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Biology

मात्रात्मक और स्वचालित उच्च throughput जीनोम चौड़ा में आरएनएआई स्क्रीन के सी. एलिगेंस doi: 10.3791/3448 Published: February 27, 2012

Summary

हम एक का उपयोग कर प्रोटोकॉल का वर्णन

Protocol

प्रोटोकॉल के रूप में नीचे वर्णित लगातार पांच दिन (1 छवि) पर चरणों में विभाजित है. के रूप में विख्यात है, कुछ कदम अलग अलग दिनों पर किया जा सकता है. प्रत्येक चरण के रूप में अच्छी तरह के रूप में सामग्री की मात्रा की अवधि की आवश्यकता है (जैसे कीड़े, जीवाणु, मीडिया) 96 प्रयोग के प्रति इलाज प्लेटों की संख्या पर निर्भर करेगा.

1 दिन

1. 96 अच्छी तरह से एन जी एम आरएनएआई प्लेटों की तैयारी

निम्नलिखित प्रोटोकॉल कीड़ा संस्कृति प्लेटों 10 बनाने के लिए मानक पद्धति है, जो अलग समाधान के लिए नसबंदी तकनीकों का विवरण भी शामिल है से अनुकूल है.

  1. 10-12 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, निमेटोड ग्रोथ मीडिया की 100 एमएल (एन जी एम) विआयनीकृत एच 2 हे तैयार: 1.7 BactoAgar जी, 0.29 छ NaCl, 0.25 छ peptone, 100 μL कोलेस्ट्रॉल (5 मिलीग्राम / EtOH में एमएल).
  2. आटोक्लेव (5 मिनट 121 पर डिग्री सेल्सियस के लिए 100 एमएल, 121 पर 30 मिनट ° सी एल के लिए 4) एन जी एम और शांत करते हैं जब तक यह के बारे में डिग्री सेल्सियस 50 (सिर्फ शांत Eno हैधारण करने के ऊ). यह महत्वपूर्ण है कि एन जी एम काफी गर्म है ताकि यह नहीं जमना करता रहता है.
  3. 100 मिलीलीटर के लिए जोड़ें: 2.5 एमएल फास्फेट pH6 बफर (1M), 100 μL 4 MgSO (1M), 100 μL 2 CaCl (1M), 400 μL IPTG (1M), 100 μL एम्पीसिलीन (100 मिलीग्राम / एमएल), 100 μL टेट्रासाइक्लिन (12.5 मिलीग्राम / EtOH में एमएल).
  4. 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए एन जी एम के 75 μL बांटो. को मध्यम की सम्पिण्डन से बचने के लिए, यह तेजी से तिरस्कृत किया जाना चाहिए, यह एक दोहराव औषधि (जैसे Repeatman, Eppendorf) का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है. सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई हवा कुओं में वर्तमान बुलबुले हैं.
  5. प्लेट 4 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत एक नम कक्ष (जैसे तल पर गीला कागज तौलिये के साथ एक Tupperware बॉक्स) में स्टोर

नोट: प्लेटें एक सप्ताह के लिए किया जा तैयार कर सकते हैं अग्रिम में और 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस, यह बाद के चरणों के संगठन को आसान बना सकते हैं.

2. 96 DeepWell लेग प्लेटों के स्वचालित तैयारी

  1. प्रत्येक प्लेट और स्टोर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कवर जोड़ें आदेश में प्रत्येक 96 में अच्छी तरह से थाली को ट्रैक करने के लिए, एक अद्वितीय लेबल या बारकोड या बाद में इस स्तर पर, जोड़ा जाना चाहिए.

नोट: प्लेटें 2 से 3 दिनों के अग्रिम में तैयार कर सकते हैं और 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस, यह बाद के चरणों के संगठन को आसान बना सकते हैं.

3. 96 DeepWell लेग प्लेट (रातोंरात संस्कृति) में आरएनएआई बैक्टीरियल क्लोन आगे बढ़ें

  1. से निपटने के बाद आसानी से, जब लेबल या मानक पट्टी कोडित 96 100 μg Amp / एमएल के साथ लेग युक्त अच्छी तरह प्लेटें और 12.5 μg / एमएल टी में 384 अच्छी तरह से, एक प्रारूप पहले फिर से विभाजित करना क्लोन में हैं मूल आरएनएआई पुस्तकालय क्लोन के लिएएट ग्लिसरॉल (10% अंतिम एकाग्रता) के साथ पूरक. जब मूल 384 अच्छी तरह प्लेटें सभी कुओं में क्लोन नहीं है, के रूप में सबसे अधिक इस्तेमाल किया Ahringer "पुस्तकालय के लिए मामला है, वहाँ बेटी प्लेटों के आयोजन के लिए कई विकल्प हैं. क्लोन जा कर सकते हैं ताकि फिर से वितरित कि वहाँ बेटी प्लेटों में कोई खाली कुओं हैं. यह स्क्रीन करने के लिए प्लेटों की संख्या कम से कम है. आदर्श रूप में, तथापि, प्रतिकृति दौरान, प्रत्येक बेटी थाली पर कुछ कुओं खाली छोड़ दिया जाना चाहिए, ताकि इन बाद में मानक नियंत्रण क्लोनों (सकारात्मक और नकारात्मक) कि भर प्लेट तुलना की सुविधा के साथ भरा जा सकता है. इन 96 अच्छी तरह बेटी प्लेटें तो एक रात में संस्कृति (पर) के लिए 96 DeepWell लेग प्लेटों के बीज के लिए उपयोग किया जाता है.

सभी तरल संभालने कदम एक रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली (जैसे Tecan) के साथ सबसे अच्छा कर रहे हैं, लेकिन मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है का उपयोग कर, उदाहरण के लिए, एक 96 - पिन replicator है. अगर आरएनएआई पुस्तकालय क्लोन पहले से ही एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में कदम से 3.5 जाना.

37 में 96 अच्छी तरह से आरएनएआई बेटी प्लेटें सेते हैं डिग्री सेल्सियस (200 आरपीएम) 14-15 घंटे के लिए आंदोलन के साथ.
  • सत्यापित करें कि बैक्टीरिया सही ढंग से बढ़ी है और क्लोन की पहचान नहीं है कि विकसित किया. बाद के विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा. आदर्श रूप में, प्रत्येक अच्छी तरह से 600 आयुध डिपो में मापा जाता है, लेकिन इस सरल निरीक्षण के द्वारा किया जा सकता है.
  • -80 में 96 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से आरएनएआई बेटी प्लेटें स्टोर.
  • 96 अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर आरएनएआई क्लोनों युक्त प्लेटें पिघलना. प्लेटें फिर 4 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें जब तक रखा जा सकता है.
  • एक प्लेट को दोहराने के 96 अच्छी तरह से तदनुसार लेबल / barcoded लेग 100 μg Amp / एमएल के साथ 96 DeepWell पौंड की 1.5 एमएल युक्त थाली के 96 कुओं और 12.5 μg / एमएल Tet 3 प्रत्येक बैक्टीरियल क्लोन के μL बांटो. बैक्टीरियल आरएनएआई दक्षता वर्तमान उदाहरण में एक GFP क्लोन (आरएनएआई) के रूप में, और नकारात्मक नियंत्रण, को नियंत्रित क्लोन किसी भी उपलब्ध खाली अच्छी तरह से में मैन्युअल रूप से शामिल कर सकते हैं.
  • कवर 96 DeepWell पीएक चिपकने वाली फिल्म (जैसे AeraSeal Dutscher से सेलुलर संस्कृति फिल्म) के साथ lates. बदलें इस्तेमाल किया -80 में 96 अच्छी तरह से दोहराने थाली डिग्री सेल्सियस
  • 96 - DeepWell लेबल प्लेटें फिर 37 पर कर रहे हैं पर incubated रहे डिग्री सेल्सियस आंदोलन के साथ (14-15 घंटे के लिए 200 rpm).
  • 2 दिन

    4. 96 अच्छी तरह से एन जी एम आरएनएआई प्लेट पर आरएनएआई बैक्टीरियल क्लोन बीज

    इस कदम पर संस्कृति के बाद सुबह में किया जाना चाहिए.

    1. 4 से 96 अच्छी तरह से एन जी एम प्लेटें ले लो डिग्री सेल्सियस जाने और उन्हें गर्म और एक बाँझ लामिना का प्रवाह कैबिनेट के तहत 5-15 मिनट के लिए सूखी. हुड (30 अधिकतम मिनट) के तहत भी लंबे समय मत छोड़ो प्लेटें, के रूप में एन जी एम अन्यथा बाद में दरार कर सकते हैं. प्रत्येक थाली करने के लिए उपयुक्त लेबल / बारकोड जोड़ें.
    2. संस्कृति प्लेटों पर 37 डिग्री सेल्सियस से 96 DeepWell पुनर्प्राप्त करें रिकॉर्ड किसी भी खाली कुओं (एक खाली अच्छी तरह से पूरी तरह से पारदर्शी है) की स्थिति, इन बाद के विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा.
    3. 96 अपकेंद्रित्रप्लेटें 4000 rpm पर 5 मिनट के DeepWell.
    4. थाली तेजी से उल्टा मोड़ और थाली के किनारों को तेजी से एक कागज तौलिया पर शुष्क सतह पर तैरनेवाला बंद टिप. के रूप में संस्कृतियों पुनः संयोजक बैक्टीरिया के हैं, सतह पर तैरनेवाला अनुसार स्थानीय नियमों (जैसे autoclaved) के साथ इलाज किया जाना चाहिए.
    5. अवशिष्ट तरल (लगभग 50 μL) में vortexing, आदर्श एक समर्पित आंदोलनकारी (जैसे Tecan) का उपयोग करते हुए कि प्रत्येक प्लेट ठीक उसी उपचार प्राप्त करने के द्वारा जीवाणु गोली Resuspend. यह प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से ठीक बाद के चरण के लिए जीवाणु inoculum मानकीकरण 600 आयुध डिपो को मापने के लिए संभव है, लेकिन यह अनिवार्य नहीं है, और हम इस तरह के एक चेक प्रदर्शन नहीं करते.
    6. 96 अच्छी तरह से एन जी एम एक 8 या 12 चैनल मल्टी - पिपेट उपयोग प्लेटों पर स्थानांतरण resuspended बैक्टीरिया के 5 μL. छू नहीं या एन जी एम घुसना करने के लिए सावधान रहें. यह कदम मैन्युअल रूप से किया जाता है, लेकिन ऐसे (Rainin) Liquidator96 के रूप में एक रोबोट का उपयोग कर अनुकूलित किया जा सकता है कि अनुमति देता है96 आरएनएआई क्लोनों में से एक कदम में वितरण.
    7. एक बाँझ लामिना का प्रवाह कैबिनेट के तहत बैक्टीरिया दो शुष्क, नियमित रूप से जाँच करने के लिए एन जी एम भी सूखी बनने से बचने के. इस कदम के बारे में 2 घंटे लेना चाहिए.
    8. 37 ° C पर एक नम कक्ष में 96 अच्छी तरह से आरएनएआई एन जी एम प्लेटें सेते हैं.

    5. कीड़े की एक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या तैयार

    इस कदम के लिए, हम ट्रांसजेनिक ब्याज की रिपोर्टर जीन (ओं) (संक्रमण inducible पी एनएलपी-29 :: GFP निर्माण जैसे, और एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में, एक विधान कर्नल पी :: 12 dsRed transgene निर्माण) ले जाने के कीड़े का उपयोग करें . Transgene अभिव्यक्ति की समय के साथ मनाया कमी की वजह से, हम हर 6 सप्ताह के कीड़े के ताजा बैचों पिघलना. हम प्रयोग करने से पहले कम से कम 2 पीढ़ियों के लिए संस्कृति, कीड़े, और सुनिश्चित करें कि कीड़े परख से पहले कभी नहीं भूखे है. यदि प्रोटोकॉल के 2 दिन मंगलवार है, हम एक 9 सेमी एन जी एम OP50 बैक्टीरिया के साथ फैल प्लेट पर 30 युवा वयस्क कीड़े रखने के द्वारा शुक्रवार को कीड़े तैयार20 डिग्री सेल्सियस पर, वे मंगलवार (1 टेबल देखें) को ब्लीच करने के लिए तैयार हो जाएगा.

    1. मानक 10 प्रोटोकॉल के बाद ब्लीच कीड़े.
    2. चलो अंडे M9 में 25 ° C पर आंदोलन के साथ L1 के लार्वा की एक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या के पक्षियों के बच्चे.

    3 दिन

    6. 96 अच्छी तरह खिला और आरएनएआई के लिए आरएनएआई एन जी एम प्लेट पर कीड़े वितरित करें

    यह कदम सुबह में किया जाना चाहिए. L1 चरण कीड़े सिंक्रनाइज़ खिला और आरएनएआई के लिए प्रत्येक 96 अच्छी तरह से बैक्टीरिया क्लोन पर वितरित कर रहे हैं.

    1. 37 डिग्री सेल्सियस से 96 अच्छी तरह से आरएनएआई एन जी एम प्लेट निकालें और कमरे के तापमान पर उन्हें छोड़ने के लिए शांत हो जाओ.
    2. 25 डिग्री सेल्सियस से प्रक्षालित कीड़े पुनर्प्राप्त करें 2 μL प्रति कीड़े की संख्या का अनुमान है और M9 के साथ समायोजित करने के लिए 2 μL प्रति 100-120 के आसपास कीड़े (मोटे तौर पर एक एक बूंद) के लिए.
    3. मैन्युअल रूप से प्रत्येक अच्छी तरह से L1 चरण कीड़े एक दोहराव औषधि का उपयोग कर के 2 μL बांटो. कीड़े (आप तरल में तैराकी कीड़े देखना चाहिए) के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से जाँच करें.
    4. एक बाँझ लामिना का प्रवाह कैबिनेट (अधिकतम 1 घंटा) के तहत प्लेटें शुष्क करते हैं. प्लेट नियमित रूप से जाँच करें, कीड़े और रेंगने तैराकी नहीं किया जाना चाहिए. सावधान रहो, एन जी एम भी बहुत सूखी नहीं होना चाहिए, अन्यथा यह दरार जाएगा.
    5. 25 ° C पर एक नम कक्ष में प्लेटें प्लेस.

    7. प्रभावी संक्रमण के लिए टेस्ट Drechmeria coniospora spores

    यह कदम वर्तमान स्क्रीन के लिए विशिष्ट है. यह spores के विभिन्न बैचों का परीक्षण करने के लिए अत्यधिक संक्रामक लोगों का चयन करने में होते हैं. इसलिए यह 4 दिन, संक्रमण के दिन से पहले के रूप में संभव के रूप में पास किया जाना चाहिए. यह आवश्यक है के लिए अग्रिम में इन परीक्षणों (तालिका 1) के लिए पर्याप्त L3 L4-कीड़े तैयार है. विस्तृत डी. के लिए आवश्यक तरीके coniospora संस्कृति कहीं 11 वर्णित किया गया है.

    <राजभाषा>
  • M9 की एक छोटी मात्रा में प्रत्येक कवक संस्कृति का एक नमूना से spores लीजिए.
  • एक 35 मिमी एन जी एम OP50 के साथ वरीयता प्राप्त थाली पर प्रत्येक बीजाणु निलंबन की एक बूंद प्लेस, और इसे सूखा.
  • 30-40 L3 L4 ब्याज की संवाददाता जीन ले जाने के कीड़े (जैसे पी एनएलपी-29 :: GFP) जोड़ें.
  • 25 ° C पर संक्रमित प्लेट पर रखें.
  • अगले दिन, GFP प्रेरण के लिए कीड़े की जाँच करें और कवक के बैच है कि प्रतिभाशाली, हरी प्रतिदीप्ति का व्यापक और सबसे अधिक समरूप प्रेरण देता का चयन करें.
  • 4 दिन

    8. डी. के साथ आरएनएआई उजागर कीड़े को संक्रमित coniospora spores

    इस कदम के आरएनएआई खिला जब कीड़े L3, L4 मंच पर पहुँच गए हैं तो 30 घंटे के बाद किया जाता है.

    1. Spores की मात्रा निर्धारित करने के लिए 4 μL प्रति अच्छी तरह से वितरित करने के लिए उपयोग.
    2. जमा ताजा डी. M9 के बफर के साथ चयनित बैच से coniospora spores. 9 spores के सेमी थाली के लिए M9 के 8-10 एमएल का प्रयोग करें.
    3. <ली> एक अच्छी तरह से एक दोहराव औषधि के साथ spores के 4 μL वितरित. Spores (आप तरल में कीड़े तैराकी देख सकते हैं) के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से जाँच करें.
    4. एक बाँझ लामिना का प्रवाह कैबिनेट ~ (1 घंटा) के तहत प्लेटें शुष्क करते हैं. प्लेट नियमित रूप से जाँच करें जब तक कीड़े रेंगने शुरू करते हैं. सावधान रहो, एन जी एम भी बहुत सूखी नहीं होना चाहिए, अन्यथा यह दरार जाएगा.
    5. 25 में संक्रमित प्लेटें डिग्री सेल्सियस एक नम कक्ष में रखें.

    5 दिन

    9. अवलोकन और स्वचालित मात्रात्मक विश्लेषण के पहले प्लेटों के भंडारण

    इस कदम के संक्रमण के बाद 18 घंटे के शुरू होता है और 5 दिन के दौरान किया जाता है. कीड़े के लिए युवा वयस्कों के लिए अंडे देना शुरू होने की उम्मीद कर रहे हैं. इस कदम के दौरान फेनोटाइप नेत्रहीन रन बनाए है: या तो कीड़े हरे रंग है जो एक सामान्य स्थिति के बाद संक्रमण से मेल खाती है प्रतिदीप्ति, या GFP की प्रेरण एक भी अच्छी तरह से बदल दिया है जिसका अर्थ है कि खामोश जीन संक्रमण के जवाब में परिवर्तन.

      <li> प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोप के तहत तेजी से प्लेट निरीक्षण. यदि प्लेटें एक अच्छा सामान्य GFP प्रेरण दिखा तो अगले चरण पर जाएँ, अन्यथा एक बेहतर शामिल होने के लिए दोपहर तक इंतजार, के रूप में लंबे समय के रूप में वहाँ अब भी कीड़े के लिए भोजन छोड़ दिया है.
    1. दिखने में हर प्लेट स्कोर और एक उल्लेखनीय फेनोटाइप (GFP की कोई अभिव्यक्ति जैसे) के साथ किसी भी अच्छी तरह से ध्यान दें. कोई नियंत्रण आरएनएआई क्लोन कि जोड़ दिया गया है के साथ प्राप्त परिणामों के लिए जाँच के द्वारा, यह पहला प्रारंभिक विश्लेषण कि क्या प्रयोग सफल रहा है की एक संकेत देता है.
    2. एक 8 या 12 चैनल मल्टी पिपेट हस्तांतरण NaCl 50 मिमी ट्राइटन 0.05% की 100 μL साथ कीड़े का उपयोग करने के लिए, एक नया तदनुसार लेबल / 96 अच्छी तरह से थाली दौर तली barcoded. -80 में प्लेट रुक ° सी विश्लेषण जब तक.
    3. विश्लेषण के दिन पर, कमरे के तापमान पर प्लेटें गल और स्वचालित Copas Biosort विश्लेषण का उपयोग करने के लिए आगे बढ़ना. सॉर्टर 22 मिनट में एक ही थाली का विश्लेषण करती है. प्लेट्स नहीं होना चाहिएविश्लेषण से पहले एक घंटे से भी अधिक के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दिया, और वे फिर से जम नहीं किया जा सकता है.
    4. Copas Biosort से प्राप्त जानकारी के डेटा की गुणवत्ता के की सरसरी सत्यापन के लिए एक Excel फ़ाइल में लिखित हैं. विभिन्न मापदंडों के साथ Copas Biosort (ऑप्टिकल घनत्व (विलुप्त होने), axial लंबाई (उड़ान के समय), प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन तीन अलग डिटेक्टरों द्वारा, एक साथ) द्वारा मापा कच्चे डेटा फिर एक समर्पित LIMS पैकेज (MBio LIMS, में जमा हो जाती है Modul जैव बाद विस्तृत मात्रात्मक विश्लेषण के लिए).

    10. प्रतिनिधि परिणाम

    ऊपर दिए गए प्रयोग के अंत में ज्यादातर कुओं में कीड़े और बैक्टीरिया की मात्रा का प्रयोग, जानवरों सब वयस्कता के लिए विकसित करनी चाहिए और वहाँ अभी भी कुछ सभी कुओं में छोड़ भोजन होना चाहिए. इन शर्तों के तहत, सबसे कुओं भी अंडे को शामिल करना चाहिए. प्रत्येक में एक वयस्कों के लिए पर्याप्त संख्या में अच्छी तरह से इतना है कि Biosort डेटा च प्राप्त है होना चाहिएया कम से कम 50 व्यक्ति कीड़े. दूसरे हाथ पर, अगर आरएनएआई कुशल है, आरएनएआई क्लोनों की एक बड़ी संख्या दिखाई फेनोटाइप भड़काने जाएगा. उदाहरण के लिए, कीड़े बेबुनियाद, या अधिक स्पष्ट रूप से, बाँझ, या उनके विकास में गिरफ्तार हो सकता है. यह अक्सर होते हैं, ताकि आम तौर पर कम से कम 96 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से एक स्पष्ट आरएनएआई phenotype के साथ कीड़े होते हैं. जब ब्याज की phenotype GFP रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति है, कुओं एक GFP क्लोन (आरएनएआई) के साथ में एक मजबूत नियंत्रण (छवि 2) प्रदान करते हैं. आकार का एक परिवर्तन के रूप में अन्य phenotypes, आसानी Biosort (छवि 3A) के साथ मापा जा सकता है. हम ने कहा कि कीड़े बहुत कम आवृत्ति (<1%, बी एस, अप्रकाशित परिणाम) पर आसन्न कुओं की ओर पलायन जब एक अच्छी तरह से खाना बाहर चला नहीं सकता था.

    जीन के विभिन्न वर्गों के नीचे दस्तक समारोह सी. में transgenes अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते हैं एलिगेंस. कुछ गैर - विशेष रूप से transgenes 12 अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है. दूसरों को ऐसे,ऊतक विशेष प्रतिलेखन कारक के रूप में, उदाहरण के लिए को epidermal Gata कारक ELT-3, 13, कोशिकाओं की विशेष सबसेट में आवश्यक हो जाएगा. यह एक गैर से संबंधित और विधान epidermal सेल वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया तनाव में transgene संवाददाता का निर्माण (कर्नल-12 पी :: dsRed के) शामिल करने के लिए कारणों में से एक है. यह ऐसे जीन विशेष रूप से अध्ययन के तहत जीन विनियामक प्रक्रिया (छवि 3 बी और सी) में शामिल उन लोगों से प्रतिष्ठित किया जा करने के लिए अनुमति देता है. यह transgene लार्वा सभी चरणों के दौरान व्यक्त किया है. यदि एक परख भ्रूण का पता लगाने में जीन की अभिव्यक्ति शामिल है, एक अलग नियंत्रण रिपोर्टर जीन की आवश्यकता होगी.

    इस प्रोटोकॉल के नवाचारों की ठंड प्लेटें का उपयोग करने के लिए उनके विश्लेषण स्थगित है. इस बर्फ़ीली प्लेटों के लिए जमा करने के लिए काफी परिणाम बदलने के बिना दो सप्ताह के लिए अनुमति देता है. हालांकि मापा प्रतिदीप्ति के निरपेक्ष मान परिवर्तित किया जा सकता है, उनके रिश्तेदार अनुपात समान रहते हैं (4 छवि). ओ.टी. परउसके हाथ, आरएनएआई एक आंतरिक चर प्रयोगात्मक प्रक्रिया 14 है. मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए और खत्म करने के कई संभावित झूठी सकारात्मक, आरएनएआई स्क्रीन करने के लिए दोहराया है, कम से कम एक बार की जरूरत है. यदि प्रयोगों को सफलतापूर्वक आयोजित की जाती हैं, वहाँ अलग अलग दिनों पर परीक्षण किया गया थाली से परिणाम के बीच एक उचित सहसंबंध होना चाहिए. विशेष रूप से, जीन है कि एक मजबूत प्रभाव स्पष्ट रूप से पहचान हो, भले ही उनके सटीक मात्रात्मक प्रभाव डुप्लिकेट प्लेट छवि (5) के बीच समान नहीं है चाहिए.

    आकृति 1.
    चित्रा 1 एक ठेठ प्रयोग के लिए समग्र योजना.

    चित्रा 2.
    चित्रा 2. नियंत्रण आरएनएआई एक लक्ष्यीकरण क्लोन GFP अभिव्यक्ति का उपयोग कर. ट्रांसजेनिक कीड़े expressiरचनात्मक रूप में कर्नल एनजी-12 एपी :: dsRed रिपोर्टर और एक inducible पी 29 एनएलपी :: GFP संवाददाता ठोस मध्यम पर एक 96 अच्छी तरह से थाली में एक फिल्टर सेट के साथ लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति के साथ अवलोकन की अनुमति खुर्दबीन विदारक GFP का उपयोग visualized. कीड़े के ऊपरी पैनल को नियंत्रित करने के लिए या 48 घंटे के लिए एक GFP आरएनएआई क्लोन (तल पैनल) के लिए खुल गए थे. बाईं तरफ के पैनल डी. के साथ संक्रमण के बाद 18 घंटे असंक्रमित कीड़े, उन पर सही कीड़े हैं coniospora. पैमाने पर पट्टी 1 मिमी है.

    चित्रा 3.
    चित्रा 3. एक 96 - अच्छी तरह से थाली के मात्रात्मक विश्लेषण. Copas Biosort प्रत्येक कृमि के लिए संख्यात्मक डेटा का विश्लेषण उत्पन्न करता है. जो 15 कीड़े, लाल प्रतिदीप्ति (बी) और हरे रंग प्रतिदीप्ति (X100) अनुपात ट्रांसजेनिक wo की TOF (सी) के आकार से मेल खाती है, रेखांकन उड़ान के समय के लिए औसत और मानक विचलन (एक TOF) दिखाने केrms के रचनात्मक रूप में व्यक्त एपी कर्नल-12 :: dsRed रिपोर्टर और एक inducible पी 29 एनएलपी :: GFP डी. के साथ संक्रमण के बाद 18 घंटे 96 अच्छी तरह से एक थाली में किया गया था ठोस मध्यम पर 48 ज के लिए विभिन्न आरएनएआई क्लोनों के साथ सुसंस्कृत संवाददाता, coniospora. (ए), भड़काने विकास और दोष / या पी कर्नल-12 :: dsRed की अभिव्यक्ति को प्रभावित तीर के साथ प्रकाश डाला एक के रूप में कुछ क्लोन,. दूसरों को, विशेष रूप से GFP अभिव्यक्ति को प्रभावित के रूप में (सी) में तीर से प्रकाश डाला. यह विशेष रूप से क्लोन लक्ष्य जीन एक nsy, पहले 29 13 एनएलपी के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है दिखाया. हरे, लाल प्रतिदीप्ति और TOF मनमाना लेकिन लगातार इकाइयों में मापा जाता है.

    चित्रा 4.
    चित्रा 4. इस COMPरहते हैं और जमे हुए नमूनों के साथ ही प्रयोग से प्राप्त आंकड़ों के Arison. L4 एनएलपी 29 पी :: GFP और पी कर्नल-12 :: dsRed transgenes ले कीड़े की प्लेट्स या तो डी के साथ संक्रमित थे coniospora या नहीं. 18h के बाद, प्रत्येक थाली लगभग 2 में विभाजित किया गया था, 1/2 तुरंत विश्लेषण किया गया था और 1/2 24 घंटों के लिए -80 ° C पर जमे हुए है, इससे पहले कि विगलन और विश्लेषण. औसत TOF (कीड़े के आकार के), ext (ऑप्टिकल घनत्व) और हरे और लाल प्रतिदीप्ति के लिए मान प्रत्येक नमूने के लिए गणना की गई. ग्राफ के लिए औसत के अनुपात से पता चलता है संक्रमित गैर संक्रमित नमूने से विभाजित, स्थिर और जीने नमूने के लिए (n = 7638 और 5096, और 8634 और 3850 कीड़े, क्रमशः).

    चित्रा 5.
    चित्रा 5. डुप्लिकेट 96 अच्छी तरह से प्लेटों के तुलनात्मक विश्लेषण. सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति अनुपात (मतलब प्रतिदीप्ति अनुपात (यहाँ, 100 * हरे TOF / प्रत्येक अच्छी तरह से विभाजित के लिए)96 अच्छी तरह से थाली के प्रतिनिधि डुप्लिकेट विश्लेषण से प्रत्येक अच्छी तरह के लिए छंटनी की (25 वें से 75 वें शतमक) एक थाली के लिए मतलब है).

    सामग्री प्रयोगात्मक समयरेखा
    • IPTG: ~ 1.4 एमएल
    • एम्पीसिलीन: ~ 5 एमएल
    • Tetracyclin: ~ 5 एमएल
    • लेग: 5 एल
    • एन जी एम के लिए 30: 96 अच्छी तरह से फ्लैट प्लेट
    • ठंड के लिए 30 (विश्लेषण): 96 अच्छी तरह गोल प्लेट
    • संस्कृति पर के लिए 30: 96 DeepWell प्लेटें
    • संस्कृति फिल्म: 30
    • 30 बैक्टीरिया बुवाई के लिए: युक्तियाँ बॉक्स
    • 9 सेमी OP50 प्लेट: 17 ~
    • 1 हौसले से cyrovial, thawed प्रति माह: कीड़े
    • Spores ~ 2 प्लेटें
    • NaCl 50mm + ट्राइटन 0.05% ~ 300 एमएल
    बृहस्पतिवार
    1. एन जी एम 96 अच्छी तरह से प्लेट (~ 1 आटोक्लेव +) आरएनएआई तैयार
    शुक्रवार
    1. 96 DeepWell लेग प्लेट (4 ~~) तैयार
    2. कीड़े तैयार (20 14 30 युवा वयस्क कीड़े के साथ प्लेट डिग्री सेल्सियस + 25 1 थाली डिग्री सेल्सियस)
    सोमवार
    1. 25 ° C पर नई थाली पर स्थानांतरण थाली से कीड़े
    2. लेग प्लेटों में बैक्टीरिया की बांटो (7 ~)
    3. 6 बजे संस्कृति पर
    मंगलवार
    1. एन जी एम प्लेटों पर सुबह में बैक्टीरिया वितरित करें (3 ~~ 2 सुखाने)
    2. 20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों से ब्लीच कीड़े
    बुधवार
    1. 10 बजे (1 ~ ~ 1 सुखाने) कीड़े बांटो
    2. थाली से कीड़े के साथ 25 टेस्ट spores ° C
    बृहस्पतिवार
    1. 3 बजे (1 ~ ~ 1 सुखाने) कीड़े को संक्रमित
    शुक्रवार
    1. 96 अच्छी तरह प्लेटें फ्रीज + (~ 2) नई में स्थानांतरण

    तालिका 1 30 प्लेट के साथ एक चक्र प्रयोग का उदाहरण है.

    चरण 1 से एक कदम के लिए प्रयोग करने के लिए 9 दिन पर आयोजित -12 के लिए 30 प्लेटों का प्रयोग एक चक्र और एक समय रेखा के लिए आवश्यक सामग्री प्रस्तुत किया है.

    निमेटोड वृद्धि (एन जी एम) मीडिया, 100 एमएल:

    0.3 जी NaCl
    0.25 छ BactoPeptone
    2 ग्राम BactoAgar
    100 μL 5 मिलीग्राम / EtOH में एमएल कोलेस्ट्रॉल
    100 एमएल के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें
    5 मिनट के लिए 121 पर आटोक्लेव ° C और शांत करते हैं, तो जोड़:
    100 μL 1 M 4 MgSO
    100 μL एम 1 2 CaCl
    2.5 एमएल 1 एम केपीओ 4 पीएच 6.0

    96 अच्छी तरह से थाली, 100 एमएल में आरएनएआई उपचार के लिए एन जी एम:

    0.29 छ NaCl
    0.25 छ BactoPeptone
    1.7 छ BactoAgar
    100 μL 5 मिलीग्राम / EtOH में एमएल कोलेस्ट्रॉल
    डे जोड़ें ionized पानी के लिए 100 मिलीलीटर
    5 मिनट के लिए 121 पर आटोक्लेव ° C और शांत करते हैं, तो जोड़:
    100 μL 1 M 4 MgSO
    100 μL एम 1 2 CaCl
    2.5 एमएल 1 एम केपीओ 4 पीएच 6.0
    400 μL 1 एम IPTG
    100 μL 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन
    100 μL 12.5 मिलीग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन

    ब्लीच समाधान, 5ml:

    2.5 एमएल एच 2 हे
    2.3 एमएल ब्लीच
    0.2 एमएल 50% NaOH

    NaOH 50%, 100 एमएल:

    50 ग्राम NaOH
    100 एमएल के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें

    NaCl 50mm ट्राइटन 0.05%, 400 एमएल:

    4 एमएल NaCl 5 एम
    ट्राइटन 1 एमएल 20%
    400 एमएल के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें

    चरण "> ट्राइटन 20%, 10 एमएल:

    2 एमएल ट्राइटन एक्स-100
    8 एमएल विआयनीकृत पानी

    M9 के बफर, 1L

    6 छ ना 2 4 HPO (मेगावाट: 178)
    3 जी 2 के.एच. पीओ 4 (मेगावाट: 136)
    5 ग्राम NaCl
    1 एल विआयनीकृत पानी जोड़ें
    आटोक्लेव
    1 एमएल MgSO है 4 एम 1 जोड़ें

    Luria (पौंड) शोरबा, 1L:

    10 ग्राम BactoTryptone है
    20 ग्राम खमीर निकालने
    10 ग्राम NaCl
    1 एल विआयनीकृत पानी जोड़ें
    आटोक्लेव

    एम 1 4 MgSO, 300 एमएल:

    73.95 छ MgSO 4 के
    300 एमएल के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें
    आटोक्लेव और कमरे के तापमान पर स्टोर

    5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल, 200 एमएल:

    1 छ कोलेस्ट्रॉल
    200 एमएल के लिए 100% EtOH जोड़ें
    बाँझ फ़िल्टर और स्टोर कमरे के तापमान पर

    एम 1 2 CaCl, 500 एमएल:

    27.75 छ 2 CaCl
    500 एमएल के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें
    बाँझ फ़िल्टर और स्टोर कमरे के तापमान पर

    1 एम केपीओ 4 6.0 पीएच, 4 एल:

    517 छ 2 के.एच. पीओ 4 (मेगावाट: 136)
    207 छ कश्मीर 2 4 HPO (मेगावाट: 174)
    4 एल विआयनीकृत पानी जोड़ें

    100 मिलीग्राम / एमएल (एएमपी) एम्पीसिलीन, 10 एमएल:

    1 ग्राम एम्पीसिलीन
    10 एमएल के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें
    -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

    एम 1 इसोप्रोपाइल (IPTG) β-D-Thiogalactopyranoside, 10 एमएल:

    2.38 छ IPTG
    10 एमएल के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें
    -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

    12.5 मिलीग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन, 100 एमएल

    1.25 छ टेट्रासाइक्लिन
    100 एमएल के लिए 100% EtOH जोड़ें

    तालिका 2 समाधान.

    Discussion

    Disclosures

    Ewbank प्रयोगशाला से संघ Biometrica और Modul - जैव के साथ सहयोग.

    Acknowledgments

    हम डी. Braendle, सीएल Kurz और में एफ Montañana - SANCHIS है के उनके योगदान के लिए धन्यवाद. इस परियोजना ANR और Conseil क्षेत्रीय PACA, और INSERM और CNRS से संस्थागत धन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BactoAgar BD Biosciences 214010
    Ampicillin Sigma-Aldrich A9518
    BactoPeptone BD Biosciences 211677
    CaCl2 Any Supplier
    AeraSeal adhesive film Dutscher 760214
    Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0481
    K2HPO4 Any Supplier
    KH2PO4 Any Supplier
    MgSO4 Any Supplier
    NaCl Any Supplier
    Na2HPO4 Any Supplier
    NaOH Any Supplier
    96 deep well plate Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0932
    96 well flat plate Falcon BD 353072
    96 well round plate Falcon BD 353077
    Tetracycline Sigma-Aldrich T8032
    Triton X-100 Any Supplier
    TECAN robot Tecan Group Ltd.
    Liquidator96TM Rainin
    COPAS Biosort Union Biometrica
    LIMS Modul-Bio

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    References

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    मात्रात्मक और स्वचालित उच्च throughput जीनोम चौड़ा में आरएनएआई स्क्रीन के<em> सी. एलिगेंस</em
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    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).More

    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).

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