Summary
हम एक उच्च सामग्री इमेजिंग के साथ स्वचालित संवर्धन सेल के संयोजन के लिए कल्पना और एक उच्च throughput ढंग में कई सेलुलर प्रक्रियाओं और संरचनाओं यों, पद्धति का वर्णन. इस तरह के तरीकों जीनोम के आगे कार्यात्मक एनोटेशन में सहायता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोग जीन नेटवर्क और संभावित दवा लक्ष्य की पहचान कर सकते हैं.
Protocol
1. स्वचालित पक्षपाती सेल संस्कृति (चित्रा 1) की प्रक्रिया 20
- सेल संस्कृति प्लेटों के इनपुट के लिए स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली तैयार करें. लोड उपभोग्य सामग्रियों (जैसे विंदुक युक्तियाँ, सेल संस्कृति प्लेटों, परख प्लेटें) ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (GUI) का उपयोग कर प्रणाली में. सुनिश्चित करें कि वहाँ पर्याप्त सेल संस्कृति मीडिया, फॉस्फेट (पीबीएस) के रोबोट प्रणाली में खारा और trypsin buffered.
- मैन्युअल बीज 2 एक्स 10 प्रति प्लेट एसएच SY5Y neuroblastoma सेल लाइन के 6, कोशिकाओं के साथ दो omnitray प्लेटें . Opti-सदस्य में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ कोशिकाओं को बनाए रखें. सेल संस्कृति जीयूआई का उपयोग कर रोबोट में प्लेटें रखो. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर incubated जाएगा.
- चुनें सेल जो संस्कृति प्रोटोकॉल से 20 शुरू किया जाना चाहिए. एक एक पक्षपाती सेल संस्कृति 22 प्रक्रिया, संवर्धन और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) के माउस फीडर 23 कोशिकाओं या सेल निलंबन के संवर्धन पर विस्तार से चुना कर सकते हैं22 रास.
- पक्षपाती सेल संस्कृति प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का चयन करें और सुनिश्चित करें पक्षपाती सेल लाइन विशेष पैरामीटर फाइल तो समायोजित कर रहे हैं कि संगम दहलीज (omnitray थाली है कि सेल शामिल हैं के क्षेत्र) 70% पर सेट कर दिया जाता है. दो मिनट के लिए कुल trypsinization समय निर्धारित करें.
- 2 एक्स 10 प्रति प्लेट 6 कोशिकाओं की एक बोने सेल नंबर के साथ नए omnitray प्लेटें तैयार करने के लिए रोबोट, आज्ञा.
- सेल संस्कृति स्वचालित पक्षपाती सेल संस्कृति प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का उपयोग कर प्रणाली में इनपुट omnitray प्लेटें. इस प्रोटोकॉल के निम्नलिखित चरण शामिल हैं: प्लेटें और incubated हैं imaged जब तक वे संगम पूर्व निर्धारित सीमा तक पहुंचने पर. यदि कोशिकाओं 5 रीडिंग के भीतर संगम दहलीज तक पहुँच नहीं है, प्लेट सिस्टम से हटा रहे हैं. परिभाषित उपयोगकर्ता संगम दहलीज तक पहुँचने पर, कोशिकाओं धोया हैं, trypsinized और गिना. कक्षों की एक पूर्व निर्धारित संख्या नए omnitray प्लेटों को जोड़ रहे हैं और अगर वहाँ कक्षों की पर्याप्त संख्या निर्दिष्ट सुन्न कर रहे हैंएर की परख प्लेटें डेक करने के लिए ले जाया जाता है और कोशिकाओं की एक निर्धारित संख्या प्रत्येक कुएं में तिरस्कृत. परख प्लेटें सीधे आगे प्रसंस्करण के लिए सिस्टम से एकीकृत खुर्दबीन या उत्पादन का उपयोग imaged कर सकते हैं.
- 4 omnitray प्लेट प्रति परख प्लेटें तैयार की प्रणाली अच्छी तरह से प्रति 5,000 कोशिकाओं के एक कुल के साथ, आज्ञा.
2. shRNA वायरस उत्पादन और परख प्लेटों में चढ़ाना (आवश्यक समय: 6 दिन)
- बैक्टीरियल ग्लिसरॉल shRNA (ओपन Biosystems, TRC1) वैक्टर 2ml Luria - Bertani मध्यम 100 μg / ampicilin मिलीलीटर (सिग्मा Aldrich) युक्त मीडिया में रातोंरात युक्त शेयरों आगे बढ़ें.
- निर्माता प्रोटोकॉल (Promega विज़ार्ड MagneSil TFX) के बाद plasmids निकालें.
- आरएनएआई कंसोर्टियम उच्च throughput lentiviral (96 अच्छी तरह से थाली) उत्पादन 24 प्रोटोकॉल का उपयोग कर वायरस निर्माण. Lentivirus के साथ कार्य करना अपेक्षाकृत सुरक्षित है क्योंकि वायरस पारगमन के लिए इस्तेमाल किया कणों प्रतिकृति की कमी कर रहे हैं और विभाजनजीन पैकेजिंग रणनीति उनके उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, जब lentivirus के साथ काम करने, अतिरिक्त जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं के लिए अपने आप को और 25 अन्य लोगों के लिए जोखिम को कम करने के लिए आवश्यक हैं. सभी प्रयोगों MLII या BSL2 सुरक्षा स्तर प्रयोगशाला में आयोजित किया जाना चाहिए. सभी (pipettes, प्लास्टिक के बर्तन, मीडिया) प्लास्टिक कि lentivirus कणों के साथ संपर्क में किया गया है 24 निपटान करने के लिए पहले घंटे के लिए ब्लीच के साथ incubated होना चाहिए.
- GFP सकारात्मक pLKO.1 प्लाज्मिड GFP (सिग्मा Aldrich) का उपयोग कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करके lentivirus के संक्रमण (MOI) बहुलता की गणना.
- परख प्लेटों में प्लेट 3 के MOI के साथ lentivirus.
3. Lentiviral पारगमन और एसएच SY5Y कोशिकाओं (आवश्यक समय: 6 दिन) के neuronal भेदभाव
- कक्ष परख प्लेटों के लिए जोड़ रहे हैं (1.7 कदम देखें). परख स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली में shRNA lentivirus युक्त प्लेटें लोड.
- 24 घंटे के बाद, पर मीडियापरख प्लेटें को Opti-सदस्य के लिए बदल जाएगा 0.5% FBS और 0.1 सुक्ष्ममापी retinoic भेदभाव की प्रक्रिया शुरू करने के लिए एसिड युक्त. एसएच SY5Y कोशिकाओं के भेदभाव neuritic संरचनाओं के दृश्य की अनुमति देता है और कोशिका विभाजन सिंक्रनाइज़.
- परख प्लेटों के 5 दिनों के लिए भेदभाव मीडिया में ऊष्मायन जारी रखें. यह लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के अधिक से अधिक पछाड़ना सुनिश्चित करता है.
- 5 दिन, 24 घंटे के लिए परख प्लेटों के आधे से 50 सुक्ष्ममापी 2 एच 2 हे mitochondria में DJ1 के स्थानान्तरण को प्रोत्साहित जोड़ें.
- 6 दिन, कोशिकाओं को Mitotracker CmxROS (Invitrogen) जोड़ने के लिए, और अच्छी तरह से प्रति 200 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता में 37 में सेते ° C 30 मिनट के लिए.
- एक छवि सीधे कोर्ट imager या प्लेटें आगे प्रसंस्करण के लिए सिस्टम से निर्यात किया जा सकता है है का उपयोग कर प्लेटें प्रणाली हिदायत कर सकते हैं.
4. परख प्लेटें स्वचालित immunostaining (आवश्यक टाइम: 2 दिन)
छवि गुणवत्ता paramoun हैएक संवेदनशील और विश्वसनीय HCS आयोजित करने के लिए टी. सेलुलर गलत pipetting कारण monolayer नुकसान गरीब छवि गुणवत्ता और irreproducible परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. आदेश में सेल परत क्षति को कम करने के लिए, immunostaining एक रोबोट स्टेशन का उपयोग कर आयोजित किया गया. कि पहले 26 में वर्णित किया गया है करने के लिए इसी तरह की प्रक्रिया है, लेकिन throughput बढ़ाने और उपभोज्य के उपयोग को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है.
- 4% paraformaldehyde के 100 μl 37 के लिए पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस के साथ कोशिकाओं फिक्स कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
- 5 मिनट, 3 बार के लिए 200 μl पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
- पीबीएस 10 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन (PBST) युक्त के 200 μl साथ परख प्लेटें सेते हैं.
- 5 मिनट, 3 बार के लिए 200 μl पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
- ब्लॉक बफर के 200 कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए (5% FBS साथ PBST) μl साथ परख प्लेटें सेते हैं.
- 5 मिनट, 3 बार के लिए 200 μl पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
- Foll के साथ सेतेकारण प्राथमिक 4 में रातोंरात एंटीबॉडी डिग्री सेल्सियस:
- N20 DJ1 बकरी (सांताक्रूज, 5 μg / मिलीलीटर)
- खरगोश ट्यूबिलिन β-III (सिग्मा Aldrich, 1 μg / एमएल)
- निम्नलिखित दिन, 5 मिनट, 3 बार के लिए पीबीएस के 200 μl साथ कोशिकाओं धोने.
- निम्नलिखित कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी 1 घंटे के साथ परख प्लेटें सेते:
- AlexaFluor 488 विरोधी बकरी गधा (Invitrogen, 2 μg / एमएल)
- AlexaFluor 647 बकरी विरोधी खरगोश (Invitrogen, 2 μg / एमएल
- 5 मिनट, 3 बार के लिए 200 μl पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
- ; Hoechst Invitrogen (1 μg / एमएल) के साथ 10 मिनट के लिए सेते कोशिकाओं.
- 200 μl पीबीएस के साथ 5 मिनट, 3 बार के लिए कोशिकाओं को धो लें.
- 4 में स्टोर प्लेटें वे सी जब तक ° imaged किया जा सकता है.
5. उच्च सामग्री छवि के अधिग्रहण और छवि विश्लेषण (समय की आवश्यकता: 5 दिन)
- छवि 20x उद्देश्य लेंस का उपयोग अच्छी तरह से 30 प्रतिशत क्षेत्रों के कुल. DJ1 वित्तीय संस्था के साथ कल्पनातृकां फिल्टर सेट, TRITC फिल्टर सेट, Cy5 फ़िल्टर सेट और यूवी फिल्टर सेट (चित्रा 3) का उपयोग कर नाभिक के साथ β-III ट्यूबिलिन के साथ mitochondria.
- पूरक विश्लेषण Bioapplication (Cellomics, ThermoFisher) का उपयोग करने के लिए mitochondria के भीतर Mitotracker संकेत के औसत तीव्रता का निर्धारण छवियों का विश्लेषण. (चित्रा 4B, एफ).
- DJ1 और mitochondria के बीच औसत ओवरलैप गुणांक का निर्धारण करने के लिए, Cellomics Colocalisation bioapplication (Cellomics, ThermoFisher) का उपयोग करते हुए छवियों का विश्लेषण. निम्नानुसार हित के क्षेत्रों (आरओआई) को परिभाषित करें: एक आरओआई - नाभिक (चित्रा -4 ए, ई), रॉय बी - mitochondria (चित्रा 4 बी, एफ). आरओआई बी से आरओआई एक अपवर्जित केवल cytoplasm के विश्लेषण को सुनिश्चित करने. लक्षित क्षेत्र और मैं द्वितीय लक्षित क्षेत्र के रूप में (चित्रा 4C, जी) DJ1 के रूप में mitochondria परिभाषित करें.
- Neuronal रूपरेखा bioapplication (Cellomics, Thermofisher) ट्यूबिलिन β-III धुंधला (चित्रा से neurites की औसत लंबाई का पता लगाने का उपयोग करने के लिए छवियों का विश्लेषण4D, एच).
- छवि ओपेरा LX स्वचालित confocal पाठक (Perkin - Elmer) का उपयोग कर प्लेटें. पानी विसर्जन के साथ 60x उद्देश्य लेंस का उपयोग अच्छी तरह से 30 प्रतिशत क्षेत्रों की कुल छवि. 561 एनएम और उत्तेजना के साथ यूवी लेजर नाभिक के साथ mitochondria कल्पना.
- (SER) स्पॉट एज कटक बनावट सुविधाओं एल्गोरिथ्म का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण. SER-कटक फिल्टर रिज - तरह पैटर्न बनाने पिक्सल में तीव्रता पहुंचाता. और अधिक खंडित mitochondria, उच्च स्कोर सिवर्स की रिज (8 चित्रा).
6. डेटा सामान्यीकरण और विश्लेषण
- आर सॉफ्टवेयर वातावरण के लिए BioConductor CellHTS2 पैकेज (आर 2.11.1 संस्करण, BioConductor संस्करण 2.6) में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर से डेटा आयात करें.
- लघुगणक आधार (2) प्रति प्लेट मंझला आधारित 27 सामान्य, 28 से पहले डेटा को बदलने. प्लेट प्रति विचरण समायोजन लागू नहीं करो.
- एक phenotype के संशोधक की पहचान करने के लिए, differe के बीच दो तरह एनोवा का उपयोग करेंNT के उपचार समूहों यानी संक्रमित इलाज कोशिकाओं तले बनाम तले विष इलाज किया कोशिकाओं लक्ष्य जीन कोशिकाओं अनुपचारित बनाम बनाम लक्ष्य जीन का इलाज कोशिकाओं (5-7 आंकड़े).
7. प्रतिनिधि परिणाम
DJ1 भीतर उत्परिवर्तनों जल्दी शुरू होने के पीछे हटने 21 parkinsonism को जन्म दे, लेकिन यह स्पष्ट नहीं है कैसे DJ1 के नुकसान रोग फेनोटाइप को जन्म देता है है . यह ज्ञात है कि DJ1 की कमी कोशिकाओं और oxidative तनाव प्रेरित सेल मौत करने के लिए अतिसंवेदनशील और oxidative तनाव, DJ1 cytoplasm से translocates mitochondria 29, 30 के जवाब में हैं . कोर्ट assays के निर्माण के लिए इन phenotypes की निगरानी करके, हम जीन है कि विनियमित या प्रभावित DJ1 के साथ जुड़े phenotypes की पहचान कर सकते हैं. इस दृष्टिकोण के रास्ते भीतर जो DJ1 कार्यों और है कि रोग के रोगजनन में शामिल किया जा सकता है है समझने में मदद कर सकते हैं.
DJ1 के साथ एक epistatic बातचीत (चित्रा 5) का उदाहरण: DJ1 के संपर्क में कोशिकाओं में नॉकडाउनछवि सेल व्यवहार्यता का एक बड़ा नुकसान में विष परिणाम के लिए (बार - बी: बी) तले lentivirus से संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में (BAR एक: छवि एक). पछाड़ना लक्ष्य जीन की एक एक DJ1 पछाड़ना (: छवि सी बार - सी) के साथ कोशिकाओं में मनाया है कि एक समान प्रभाव पड़ता है. दोनों DJ1 और लक्ष्य जीन या तो अकेले जीन की हानि (छवि: डी बार डी) की तुलना में एक सेल व्यवहार्यता का काफी बड़ा नुकसान में परिणाम की पछाड़ना. यह DJ1 और लक्ष्य जीन ए के बीच एक epistatic बातचीत से पता चलता है
जब कोशिकाओं को एक विष को उजागर कर रहे हैं, mitochondria में DJ1 cytoplasm से translocates, जो एक उच्च DJ1 के बीच ओवरलैप गुणांक और mitochondria (BAR एक द्वारा मात्रा निर्धारित है:: बनाम एक छवि एक DJ1 स्थानान्तरण (चित्रा 6) को विनियमित जीन का उदाहरण बार - सी छवि सी). कोशिकाओं है जहां लक्ष्य जीन बी खामोश कर दिया गया है, कम mitochondria में DJ1 translocates जब कोशिकाओं को विष को उजागर कर रहे हैं. यह पता चलता है कि लक्ष्य जीन बी DJ1 के mitochondria में परिवहन में शामिल है कि. (बार - बी: छवि बी और बार - डी: छवि डी)
जंगली प्रकार एसएच SY5Y neurite लंबाई में एक उल्लेखनीय वृद्धि में कोशिकाओं के परिणाम में लक्ष्य जीन सी के नॉकडाउन: neuronal परिणाम (चित्रा 7) में शामिल जीन के उदाहरण छवि (बार - बी: बी) तले व्यक्त lentivirus से संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में shRNA (बार - ए: एक छवि). इस आशय विष (बार - सी और डी) के साथ incubated कोशिकाओं में खो दिया है.
एक mitochondrial आकारिकी (8 चित्रा) में शामिल जीन का उदाहरण: जब shRNA के साथ जंगली प्रकार एसएच SY5Y कोशिकाओं mitochondrial विभाजन सिवर्स कटक मूल्य (चित्र 8, छवि सी और डी) में कमी में जीन डी परिणाम लक्ष्यीकरण के संक्रमण की तुलना में तले हुए lentivirus (चित्र 8, छवि ए और बी) के साथ संक्रमित कोशिकाओं.
चित्रा 1 स्वचालित सेल संस्कृति प्रोटोकॉल की बाह्यरेखा:
चित्रा 2 स्क्रीनिंग प्रक्रिया के योजनाबद्ध सिंहावलोकन, छवि विश्लेषण और सांख्यिकीय जांच प्रक्रिया के दौरान तरीकों का इस्तेमाल किया: i) कक्ष है जब तक वे सहधारा और बाद परख shRNA lentivirus युक्त प्लेटों में चढ़ाया सुसंस्कृत हैं. कक्ष 5 दिनों के लिए भेदभाव कर रहे हैं और विष तो 24 घंटे के लिए प्लेटों को जोड़ा जाता है. परख प्लेटें प्रणाली से उत्पादन कर रहे हैं और immunostained. प्रक्रियाओं में से प्रत्येक के लिए लिया गया समय की राशि कोष्ठक में संकेत दिया है. ii) डेटा कोर्ट (सेल व्यवहार्यता, प्रोटीन स्थानान्तरण और neuronal परिणाम) imager और एक स्वचालित confocal imager (mitochondrial morphology) का उपयोग करने के लिए अधिग्रहण कर लिया है. डेटा के अनुसंधान के भीतर CellHTS2 पैकेज के लिए निर्यात कर रहे हैं, आधार (2) और बदल लॉग इन सामान्यीकृत. दो तरह एनोवा विभिन्न चर के बीच महत्वपूर्ण बातचीत की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 3 कोर्ट इमेजिंग द्वारा अधिग्रहीत कोशिकाओं की छवियों समग्र. ए) अनुपचारित कोशिकाओं, बी) कक्ष एच 2 2 हे के साथ इलाज किया . DJ1 हरे, लाल और नीले रंग में नाभिक में mitochondria में लेबल है. Neurite धुंधला नहीं डाला है.
चित्रा 4 कई सेलुलर HCS से प्राप्त सुविधाओं की मात्रा का ठहराव. ई.) अनुपचारित कोशिकाओं एसएच-SY5Y. एह) 2 एच ओ 2 इलाज किया कोशिकाओं एसएच SY5Y. ए, ई) नाभिक विभाजन और आरओआई ए की परिभाषा, बी, एफ) पहचान और mitochondria, रॉय बी की मात्रा का ठहराव, सी, जी) DJ1 की पहचान, लक्ष्य चैनल द्वितीय, डी, जी) और औसत neurite लंबाई की पहचान गणना. छवि के किनारे के करीब कक्ष विश्लेषण से बाहर रखा गया है. इनसेट छवियों विश्लेषण करने के लिए छवियों को पहले से कर रहे हैं.
चित्रा 6 DJ1 स्थानान्तरण (सलाखों पर पत्र छवियों पर सरनामा के अनुरूप) को विनियमित जीन की पहचान . छवियाँ डी के माध्यम से एसएच SY5Y DJ1 (हरा), mitochondria (लाल) और नाभिक (नीला) कि DJ1 स्थानान्तरण के mitochondria में मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया के लिए लेबल की कोशिकाओं रहे हैं.
7 चित्रा neuronal परिणाम में शामिल जीन की पहचान (सलाखों पर पत्र छवियों पर सरनामा के अनुरूप).. छवियों डी के माध्यम से एक एसएच SY5Y β-III (हरा) ट्यूबिलिन और नाभिक (नीला) जो neurite लंबाई की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया के लिए लेबल की कोशिकाओं रहे हैं.
8 चित्रा mitochondrial आकारिकी विनियमन में शामिल जीन की पहचान. छवि ए और सी एसएच SY5Y तले shRNA या एक shRNA लक्ष्यीकरण जीन डी क्रमशः के साथ संक्रमित कोशिकाओं की छवियों समग्र हैं. Mitochondria लाल रंग में रंग रहे हैं, जबकि नाभिक नीले रंग में रंग रहे हैं. छवि बी और डी सिवर्स की कटक मात्रा का ठहराव के visualizations कर रहे हैं.
Discussion
/ एचटी कोर्ट सेलुलर स्क्रीनिंग सिस्टम की कम लागत, शक्तिशाली जीनोम चौड़ा जीन समारोह को संशोधित करने के उपकरण की उपलब्धता के साथ संयुक्त के साथ, हिंदुस्तान टाइम्स / कोर्ट स्क्रीन शिक्षा में आम होते जा रहे हैं. दृष्टिकोण पहले से ही सफलतापूर्वक किया गया है 9 कैंसर, 31-33 और भ्रूण विकास 34-36 में दवा लक्ष्य की पहचान के रूप में इस तरह के अनुसंधान के विविध क्षेत्रों के लिए लागू किया और यहां तक कि neuropsychiatric 37,38 विकारों में शामिल रास्ते में गूढ़ रहस्य में आवेदन के लिए क्षमता है. लेकिन एक ऐसी प्रणाली के कार्यान्वयन के समय और अनुकूलन प्रक्रिया के साथ प्रयास अक्सर 6 महीने की एक न्यूनतम ले का एक महत्वपूर्ण निवेश की आवश्यकता है. Trypsinization बार, pipetting गति और बोने घनत्व के रूप में सभी कदम, समायोजित किया जा करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को स्वस्थ हैं और लगातार बढ़ने. बैक्टीरियल संदूषण की रोकथाम एक सबसे कठिन चुनौतियों का सामना ग में साप्ताहिक सफाई प्रोटोकॉल के साथ स्वचालित सेल संस्कृति में से एक हैलगातार 70% इथेनॉल संदूषण मुक्त संस्कृतियों के लिए आवश्यक होने के साथ सभी तरल असर लाइनों के rinsing के साथ ombination. यह भी होना आवश्यक करने के लिए रोबोटिक्स में सुधार होगा ताकि उच्च संकल्प और -80 ° यौगिक भंडारण के लिए C फ्रीजर एकीकृत किया जा सकता है के लिए confocal सूक्ष्मदर्शी के रूप में अतिरिक्त उपकरणों,.
वहाँ भी सीमाएं हैं कि संवेदनशील, और इस जीन नेटवर्क का अध्ययन और विधि रोगजनक आणविक रास्ते में शामिल जीनों की पहचान की गति उपयोगिता में सुधार करने के लिए संबोधित किया जाना चाहिए.
एक स्क्रीन / एचटी कोर्ट का संचालन करने के लिए और सुनिश्चित करें कि विश्वसनीय डेटा एकत्र है, कई पहलुओं को अनुकूलित किया जाना है. पहला, माप की विश्वसनीयता सर्वोपरि है और मजबूती और परख की संवेदनशीलता पर निर्भर है. उदाहरण के लिए, ऊपर वर्णित assays के छोटे परदे के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन संख्या प्रसंस्करण छवि अधिग्रहण से पहले आवश्यक कदम की वजह से एक जीनोम व्यापक पैमाने पर लागू करने के लिए मुश्किल हैं.इस प्रकार, एक स्थिर सेल लाइनों का निर्माण रिपोर्टर जीन है, जो प्रत्यक्ष इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं और कमी आई भिन्नता प्रसंस्करण कदम की कम संख्या के कारण के लिए नेतृत्व करेंगे व्यक्त होता है. वर्तमान में, डिजाइन एक परख है कि सही ढंग से दर्शाया गया है और मज़बूती quantifies ब्याज की एक phenotype कोर्ट स्क्रीनिंग प्रक्रिया में एक बड़ी अड़चन है.
कई स्क्रीन स्तनधारी अलग आरएनएआई पुस्तकालयों, जो सभी के बंद लक्ष्य प्रभाव सीमित जीन मुंह बंद दक्षता और अधूरा जीनोम कवरेज से पीड़ित का उपयोग कोशिकाओं में आयोजित की जाती हैं. इस प्रकार पुस्तकालयों के लिए बनाया जा जो अधिक विशिष्ट, शक्तिशाली हैं और बेहतर कवरेज की जरूरत है. बनाने के प्रयास चल रहे हैं ऐसे यह आशा की जाती है ऐसे प्रयासों एचटी / कोर्ट scre के reproducibility में सुधार होगा एन हिट.
कई बड़े पैमाने पर सेल आधारित स्क्रीन की एक सीमा है कि वे neuroblastoma कोशिकाओं में आयोजित कर रहे हैं क्योंकि वे आनुवंशिक हो सकता है और चालाकी रिश्तेदार आसानी के साथ कर सकते हैं बड़ी संख्या के लिए सुसंस्कृत. हालांकि, 'हिट' vivo समारोह में पूर्व vivo सेल संस्कृति मॉडल में पहचान की प्रासंगिकता संदिग्ध है, खासकर के रूप में मस्तिष्क अति विशिष्ट कक्ष प्रकार है कि एक घने और जटिल synaptic कनेक्शन के एक उच्च एकीकृत इकाई के रूप में कार्य करने के लिए नेटवर्क के रूप में होते हैं. एक परिणाम के रूप में, यह आम है कि हिट की पहचान स्क्रीनिंग ऊपर वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर, माध्यमिक अतिरिक्त तकनीक का उपयोग कर स्क्रीन में और अधिक शारीरिक प्रासंगिक 39 मॉडल में मान्य हैं. HCS के दौरान पहचान हिट के अनुवाद में सुधार करने के लिए, प्राथमिक कोशिकाओं और विभेदित स्टेम कोशिकाओं या सह संस्कृति प्रणालियों जैसे अधिक प्रतिनिधि और परिष्कृत मॉडल, विकसित और हिंदुस्तान टाइम्स / कोर्ट दृष्टिकोण के लिए अनुकूलित की जरूरत है.
ntent स्वचालित संवर्धन सेल और कोर्ट एक इमेजिंग का एक संयोजन के साथ "> तेजी से कैसे न्यूरॉन्स के समारोह में नए अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकते हैं और निर्धारित रास्ते जो रोग के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं अन्य omics 'के दृष्टिकोण से उत्पन्न जानकारी के साथ HCS / HTS डेटा संयोजन. तब संभव हो सकता है मस्तिष्क रोगों का एक सिस्टम जीवविज्ञान सिंहावलोकन का निर्माण, इस प्रकार चिकित्सकीय विकास की सुविधा.Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है
Acknowledgments
हम जारी रखने और तकनीकी सहायता के लिए समर्थन ईवा Blaas के लिए हैमिल्टन प्रोग्रामर और विशेषज्ञों को धन्यवाद. T5 207: एसजे तिवारी फार्मा द्वारा समर्थित है, यह काम दो NWO निवेश अनुदान, (911-07-031 और 40-00506-98-10011) Prinses बीट्रिक्स Fonds 2009 Wetenschapsprijs और तंत्रिका विज्ञान कैम्पस एम्स्टर्डम के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AI.CELLHOST | Hamilton Co | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ | |
| OPTI-MEM | Invitrogen | 31985-054 | |
| RETINOIC ACID | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| OMNITRAY PLATES | Nalge Nunc international | 465219 | |
| 96 WELL CULTURE PLATES | Greiner Bio-One | 655086 | |
| DJ1 N20 ANTIBODY | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC27004 | |
| BETA-III TUBULIN ANTIBODY | Sigma-Aldrich | T3952 | |
| MITOTRACKER CMXROS | Invitrogen | M-7512 | |
| H–CHST-33342 | Invitrogen | H1399 | |
| HYDROGEN PEROXIDE | Sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| TRYPSIN | Invitrogen | 25050014 | |
| DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | Invitrogen | 14190086 | |
| PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | Promega Corp. | A2380 | |
| SHRNA CLONES | Open Biosystems | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ | |
| CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | http://www.thermo.com/hcs |
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