Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantitativa och automatisk hög genomströmning Genomvid RNAi skärmar i C. elegans doi: 10.3791/3448 Published: February 27, 2012

Summary

Vi beskriver ett protokoll med

Abstract

RNA-interferens är en kraftfull metod för att förstå genfunktion, speciellt när den genomföres vid en hel-genomet skala och en kvantitativ sammanhang. I C. elegans, kan genfunktion slås ned på ett enkelt och effektivt genom att mata maskar med bakterier som uttrycker ett dsRNA motsvarande en specifik gen 1. Även skapandet av bibliotek av RNAi kloner som täcker det mesta av C. elegans genomet 2,3 öppnade vägen för äkta funktionella genomiska studier (se till exempel 4-7), de flesta etablerade metoder är arbetskrävande. Moy och kollegor har utvecklat halvautomatiska protokoll som underlättar genom-bredbildsskärmar 8. Det tillvägagångssätt förlitar sig på mikroskopisk avbildning och bildanalys.

Här beskriver vi ett alternativt protokoll för en hög genomströmning genomet bred skärm, som bygger på robot hantering av bakteriell RNAi kloner, kvantitativ analys med hjälp av copas Biosort (Union Biometrica (UBI)), och enintegrerad programvara: det MBioLIMS (Laboratory Information Management System från Modul-Bio) en teknik som ger ökad genomströmning för datahantering och prov spårning. Metoden tillåter skärmar som skall utföras på fast medium-plattor. Detta är särskilt viktigt för vissa studier, såsom de behandlar värd-patogen interaktioner i C. elegans, eftersom vissa mikrober inte effektivt infektera maskar i flytande kultur.

Vi visar hur metoden kan användas för att kvantifiera vikten av gener i antifungal medfödd immunitet i C. elegans. I detta fall förlitar sig metoden för användning av en transgen stam som bär en epidermal infektion-inducerbar fluorescerande reporter-gen, med GFP under kontroll av promotorn i den antimikrobiella peptiden genen nlp 29 och en röd fluorescerande reporter som uttrycks konstitutivt i de epidermis. Den senare ger en intern kontroll för den funktionella integritet epidermisoch icke-specifik transgen tysta 9. När kontroll maskar är infekterade av svampen som de fluorescerar grönt. Riva ned med RNAi en gen som krävs för NLP 29 uttryck resulterar i minskad fluorescens efter infektion. För närvarande tillåter detta protokoll mer än 3000 RNAi kloner som ska testas och analyseras varje vecka öppnar möjligheten att screena hela genomet på mindre än 2 månader.

Protocol

Protokollet som beskrivs nedan är uppdelad i steg på fem på varandra följande dagar (Fig. 1). Såsom angivits kan vissa steg kan utföras på olika dagar. Varaktigheten av varje steg, såväl som mängden material som krävs (t ex maskar, bakterier, media) kommer att bero på antalet plattor med 96 brunnar behandlade per experiment.

Dag 1

1. Framställningen av 96-brunnars NGM RNAi plattor

Följande protokoll anpassas från standardmetoden för att göra masken odlingsplattor 10, som innehåller uppgifter om steriliseringstekniker för de olika lösningarna.

  1. Under 10-12 96-brunnsplattor, framställa 100 ml medium nematodtillväxt (NGM) i avjoniserat H2O: 1,7 g baktoagar, 0,29 g NaCl, 0,25 g pepton, 100 | il kolesterol (5 mg / ml i EtOH).
  2. Autoklaven NGM (5 min vid 121 ° C under 100 ml; 30 min vid 121 ° C under 4 L) och låt den svalna tills den är vid omkring 50 ° C (bara kyler enough att hålla). Det är viktigt att NGM förblir tillräckligt varm så att den inte stelnar.
  3. Tillsätt till 100 ml: 2,5 ml fosfatbuffert pH 6 (1 M), 100 | il MgSO 4 (1 M), 100 | il CaCl2 (1 M), 400 | il IPTG (1 M), 100 | il ampicillin (100 mg / ml), 100 | il Tetracyklin (12,5 mg / ml i EtOH).
  4. Fördela 75 | il av NGM till varje brunn i en 96-brunnars flatbottnad platta. För att undvika stelning av mediet, måste den avges snabbt och det är lämpligt att använda en upprepad automaten (t.ex. Repeatman, Eppendorf). Vara säker på att det inte finns några luftbubblor som är närvarande i brunnarna.
  5. Förvara plattorna direkt i en fuktig kammare (t.ex. en Tupperware låda med våta pappershanddukar på botten) vid 4 ° C.

Anm: plattor kan framställas upp till en vecka i förväg och lagras vid 4 ° C, vilket kan göra anordnandet av efterföljande steg lättare.

2. Automatiserad framställning av 96-DeepWell LB-plattor

  1. Lägg till ett lock för att varje platta och förvara vid 4 ° C. För att spåra varje 96-brunnsplatta, bör en unik etikett eller streckkod tillsättas i detta skede eller därefter.

Anm: plattor kan framställas från 2 till 3 dagar i förväg och lagras vid 4 ° C, vilket kan göra anordnandet av efterföljande steg lättare.

3. Odla RNAi bakteriella kloner i 96-DeepWell LB-plattor (övernattskultur)

  1. För efterföljande underlätta hantering, när de ursprungliga RNAi bibliotek kloner i en 384-brunnsformat första omfördela de kloner i märkt eller streckkod standarden 96-brunnars plattor innehållande LB med 100 | ig / ml Amp och 12,5 pg / ml tet kompletterat med glycerol (10% slutkoncentration). När den ursprungliga 384-brunnsplattor inte har kloner i alla brunnar, såsom är fallet för den vanligast använda "Ahringer" bibliotek finns det flera möjligheter att organisera dotterceller plattorna. Kloner kan omfördelas så att det inte finns några tomma brunnar i dottercellerna plattorna. Detta minimerar antalet plattor för screening. Helst dock under replikering, bör några brunnar på varje dottern platta lämnas tomma, så att dessa sedan kan fyllas med vanliga kontroll kloner (positiva och negativa) som underlättar över-platta jämförelser. Dessa 96-brunnars plattor dotterceller används sedan för att ympa 96-DeepWell LB-plattor för en över natten (ON) kultur.

Alla flytande hanteringssteg är bäst med en robotliknande vätskehanteringssystem (t.ex. Tecan), men kan utföras manuellt med användning av, till exempel, en 96-stifts replikator. Om RNAi bibliotek kloner är redan i ett 96-brunnar gå till steg 3,5.

    Inkubera 96-brunnars RNAi dotterceller plattor vid 37 ° C med omröring (200 rpm) under 14-15 timmar.
  1. Kontrollera att bakterierna blev korrekt och identifiera kloner som inte växer. Dessa kommer att uteslutas från senare analyser. Idealt är OD 600 mättes i varje brunn, men detta kan göras genom enkel inspektion.
  2. Lagra 96-brunnars RNAi dotterceller plattor vid -80 ° C före användning.
  3. Tina 96-brunnsplattor innehållande RNAi kloner vid rumstemperatur. Plattorna kan sedan hållas vid 4 ° C fram till användning.
  4. Fördela 3 pl av varje bakteriell klon från en 96-brunnars platta replikera till de 96 brunnarna i den motsvarande märkta / streckkodade 96-DeepWell LB-platta innehållande 1,5 ml LB med 100 | ig / ml Amp och 12,5 pg / ml Tet. Bakteriella kloner för att styra RNAi effektivitet, såsom en GFP (RNAi) klon i föreliggande exempel, och negativa kontroller, kan införlivas manuellt i någon tillgänglig tom brunn.
  5. Täck 96-DeepWell pftalater med en självhäftande film (t.ex. AeraSeal cellulär kulturen film från Dutscher). Ersätta den använda 96-brunnars replikatplatta vid -80 ° C.
  6. De 96-DeepWell märkta Plattorna inkuberas därefter OM vid 37 ° C med omröring (200 rpm under 14-15 timmar).

Dag 2

4. Ympa RNAi bakteriekloner på de 96-brunnars NGM RNAi plattor

Detta steg bör göras på morgonen efter för kultur.

  1. Ta 96-brunnars plattor NGM från 4 ° C och låt dem värma upp och torka under 5-15 minuter under en steril skåp med laminärt flöde. Lämna inte skivorna för länge under huven (max 30 min), annars NGM senare kan spricka. Lägg till lämplig märkning / streckkod på varje platta.
  2. Hämta 96-DeepWell på odlingsplattor från 37 ° C. Anteckna positionerna för alla tomma brunnar (en tom och helt genomskinlig), och dessa kommer att uteslutas från efterföljande analyser.
  3. Centrifugera 96-DeepWell plattor 5 min vid 4000 rpm.
  4. Spets av supernatanten genom att vända på plattan kraftigt upp och ner och torka de kanter av plattan snabbt på en pappershandduk. Eftersom kulturer är rekombinanta bakterier behöver supernatanten behandlas i enlighet med lokala föreskrifter (t.ex. autoklaverat).
  5. Återsuspendera den bakteriella pelleten i den kvarvarande vätskan (cirka 50 | il) genom virvling, helst med användning av en dedicerad omrörare (t ex Tecan) så att varje platta mottar exakt samma behandling. Det är möjligt att mäta OD 600 av varje brunn för att standardisera exakt den bakteriella inokulatet för efterföljande steg, men detta är inte nödvändig, och att vi inte utför sådan kontroll.
  6. Överför 5 pl de återsuspenderade bakterierna på de 96-såväl NGM plattor med hjälp av en 8 eller 12-kanals Multi-pipett. Var noga med att inte vidröra eller penetrera NGM. Detta steg utförs manuellt, men kan optimeras med användning av en robot såsom den Liquidator96 (Rainin) som tillåterFördelningen av 96 RNAi kloner i ett steg.
  7. Låt bakterierna torr under ett sterilt laminärt flöde skåp, kontrollera regelbundet för att undvika att NGM blir för torr. Detta steg bör ta ca 2 timmar.
  8. Inkubera 96-brunnars RNAi-Ngm plattor vid 37 ° C på i en fuktig kammare.

5. Förbered en synkroniserad population av maskar

För detta steg använder vi transgena maskarna bär reportergenen (er) av intresse (t.ex. en infektion-inducerbart p NLP-29 :: GFP konstruktion och som en intern kontroll, en konstitutiv p sam-12 :: dsRed transgenstrukturen) . På grund av den observerade minskningen av transgenuttryck med tiden, tina vi färska partier av maskar var 6 veckor. Vi kultur maskar i minst 2 generationer före användning och se till att maskarna aldrig svultit före analysen. Om dag 2 i protokollet tisdagen, förbereder vi maskar på fredag ​​genom att 30 unga vuxna maskar på en 9 cm NGM platta sprids med OP50 bakteriervid 20 ° C, de kommer att vara redo att bleka på tisdag (se tabell 1).

  1. Blekmedel maskar efter standardprotokoll 10.
  2. Låt äggen kläcks i M9 vid 25 ° C på omrörning för att få en synkroniserad population av L1-larver.

Dag 3

6. Fördela maskarna på 96-och RNAi-Ngm plattor för utfodring och RNAi

Detta steg bör göras på morgonen. L1-stegs synkroniserade maskar sprids på varje 96-håls bakteriell klon för utfodring och RNAi.

  1. Hämta 96-väl RNAi-Ngm plattor från 37 ° C och lämna dem i rumstemperatur för att svalna.
  2. Hämta blekta maskarna från 25 ° C. Uppskatta antalet maskar per 2 pl och justera med M9 att ha cirka 100-120 maskar per 2 pl (ungefär en enda droppe).
  3. Fördela manuellt 2 pl L1-stegs maskar i varje brunn med en repetitiv dispenser. Kontrollera varje bra för maskar (du bör se maskar som simmar i vätska).
  4. Låt plattorna torka under en steril skåp med laminärt flöde (maximalt 1 timme). Kontrollera plattorna regelbundet, maskar måste krypa och inte simma. Var försiktig, måste NGM inte torka för mycket, annars kommer det att spricka.
  5. Placera plattorna vid 25 ° C i en fuktig kammare.

7. Testa Drechmeria coniospora sporerna för effektiv infektion

Detta steg är specifik för den aktuella skärmen. Den består i att testa olika satser av sporer för att välja högt infektiösa sådana. Därför bör det göras så nära som möjligt före dag 4, dagen för infektion. Det är nödvändigt att utarbeta tillräckligt L3-L4 maskar i förväg för dessa tester (tabell 1). De detaljerade metoder som krävs för D. coniospora kultur har beskrivits på annat håll 11.

<ol>
  • Samla sporer från ett prov av varje svamp kultur i en liten volym M9.
  • Placera en droppe av varje sporsuspension på en 35 mm NGM platta ympats med OP50, och låt den torka.
  • Lägg 30-40 L3-L4 maskar bär reportergenen av intresse (t.ex. p NLP-29 :: GFP).
  • Placera de infekterade plattorna vid 25 ° C på.
  • Nästa dag, kontrollera maskar för GFP induktion och välj satsen av svampen som ger den ljusaste, bredaste och mest homogena induktion av grön fluorescens.
  • Dag 4

    8. Infekterar RNAi exponerade maskar med D. coniospora sporer

    Detta steg utförs 30 timmar efter RNAi matning när maskar har nått L3-L4 stadium.

    1. Bestämma volymen av sporer använda för att distribuera 4 pl per brunn.
    2. Samla färsk D. coniospora sporer från den valda satsen med M9 buffert. Användning 8-10 ml M9 för en 9 cm platta av sporer.
    3. <li> Fördela 4 | il av sporer i varje brunn med en repetitiv dispensern. Kontrollera varje bra för sporer (du kan se maskarna simmar i vätska).
    4. Låt plattorna torka under en steril skåp med laminärt flöde (~ 1 h). Kontrollera plattorna regelbundet tills maskarna börjar krypa. Var försiktig, måste NGM inte torka för mycket, annars kommer det att spricka.
    5. Placera infekterade plattorna vid 25 ° C i en fuktig kammare.

    Dag 5

    9. Observation och lagring av plattorna före automatiserad kvantitativ analys

    Detta steg startar 18 timmar efter infektion och utförs under dag 5. Maskar förväntas vara unga vuxna börjar lägga ägg. Under detta steg fenotyp poängsätts visuellt: antingen maskar fluorescerar grönt vilket motsvarar en normal situation efter infektion eller induktion av GFP ändras i en given väl vilket innebär att de tystade genen ändrar svar på infektion.

      <li> snabbt iaktta plattorna under fluorescensen dissektionsmikroskop. Om plattorna visar en god allmän GFP induktion sedan fortsätta till nästa steg, annars vänta tills eftermiddagen för en bättre induktion, så länge det fortfarande finns mat kvar för maskarna.
    1. Visuellt poäng varje platta och notera alla bra med en markant fenotyp (t.ex. ingen uttryck av GFP). Genom att kontrollera för de resultat som erhållits med alla kontrollsystem RNAi kloner som kan ha tillsatts, ger denna första preliminära analys en indikation på om försöket har varit framgångsrikt.
    2. Med hjälp av en 8 eller 12-kanals Multi Pipettera överföra maskarna med 100 pl av NaCl 50 mM Triton 0,05%, till en ny motsvarande märkt / streckkoder 96-väl rundbottnade plattan. Frysa plattorna vid -80 ° C fram till analys.
    3. På dagen för analysen, tina plattorna vid rumstemperatur och vidare till den automatiserade analysen med användning av copas Biosort. Den sorterare analyserar en enda platta i 22 minuter. Plattorna bör inte varastå i rumstemperatur i mer än en timme före analys, och de kan inte frysas igen.
    4. Den information som erhålls från copas Biosort transkriberas till en Excel-fil för hastig kontroll av uppgifternas kvalitet. Rådata med de olika parametrarna som mäts av copas Biosort (optisk densitet (extinktion), axiell längd (time of flight), fluorescensemissioner, samtidigt av tre olika detektorer) lagras sedan i en dedicerad LIMS paket (MBio LIMS Modul- Bio) för efterföljande detaljerade kvantitativa analyser.

    10. Representativa resultat

    Med de mängder av maskar och bakterier som anges ovan, vid slutet av experimentet i de flesta brunnar bör djuren har alla utvecklats till vuxen ålder och det bör fortfarande vara lite mat kvar i alla brunnar. Under dessa betingelser bör de flesta brunnarna innehåller även ägg. Det bör finnas ett tillräckligt antal vuxna i varje brunn så att Biosort data erhålls feller åtminstone 50 individuella maskar. Å andra sidan, om RNAi är effektiv, kommer ett stort antal av RNAi kloner provocera en synlig fenotyp. Till exempel kan maskar vara samordnat, eller mer uppenbart, steril eller greps i sin utveckling. Detta skulle ske ofta, så att i allmänhet minst en brunn per 96-brunnars platta innehåller maskar med en uppenbar RNAi fenotyp. När fenotypen av intresse är ett uttryck för en GFP-reportergenen, brunnar med en GFP (RNAi) klon tillhandahålla en robust styrning (fig. 2). Andra fenotyper, såsom en förändring av storlek kan lätt mätas med Biosort (fig. 3A). Vi observerade att maskar kan spridas till angränsande brunnar vid mycket låg frekvens (<1%, BS, opublicerade resultat) när maten i en väl sprang ut.

    Knacka ner funktionen av olika klasser av gener kan påverka transgener uttryck i C. elegans. Vissa är inte särskilt krävs för transgener uttryck 12. Andra, t.ex.såsom vävnads-specifika transkriptionsfaktorer, exempelvis den epidermala GATA faktor ELT-3 13, kommer att krävas i vissa undergrupper av celler. Detta är en av anledningarna till införandet av en icke-relaterade och konstitutiva epidermal cell transgen reporter konstruktion (p sam-12 :: dsRed) i stammen som används för den aktuella protokollet. Detta tillåter sådana gener som skall särskiljas från de som specifikt involverade i den gen regleringsprocessen som studeras (fig. 3B och C). Denna transgen uttrycks under alla larvstadier. Om en analys involverar detektering av genuttryck i embryon en annan kontroll reportergen skulle krävas.

    En av nyheterna i detta protokoll är användningen av frysning plattor att skjuta sin analys. Frysning gör plattor som ska lagras i upp till två veckor utan att väsentligt ändra resultaten. Även om de absoluta värdena för uppmätta fluorescensen kan ändras, deras relativa förhållanden förblir liknande (fig 4). På othanden är RNAi en inneboende rörlig experimentell procedur 14. För att få robusta resultat och eliminera de många potentiella falska positiva, RNAi skärmar måste replikeras, minst en gång. Om experimenten genomfördes framgångsrikt, bör det finnas en rimlig korrelation mellan resultaten från en platta testades på olika dagar. Särskilt bör de gener som har en stark effekt vara klart identifierbar, även om deras exakta kvantitativa effekten inte är identisk mellan dubbla plattor (Fig. 5).

    Figur 1.
    Figur 1. Hela systemet för en typiskt experiment.

    Figur 2.
    Figur 2. Kontroll RNAi med användning av en klon målsökande GFP-uttryck. Transgen maskar expressing konstitutivt ap col-12 :: dsRed reporter och en inducerbar p nlp 29 :: GFP rapportörgen på fast medium i en 96-brunnsplatta visualiserades med användning av en GFP-dissektionsmikroskop med en filteruppsättning tillåta samtidig observation av rött och grönt fluorescens. Maskar exponerades för styrning (övre fälten) eller en GFP-RNAi klon (bottenpanelema) under 48 timmar. Panelerna till vänster är infekterade maskar, de till höger maskarna 18 timmar efter infektion med D. coniospora. Skalstrecket är 1 mm.

    Figur 3.
    Figur 3. Kvantitativ analys av en 96-brunnsplatta. Den copas Biosort genererar numeriska data för varje mask analyseras. Graferna visar medelvärde och standardavvikelse för tiden för flight (TOF, a), som motsvarar storleken på maskar 15, röd fluorescens (B) och förhållandet (X100) av grön fluorescens till TOF (C) av transgena worms uttryckande konstitutivt ap col-12 :: dsRed reporter och en inducerbar p nlp 29 :: GFP rapportörgen som hade odlats på fast medium i en 96-brunnsplatta med olika RNAi kloner i 48 h, 18 h efter infektion med D. coniospora. Vissa kloner, exempelvis en markerad med pilen i (A), framkallar tillväxt defekter och / eller påverka uttrycket av p kol-12 :: dsRed. Andra, särskilt påverkar GFP uttryck, vilket betonas av pilen i (C). Denna speciella klon riktar genen nsy 1, som tidigare visat sig vara viktigt för regleringen av NLP 29 13. Grönt, rött fluorescens och TOF mäts i godtyckliga men konstant enheter.

    Figur 4.
    Figur 4. KompArison av data erhållna med levande och frysta prov från samma experiment. Plattor av L4 maskar bär p NLP-29 :: GFP och p sam-12 :: dsRed transgener antingen infekterade med D. coniospora eller inte. Efter 18 h tillsattes varje platta grovt indelas i 2; halv analyserades omedelbart och halv frystes vid -80 ° C under 24 h, före upptining och analys. Värden för genomsnittlig TOF (storlek av maskar), EXT (optisk densitet) och grön och röd fluorescens beräknades för varje prov. Diagrammet visar förhållandet mellan genomsnittet för smittade dividerat med icke-infekterade prover, för de frusna och live prover (n = 7638 och 5096 samt 8634 och 3850 maskar, respektive).

    Figur 5.
    Figur 5. Jämförande analys av dubbletter 96-brunnars plattor. Den normaliserade fluorescenskvot (den genomsnittliga fluorescensen förhållandet (här 100 * grön / TOF) för varje dividerat väl avden trimmade (25: e till 75: e percentilen) medelvärde för varje platta) för varje brunn från dubbla analyser av en representativ 96-brunnsplatta.

    Material Experimentell Tidslinje
    • IPTG: ~ 1,4 ml
    • Ampicillin: ~ 5 ml
    • Tetracyklin: ~ 5 ml
    • LB: 5 L
    • 96-brunnars platta plattor: 30 för NGM
    • 96-brunnars runda plattor: 30 för frysning (analys)
    • 96-DeepWell plattor: 30 för om kultur
    • kultur Film: 30
    • Tips rutan: 30 för bakterier sådd
    • 9 cm OP50 plattor: ~ 17
    • Worms: 1 färskt tinade cyrovial per månad
    • Sporer: ~ 2 plattor
    • NaCl 50 mM + Triton 0,05%: ~ 300 ml
    Torsdag
    1. Förbered NGM RNAi 96-brunnar (~ 1h + autoklav)
    Fredag
    1. Framställa 96-DeepWell LB-plattor (~ 4 timmar)
    2. Förbered maskar (14 plattor med 30 unga vuxna maskarna vid 20 ° C + 1 plattan vid 25 ° C)
    Måndag
    1. Överföring maskar från plattan vid 25 ° C på ny platta
    2. Fördela bakterier i LB-plattor (~ 7h)
    3. På kultur 6 PM
    Tisdag
    1. Fördela bakterier på NGM plattor på morgonen (~ 3h+ ~~~HEAD=NNS 2h torkning)
    2. Bleach maskar från plattor vid 20 ° C
    Onsdag
    1. Fördela maskar klockan 10 (~ 1h + ~~~HEAD=NNS 1h torkning)
    2. Test sporer med maskar från plattan vid 25 ° C
    Torsdag
    1. Infekterar maskar vid 3 pm (~ 1h + ~~~HEAD=NNS 1h torkning)
    Fredag
    1. Överföring i ny 96-brunnars plattor + frysning (~ 2 h)

    Tabell 1. Exempel på en en-cykel experiment med 30 bottnar.

    Här presenteras det material som behövs för en en-cykel experiment av 30 plattor och en tidslinje för ett experiment från steg 1 till steg 12 anordnas på 9 dagar.

    Nematodtillväxt media (NGM), 100 ml:

    0.3 g NaCl
    0,25 g Baktopepton
    2 g Baktoagar
    100 | il 5 mg / ml kolesterol i EtOH
    Tillsätt avjoniserat vatten till 100 ml
    Autoklav under 5 minuter vid 121 ° C och låt svalna, tillsätt sedan:
    100 | il 1 M MgSO 4
    100 | il 1 M CaCl2
    2,5 ml 1 M KPO4, pH 6,0

    NGM för RNAi behandling i 96-brunnars platta, 100 ml:

    0,29 g NaCl
    0,25 g Baktopepton
    1,7 g Baktoagar
    100 | il 5 mg / ml kolesterol i EtOH
    Tillsätt de joniserat vatten till 100 ml
    Autoklav under 5 minuter vid 121 ° C och låt svalna, tillsätt sedan:
    100 | il 1 M MgSO 4
    100 | il 1 M CaCl2
    2,5 ml 1 M KPO4, pH 6,0
    400 | il 1 M IPTG
    100 | il 100 mg / ml Ampicillin
    100 | il 12,5 mg / ml tetracyklin

    Bleach lösning, 5 ml:

    2,5 ml H2O
    2,3 ml Bleach
    0,2 ml NaOH 50%

    NaOH 50%, 100 ml:

    50 g NaOH
    Tillsätt avjoniserat vatten till 100 ml

    NaCl 50 mM-Triton 0,05%, 400 ml:

    4 ml NaCl 5 M
    1 ml Triton 20%
    Tillsätt avjoniserat vatten till 400 ml

    tep "> Triton 20%, 10 ml:

    2 ml Triton X-100
    8 ml avjoniserat vatten

    M9 buffert, 1L

    6 g Na 2 HPO 4 (MW: 178)
    3 g KH 2 PO 4 (MW: 136)
    5 g NaCl
    Tillsätt avjoniserat vatten till 1 L
    Autoklavera
    Tillsätt 1 ml MgSO 4 1 M

    Luria Broth (LB), 1L:

    10 g baktotrypton
    20 g jästextrakt
    10 g NaCl
    Tillsätt avjoniserat vatten till 1 L
    Autoklavera

    1 M MgSO 4, 300 ml:

    73,95 g MgSO 4
    Tillsätt avjoniserat vatten till 300 ml
    Autoklav och förvara i rumstemperatur

    5 mg / ml kolesterol, 200 ml:

    1 g kolesterol
    Tillsätt 100% EtOH till 200 ml
    Filtersterilisera och lagra vid rumstemperatur

    1 M CaCl2, 500 ml:

    27.75 g CaCl2
    Tillsätt avjoniserat vatten till 500 ml
    Filtersterilisera och lagra vid rumstemperatur

    1 M KPO4, pH 6,0, 4 L:

    517 g KH 2 PO 4 (MW: 136)
    207 g K 2 HPO 4 (MW: 174)
    Tillsätt avjoniserat vatten till 4 L

    100 mg / ml ampicillin (Amp), 10 ml:

    1 g ampicillin
    Tillsätt avjoniserat vatten till 10 ml
    Lagra vid -20 ° C

    1 M isopropyl β-D-tiogalaktopyranosid (IPTG), 10 ml:

    2,38 g IPTG
    Tillsätt avjoniserat vatten till 10 ml
    Lagra vid -20 ° C

    12,5 mg / ml tetracyklin, 100 ml

    1,25 g Tetracyklin
    Tillsätt 100% EtOH till 100 ml

    Tabell 2. Solutions.

    Discussion

    Disclosures

    Den Ewbank lab samarbetar med unionen Biometrica och Modul-Bio.

    Acknowledgments

    Vi tackar D. Braendle, CL Kurz och F. Montañana-Sanchis för deras bidrag. Detta projekt har finansierats med bidrag från ANR och Conseil Regional PACA och institutionella medel från INSERM och CNRS.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BactoAgar BD Biosciences 214010
    Ampicillin Sigma-Aldrich A9518
    BactoPeptone BD Biosciences 211677
    CaCl2 Any Supplier
    AeraSeal adhesive film Dutscher 760214
    Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0481
    K2HPO4 Any Supplier
    KH2PO4 Any Supplier
    MgSO4 Any Supplier
    NaCl Any Supplier
    Na2HPO4 Any Supplier
    NaOH Any Supplier
    96 deep well plate Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0932
    96 well flat plate Falcon BD 353072
    96 well round plate Falcon BD 353077
    Tetracycline Sigma-Aldrich T8032
    Triton X-100 Any Supplier
    TECAN robot Tecan Group Ltd.
    Liquidator96TM Rainin
    COPAS Biosort Union Biometrica
    LIMS Modul-Bio

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
    2. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
    3. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
    4. Lee, S. S. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).
    5. Hamilton, B. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).
    6. Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. Functional genomic analysis of C. elegans molting. PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).
    7. Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes. Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).
    8. O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model. Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).
    9. Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
    10. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1551-8507 (2006).
    11. Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. Methods Mol Biol. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).
    12. Cardoso, C. XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans. Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).
    13. Pujol, N. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).
    14. Simmer, F. Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions. PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).
    15. Couillault, C. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).
    16. Morton, E., Lamitina, T. A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data. Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).
    17. Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans. PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).
    18. Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis. Virulence. 1, 113-122 (2010).
    19. Duverger, Y. A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).
    20. Pierce-Shimomura, J. T. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).
    21. Ruzanov, P., Riddle, D. L. Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).
    22. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).
    23. Okoli, I. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).
    24. Moy, T. I. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).
    25. Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2. Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).
    Kvantitativa och automatisk hög genomströmning Genomvid RNAi skärmar i<em> C. elegans</em
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).More

    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video
    Waiting X
    simple hit counter