע התמצקות של המדיום, הוא צריך להימכר בקצב מהיר, זה נוח להשתמש מתקן חוזרות (למשל Repeatman, Eppendorf). ודא שאין בועות אוויר הנמצאים הבארות.
  5. אחסנו את הצלחות באופן מיידי בתא לח (למשל קופסת טאפרוור עם מגבות נייר רטובות בתחתית) בשעה 4 ° C.

הערה: הצלחות ניתן להכין עד שבוע מראש ולאחסן על 4 מעלות צלזיוס, זה יכול להפוך את הארגון של השלבים הבאים קל יותר.

2. הכנה אוטומטית של הצלחות 96-DeepWell ליברות

  1. הוספת כיסוי לצלחת כל החנות ב 4 ° C. על מנת לעקוב אחר כל צלחת 96-ובכן, תווית ברקוד ייחודי או יש להוסיף, בשלב זה או לאחר מכן.

הערה: אפשר להכין לוחות 2 עד 3 ימים מראש ולאחסן על 4 מעלות צלזיוס, זה יכול להפוך את הארגון של השלבים הבאים קל יותר.

3. לגדל את החיידקים המשובטים RNAi הצלחות 96-DeepWell ליברות (תרבות בין לילה)

  1. על מנת להקל בדיעבד של הטיפול, כאשר המקוריים RNAi שיבוטים הספרייה הם בפורמט 384 היטב, להפיץ מחדש 1 את שיבוטים אל שכותרתו או בר מקודד תקן 96-גם צלחות המכילות LB עם מגבר מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 100 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​Tet השלימו עם גליצרול (הריכוז הסופי 10%). כאשר לוחיות 384 גם המקוריים לא צריך שיבוטים של כל בארות, כמו במקרה של ספריית הנפוץ ביותר "Ahringer", ישנן מספר אפשרויות לארגן את הצלחות ובת. שיבוטים ניתן להפיץ מחדש, כך שאין בארות ריקים צלחות ובת. הדבר מצמצם את מספר צלחות על המסך. באופן אידיאלי, עם זאת, במהלך שכפול, בארות כמה על כל צלחת הבת יש להשאיר ריק, כך אלה יכולים לאחר מכן להיות מלא שיבוטים שליטה סטנדרטיים (חיוביות ושליליות) המקלים על צלחת, השוואות. 96-אלה גם צלחות הבת משמשים לזרע 96-DeepWell צלחות ליברות לתרבות (ב) בן לילה.

כל הצעדים טיפול הנוזל נעשים בצורה הטובה ביותר עם מערכת טיפול רובוטית נוזלי (למשל טקאן), אבל ניתן לבצע באופן ידני באמצעות, למשל, משכפל 96 פינים. אם הספריה שיבוטים RNAi כבר בפורמט 96-גם עבור לשלב 3.5.

דגירה של 96-RNAi גם צלחות הבת על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה (200 סל"ד) במשך 14-15 שעות.
  • ודא כי החיידק גדל בצורה נכונה לזהות שיבוטים כי לא גדל. אלה ייכללו ניתוח מאוחר יותר. באופן אידיאלי, OD 600 נמדדת גם זה, אבל זה יכול להיעשות על ידי בדיקה פשוטה.
  • אחסן את 96-RNAi גם צלחות הבת ב -80 ° C לפני השימוש.
  • להפשיר את הצלחות 96-המכילים גם שיבוטים RNAi בטמפרטורת החדר. הצלחות אז יכול להיות כל הזמן ב 4 ° C עד השימוש.
  • הפץ 3 μL של שיבוט כל חיידקי מהצלחת 96-גם לשכפל את 96 בארות של צלחת 96-DeepWell שכותרתו בהתאם / המינימרקטים LB המכיל 1.5 מ"ל של LB עם מגבר מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 100 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ט. שיבוטים חיידקים כדי לשלוט ביעילות RNAi, כגון שיבוט GFP (RNAi) בדוגמה הנוכחית, בקרות שליליות, ניתן לשלב גם באופן ידני בכל ריק זמין.
  • כיסוי 96-DeepWell עמ 'lates עם סרט דבק (למשל הסרט AeraSeal התרבות התאית מ Dutscher). להחליף את צלחת 96-לשכפל גם בשימוש ב -80 ° C.
  • את 96-DeepWell צלחות שכותרתו מודגרת ואילך על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה (200 סל"ד במשך 14-15 שעות).
  • יום 2

    4. זרע את שיבוטים RNAi חיידקים על גבי 96-NGM גם צלחות RNAi

    צעד זה צריך להיעשות בבוקר לאחר התרבות ON.

    1. קח את הצלחות 96-NGM היטב 4 ° C ולתת להם להתחמם להתייבש במשך 5-15 דקות מתחת לארון למינרית סטרילית לזרום. אל תשאיר את הצלחות זמן רב מדי מתחת למכסה המנוע (מקסימום 30 דקות), כי אחרת NGM יכול לאחר מכן לפצח. הוסף תווית ברקוד מתאים / אל כל צלחת.
    2. אחזר 96-DeepWell על צלחות תרבית של 37 ° C. הקלט את עמדותיהם של כל בארות ריק (גם ריק הוא שקוף לחלוטין); אלה ייכללו ניתוחים שלאחר מכן.
    3. בצנטריפוגה 96-DeepWell צלחות 5 דקות בסל"ד 4000.
    4. עצה את supernatant על ידי סיבוב צלחת חד הפוך להתייבש בשולי הצלחת במהירות על מגבת נייר. כמו תרבויות הם של חיידקים רקומביננטי, supernatant צריך להיות מטופל על פי התקנות המקומיות (למשל autoclaved).
    5. Resuspend גלולה החיידק בנוזל שיורי (כ 50 μL) על ידי vortexing, באופן אידיאלי באמצעות תועמלן ייעודי (למשל טקאן), כך כל צלחת מקבל בדיוק את אותו הטיפול. ניתן למדוד את OD 600 של כל אחד גם לתקנן דווקא הבידוד חיידקי לשלב הבא, אבל זה לא הכרחי, ואנחנו לא לבצע בדיקה כזו.
    6. העברת 5 μL של חיידקים resuspended על גבי 96-NGM גם הצלחות באמצעות 8 או 12 ערוצים רב פיפטה. היזהר שלא לגעת או לחדור NGM. שלב זה מתבצע באופן ידני, אך יכול להיות מותאם באמצעות רובוט כגון Liquidator96 (Rainin) המאפשרחלוקת 96 RNAi שיבוטים בצעד אחד.
    7. בואו החיידקים יבש תחת הממשלה הזרימה למינרית סטרילית, לבדוק באופן קבוע, כדי למנוע NGM להיות יבש מדי. צעד זה אמור לקחת בערך 2 שעות.
    8. דגירה של 96-RNAi-NGM גם צלחות ב 37 ° C על בתא לח.

    5. הכן את האוכלוסייה מסונכרן של תולעים

    לצעד זה, אנו משתמשים תולעים הטרנסגניים שנשאו את הגן הכתב (ים) של עניין (למשל, זיהום מושרה עמ 'NLP-29 :: GFP לבנות, כמו שליטה פנימי, עמ' המכונן col-12 :: transgene dsRed לבנות) . בגלל הירידה הנצפית הביטוי transgene עם הזמן, אנו להפשיר קבוצות חדשות של תולעים כל 6 שבועות. אנחנו תרבות תולעים לפחות 2 דורות לפני השימוש, ולוודא כי התולעים לא גוועים ברעב לפני assay. אם היום 2 לפרוטוקול הוא יום שלישי, אנו מכינים תולעים ביום שישי על ידי הצבת 30 תולעים בוגרות צעירות על צלחת 9 ס"מ NGM להפיץ OP50 עם חיידקיםב 20 מעלות צלזיוס, הם יהיו מוכנים אקונומיקה ביום שלישי (ראה לוח 1).

    1. אקונומיקה תולעים בעקבות פרוטוקול סטנדרטי 10.
    2. בואו הביצים בוקעות ב M9 של 25 מעלות צלזיוס עם תסיסה לקבל האוכלוסייה מסונכרן של הזחלים L1.

    יום 3

    6. להפיץ את התולעים על 96-RNAi-NGM גם צלחות עבור האכלה RNAi

    צעד זה צריך להיעשות בבוקר. תולעים L1 בשלב מסונכרנים מופצים על שיבוט כל 96-גם חיידקי על האכלה RNAi.

    1. לאחזר את 96-RNAi-NGM גם צלחות מ 37 ° C ולהשאיר אותם בטמפרטורת החדר להתקרר.
    2. לאחזר את התולעים מולבן מ 25 ° C. להעריך את מספר התולעים לכל μL 2 ולהתאים עם M9 להיות סביב 100-120 תולעים לכל μL 2 (בערך טיפה אחת).
    3. להפיץ באופן ידני 2 μL של L1 בשלב תולעים בכל אחד גם באמצעות מתקן חוזר על עצמו. בדוק כל טוב תולעים (אתה צריך לראות תולעים שחייה בנוזל).
    4. בואו הצלחות יבש תחת הממשלה הזרימה למינרית סטרילית (1 שעה לכל היותר). בדוק את הצלחות באופן קבוע, התולעים צריך לזחול ולא שחייה. תיזהר, NGM אסור לייבש יותר מדי, אחרת זה יהיה לפצח.
    5. מניחים את הצלחות של 25 מעלות צלזיוס בתא לח.

    7. לבדוק את coniospora נבגים Drechmeria לזיהום יעיל

    שלב זה הוא ספציפי עבור המסך הנוכחי. הוא מורכב בבדיקת קבוצות שונות של נבגים לבחור אלה זיהומיות ברמה גבוהה. לכן זה צריך להיעשות קרוב ככל האפשר לפני 4 יום, יום של זיהום. יש צורך להכין מספיק L3-L4 תולעים מראש על בדיקות אלה (טבלה 1). השיטות מפורטים הדרושים ד תרבות coniospora תוארו במקומות אחרים 11.

    <ol>
  • לאסוף נבגים ממדגם של כל תרבות פטרייתי בנפח קטן של M9.
  • מניחים ירידה של השעיית כל נבג על צלחת NGM 35 מ"מ עם זרע OP50, ולתת לו להתייבש.
  • הוסף 30-40 L3-L4 תולעים נושאת את הגן הכתב עניין (למשל עמ 'NLP-29 :: GFP).
  • מניחים את הצלחות נגועים במהירות של 25 ° C על.
  • למחרת, לבדוק את התולעים לזירוז GFP ובחר קבוצה של פטריות אשר מעניקה הבהיר, אינדוקציה הרחבה הומוגנית רוב הקרינה ירוק.
  • יום 4

    8. להדביק החשוף RNAi בתולעים עם ד ' coniospora נבגים

    שלב זה מתבצע 30 שעות לאחר האכילה, כאשר RNAi תולעים הגיעו לשלב L3-L4.

    1. לקבוע את עוצמת הקול של נבגים להשתמש לחלק 4 μL בכל טוב.
    2. איסוף ד רעננה coniospora נבגים מתוך האצווה הנבחרת עם חיץ M9. השתמש 8-10 מ"ל של M9 לצלחת 9 1 ס"מ של נבגים.
    3. <li> הפצת 4 μL של נבגים היטב כל אחד עם מתקן חוזר על עצמו. בדוק כל טוב נבגים (אתה יכול לראות את השחייה תולעים בנוזל).
    4. בואו הצלחות יבש תחת הממשלה הזרימה למינרית סטרילית (~ 1 שעה). בדוק את הצלחות באופן קבוע עד התולעים להתחיל לזחול. תיזהר, NGM אסור לייבש יותר מדי, אחרת זה יהיה לפצח.
    5. מניחים את הצלחות נגועים במהירות של 25 מעלות צלזיוס בתא לח.

    יום 5

    9. תצפית ואחסון של הצלחות לפני ניתוח כמותי אוטומטי

    שלב זה מתחיל 18 שעות לאחר ההדבקה והיא מבוצעת במהלך היום 5. תולעים צפויים להיות צעירים מתחילים להטיל ביצים. במהלך שלב זה הפנוטיפ הוא הבקיע חזותית: תולעים משני לזרוח ירוק אשר תואמים את זיהום מצב נורמלי לאחר, או אינדוקציה של ה-GFP משתנה היטב נתון שפירושו כי הגן משתנה מושתקים בתגובה לזיהום.

      <li> במהירות לבחון את הצלחות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח. אם הצלחות להראות אינדוקציה טוב GFP כללי ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא, אחרת לחכות עד אחר הצהריים לזירוז טוב יותר, כל עוד יש עדיין אוכל נותר התולעים.
    1. ראייה להבקיע בכל צלחת ושים לב כל טוב עם פנוטיפ המסומן (למשל, לא ביטוי של GFP). על ידי בדיקת התוצאות שהתקבלו עם כל שיבוטים RNAi השליטה, אשר ייתכן שנוספו, זה ניתוח ראשוני 1 נותן אינדיקציה האם הניסוי הצליח.
    2. באמצעות 8 או 12 ערוצים להעברת רב פיפטה את התולעים עם μL של 100% NaCl 50 0.05 מ"מ טריטון, אל החדש שכותרתו בהתאם / המינימרקטים 96-היטב מסביב תחתית הצלחת. להקפיא את צלחות ב -80 ° C עד הניתוח.
    3. ביום של הניתוח, להפשיר את הצלחות בטמפרטורת החדר ולהמשיך ניתוח אוטומטי באמצעות Biosort COPAS. סדרן מנתח צלחת אחת ב -22 דקות. צלחות לא צריך להיותעזבו בטמפרטורת החדר למשך יותר משעה לפני הניתוח, והם לא ניתן להקפיא שנית.
    4. המידע המתקבל Biosort COPAS מתועתקים לקובץ Excel לצורך אימות שטחית של איכות נתונים. הנתונים הגולמיים עם פרמטרים שונים הנמדדים על ידי Biosort COPAS (צפיפות אופטית (הכחדה), אורך צירית (בזמן הטיסה), פליטת הקרינה, בו זמנית על ידי שלושה גלאים שונים) מאוחסנים מכן בחבילה LIMS ייעודי (MBio LIMS, Modul- ביוגרפיה) עבור הבאים ניתוחים כמותיים מפורטים.

    10. נציג תוצאות

    באמצעות כמויות של תולעים וחיידקים שניתנו לעיל, בסוף הניסוי, ברוב הבארות, בעלי החיים צריכים פיתחו לבגרות ויש עדיין צריך להיות קצת אוכל להשאיר את כל הבארות. בתנאים אלה, רוב הבארות צריכה להכיל גם ביצים. לא צריך להיות מספר מספיק של מבוגרים בכל טוב, כך Biosort הנתונים מתקבל Fאו לפחות 50 תולעים בודדים. מצד שני, אם RNAi יעיל, מספר רב של שיבוטים RNAi יעורר פנוטיפ גלוי. לדוגמה, תולעים יכול להיות חסר קואורדינציה, או יותר ברור, סטרילית, או נעצרו בהתפתחותם. זה אמור להתרחש בתדירות גבוהה, כך בדרך כלל לפחות אחד טוב לכל צלחת 96-מכיל גם תולעים עם פנוטיפ RNAi מאליו. כאשר הפנוטיפ של עניין הוא הביטוי של גן ה-GFP הכתב, בארות עם שיבוט GFP (RNAi) מכיל פקד איתן (איור 2). פנוטיפים אחרים, כגון שינוי גודל ניתן למדוד בקלות עם Biosort (איור 3 א). הבחנו כי תולעים יכול להגר בארות סמוכות בתדר נמוך מאוד (<1%, BS, תוצאות שלא פורסמו), כאשר את האוכל גם היה נגמר.

    להרוס את הפונקציה של סוגים שונים של גנים יכולים להשפיע על ביטוי transgenes ב C. elegans. חלקם לא במיוחד נדרש ביטוי transgenes 12. אחרים, כגוןכמו רקמות ספציפיות גורמי תעתוק, למשל גורם Gata אפידרמיס ELT-3 13, יידרשו בשנת תת מסוימים של תאים. זו אחת הסיבות להכללת שאינם קשורים המכונן אפידרמיס תא transgene כתב לבנות (עמ 'col-12 :: dsRed) ב זן המשמש הפרוטוקול הנוכחי. זה מאפשר גנים כאלה כדי להבחין בין המעורבים במיוחד בתהליך גן הרגולציה תחת מחקר (איור 3 ב & C). Transgene זה בא לידי ביטוי במהלך כל שלבי הזחל. אם assay כרוך ביטוי גנים גילוי עוברי גן אחר כתב השליטה יהיה צורך.

    אחד החידושים של פרוטוקול זה הוא השימוש צלחות הקפאת לדחות את הניתוח שלהם. ההקפאה מאפשרת צלחות לאחסן עד שבועיים ללא שינוי משמעותי בתוצאות. אף על פי ערכים מוחלטים של הקרינה נמדדת ניתן לשנות, יחסי היחסי נשאר דומה (איור 4). ב OTידה, RNAi הוא 14 משתנה באופן מהותי בהליך ניסיוני. כדי להשיג תוצאות חזקות ולחסל את תוצאות חיוביות שגויות רבות אפשריות, מסכי RNAi צריך להיות משוכפל, לפחות פעם אחת. אם הניסויים נערכים בהצלחה, צריך להיות קשר הגיוני בין התוצאות של צלחת 1 נבדק בימים שונים. במיוחד, את הגנים שיש להם השפעה חזקה צריך להיות מזוהה באופן ברור, גם אם השפעה כמותית מדויקת שלהם אינו זהה בין לוחות כפולים (איור 5).

    באיור 1.
    באיור 1. תוכנית כוללת עבור ניסוי טיפוסי.

    איור 2.
    איור 2. בקרה RNAi באמצעות שיבוט מיקוד ביטוי ה-GFP. מהונדס תולעים expressing constitutively AP col-12 :: כתב dsRed ו NLP מושרה עמ '29 :: כתב ה-GFP על מצע מוצק בצלחת 96-דמיינו גם באמצעות ה-GFP לנתח את מיקרוסקופ עם מערכת פילטר המאפשר תצפית בו זמנית של הקרינה אדום וירוק. תולעים נחשפו לשלוט (לוחות העליונות) או RNAi GFP שיבוט (לוחות למטה) על 48 שעות. לוחות בצד שמאל הם תולעים נגוע, אלה על תולעים הנכונים 18 שעות לאחר ההדבקה עם ד ' coniospora. סרגל קנה המידה הוא 1 מ"מ.

    איור 3.
    איור 3. ניתוח כמותי של צלחת 96-היטב. Biosort COPAS מייצר נתונים מספריים עבור תולעת ניתוח כל אחד. הגרפים מראים את סטיית תקן ממוצע זמן הטיסה (TOF,) אשר מתאים לגודל של תולעים 15, אדום פלואורסצנטי (ב ') ויחס (100 x) של פלואורסצנטי ירוק TOF (C) של מהונדס ווRMS להביע constitutively AP col-12 :: כתב dsRed ו NLP מושרה עמ '29 :: כתב GFP שהיו בתרבית על מצע מוצק בצלחת 96-היטב עם אחר RNAi שיבוטים של 48 שעות, 18 שעות לאחר ההדבקה עם ד' coniospora. שיבוטים מסוימים, כגון 1 מסומן בחץ ב (א), מעוררים צמיחה פגמים ו / או להשפיע על הביטוי של P-12 col :: dsRed. אחרים, במיוחד משפיעים על ביטוי של GFP, כמו מודגשת על ידי חץ ב (ג). זה שיבוט בפרט מטרות nsy גן 1, הראו בעבר להיות חשוב בוויסות של NLP 29 13. ירוק, אדום פלואורסצנטי ו TOF נמדדים ביחידות שרירותיות, אלא קבוע.

    באיור 4.
    באיור 4. Compאריסון נתונים המתקבלים עם דגימות חי וקפוא מניסוי אחד. צלחות L4 תולעים הנושאים עמ 'NLP-29 :: GFP ו-P-12 col :: transgenes dsRed נדבקו גם עם ד' coniospora או לא. לאחר 18h, כל צלחת חולקה בערך 2: 1/2 נותח מיד קפוא וחצי 24 שעות ב -80 מעלות צלזיוס, לפני הפשרת וניתוח. ערכי הממוצע TOF (בגודל של תולעים), EXT (צפיפות אופטית) וגם ירוק ואדום הקרינה חושבו עבור מדגם זה. הגרף מראה את היחס בין הממוצע של נגוע חלקי שאינם נגועים דגימות, על דגימות קפואות ולחיות (n = 7638 ו 5096, ו 8634 ו 3850 תולעים, בהתאמה).

    איור 5.
    איור 5. ניתוח השוואתי של 96-גם צלחות כפולים. יחס הקרינה מנורמל (יחס הקרינה הממוצעת (כאן, 100 * ירוק / TOF) עבור כל אחד מחולק היטב על ידיגזוז (25 עד ה 75 לאחוזון ה) אומר על כל צלחת) עבור כל אחד מן הניתוחים גם כפולות של נציג 96-גם צלחת.

    חומר ניסיוני ציר הזמן
    • IPTG: ~ 1.4 מ"ל
    • Ampicillin: ~ 5 מ"ל
    • Tetracyclin: ~ 5 מ"ל
    • LB: 5 L
    • 96-גם צלחות שטוחות: 30 NGM
    • 96-גם צלחות עגולות: 30 הקפאה (ניתוח)
    • 96-DeepWell לוחות: 30 על תרבות
    • הסרט התרבות: 30
    • תיבת טיפים: 30 לזריעה חיידקים
    • 9 ס"מ OP50 צלחות: ~ 17
    • תולעים: 1 מופשר טרי cyrovial בחודש
    • נבגי: ~ 2 צלחות
    • NaCl 50mm + טריטון 0.05%: ~ 300 מ"ל
    יום חמישי
    1. הכן RNAi NGM צלחות 96-היטב (~ 1h + החיטוי)
    יום שישי
    1. הכינו את 96-DeepWell צלחות ליברות (~ 4H)
    2. הכן תולעים (14 צלחות עם 30 תולעים בוגרות צעירות ב 20 ° C + 1 הצלחת של 25 ° C)
    יום שני
    1. העברת תולעים מן הצלחת במהירות של 25 ° C לצלחת חדש
    2. להפיץ חיידקים על צלחות ליברות (~ 7h)
    3. על תרבות בשעה 6
    יום שלישי
    1. להפיץ חיידקים על צלחות NGM בבוקר (~ 3H+ ~~~HEAD=NNS 2H ייבוש)
    2. תולעים אקונומיקה מצלחות ב 20 ° C
    יום רביעי
    1. להפיץ תולעים בשעה 10 בבוקר (~ 1h + ~~~HEAD=NNS 1h ייבוש)
    2. הבדיקה נבגים עם תולעים מן הצלחת במהירות של 25 מעלות צלזיוס
    יום חמישי
    1. להדביק תולעים בשעה 3 (~ 1h + ~~~HEAD=NNS 1h ייבוש)
    יום שישי
    1. העברת בניו 96-גם צלחות + הקפאה (~ 2h)

    טבלה 1. דוגמה של ניסוי 1 מחזור עם 30 צלחות.

    כאן מוצג החומר הדרוש לניסוי 1 מחזור של 30 צלחות ולוח זמנים עבור הניסוי משלב 1 לשלב 12 מאורגן על 9 ימים.

    צמיחה נמטודות מדיה (NGM), 100 מ"ל:

    0.3 גרם NaCl
    0.25 גר ' BactoPeptone
    2 גרם BactoAgar
    100 μL 5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול EtOH
    מוסיפים מים deionized ל -100 מ"ל
    החיטוי במשך 5 דקות ב 121 מעלות ולתת מגניב, ולאחר מכן להוסיף:
    100 μL 1 M MgSO 4
    100 μL 1 M CaCl 2
    2.5 מ"ל 1 ז KPO 4-pH 6.0

    NGM לטיפול RNAi בצלחת 96-ובכן, 100 מ"ל:

    0.29 גר ' NaCl
    0.25 גר ' BactoPeptone
    1.7 גרם BactoAgar
    100 μL 5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול EtOH
    הוסף דה מיוננים מים 100 מ"ל
    החיטוי במשך 5 דקות ב 121 מעלות ולתת מגניב, ולאחר מכן להוסיף:
    100 μL 1 M MgSO 4
    100 μL 1 M CaCl 2
    2.5 מ"ל 1 ז KPO 4-pH 6.0
    400 μL 1 M IPTG
    100 μL 100 מ"ג / מ"ל ​​ampicillin
    100 μL 12.5 מ"ג / מ"ל ​​טטרציקלין

    פתרון Bleach, 5 מ"ל:

    2.5 מ"ל H 2 O
    2.3 מ"ל אקונומיקה
    0.2 מ"ל NaOH 50%

    NaOH 50%, 100 מ"ל:

    50 גרם NaOH
    מוסיפים מים deionized ל -100 מ"ל

    NaCl-50mm טריטון 0.05%, 400 מ"ל:

    4 מ"ל NaCl 5 M
    1 מ"ל טריטון 20%
    מוסיפים מים כדי deionized 400 מ"ל

    TEP "> טריטון 20%, 10 מ"ל:

    2 מ"ל טריטון X-100
    8 מ"ל מים deionized

    M9 חיץ, 1 ליטר

    6 גרם Na 2 HPO 4 (MW: 178)
    3 גרם KH 2 PO 4 (MW: 136)
    5 גרם NaCl
    מוסיפים מים כדי deionized L 1
    דוד לחץ
    הוסף 1 מ"ל MgSO 4 1 M

    מרק לוריא (LB), 1 ליטר:

    10 גרם BactoTryptone
    20 גרם תמצית שמרים
    10 גרם NaCl
    מוסיפים מים כדי deionized L 1
    דוד לחץ

    1 M MgSO 4, 300 מ"ל:

    73.95 גרם MgSO 4
    מוסיפים מים כדי deionized 300 מ"ל
    החיטוי וחנות בטמפרטורת החדר

    5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול, 200 מ"ל:

    1 גרם כולסטרול
    הוסף EtOH 100% עד 200 מ"ל
    סנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר

    1 M CaCl 2, 500 מ"ל:

    27.75 גר 'CaCl 2
    מוסיפים מים deionized 500 מ"ל
    סנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר

    1 M KPO 4 pH 6.0, 4 L:

    517 גרם KH 2 PO 4 (MW: 136)
    207 גר 'K 2 HPO 4 (MW: 174)
    מוסיפים מים כדי deionized L 4

    100 מ"ג / מ"ל ​​ampicillin (AMP), 10 מ"ל:

    1 גרם ampicillin
    מוסיפים מים כדי deionized מ"ל 10
    חנות ב -20 ° C

    1 M איזופרופיל β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 מ"ל:

    2.38 גר 'IPTG
    מוסיפים מים כדי deionized מ"ל 10
    חנות ב -20 ° C

    12.5 מ"ג / מ"ל ​​טטרציקלין, 100 מ"ל

    1.25 גר 'טטרציקלין
    הוסף EtOH 100% עד 100 מ"ל

    טבלה 2. פתרונות.

    Discussion

    Disclosures

    המעבדה משתפת פעולה עם האיחוד Ewbank Biometrica Modul ו-Bio.

    Acknowledgments

    אנו מודים ד Braendle, CL קורץ ופ Montañana-סאנצ'יס על תרומתם. פרויקט זה נתמך על ידי תרומות של ANR ו האזורית Conseil PACA, ואת המימון המוסדי מ INSERM ואת CNRS.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BactoAgar BD Biosciences 214010
    Ampicillin Sigma-Aldrich A9518
    BactoPeptone BD Biosciences 211677
    CaCl2 Any Supplier
    AeraSeal adhesive film Dutscher 760214
    Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0481
    K2HPO4 Any Supplier
    KH2PO4 Any Supplier
    MgSO4 Any Supplier
    NaCl Any Supplier
    Na2HPO4 Any Supplier
    NaOH Any Supplier
    96 deep well plate Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0932
    96 well flat plate Falcon BD 353072
    96 well round plate Falcon BD 353077
    Tetracycline Sigma-Aldrich T8032
    Triton X-100 Any Supplier
    TECAN robot Tecan Group Ltd.
    Liquidator96TM Rainin
    COPAS Biosort Union Biometrica
    LIMS Modul-Bio

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
    2. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
    3. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
    4. Lee, S. S. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).
    5. Hamilton, B. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).
    6. Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. Functional genomic analysis of C. elegans molting. PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).
    7. Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes. Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).
    8. O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model. Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).
    9. Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
    10. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1551-8507 (2006).
    11. Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. Methods Mol Biol. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).
    12. Cardoso, C. XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans. Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).
    13. Pujol, N. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).
    14. Simmer, F. Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions. PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).
    15. Couillault, C. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).
    16. Morton, E., Lamitina, T. A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data. Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).
    17. Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans. PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).
    18. Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis. Virulence. 1, 113-122 (2010).
    19. Duverger, Y. A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).
    20. Pierce-Shimomura, J. T. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).
    21. Ruzanov, P., Riddle, D. L. Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).
    22. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).
    23. Okoli, I. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).
    24. Moy, T. I. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).
    25. Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2. Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).
    כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים<em> ג elegans</em
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).More

    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video
    Waiting X
    simple hit counter