Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Summary

La levadura de fisión,

Abstract

Varias técnicas de microscopia están disponibles hoy en día que pueden detectar una proteína específica dentro de la célula. Durante la última década imágenes de células vivas con fluorocromos como la proteína verde fluorescente (GFP) directamente unido a la proteína de interés se ha convertido en ^un cada vez más popular. Utilizando las buenas prácticas agrarias y fluorocromos similares las localizaciones subcelulares y los movimientos de las proteínas puede ser detectada en un microscopio de fluorescencia. Por otra parte, también la localización subnuclear de una determinada región de un cromosoma puede ser estudiado con esta técnica. GFP es fusionada con la proteína represor lac (LACR) y expresó ectópica en la celda en repeticiones en tándem de la secuencia de laco se ha insertado en la región de interés en el cromosoma ^2. El LACR-GFP se unirá a las repeticiones de Laco y el área del genoma será visible como un punto verde en el microscopio de fluorescencia. La levadura es especialmente adecuado para este tipo de manipulación desde homólogarecombinación es muy eficiente, y permite así la integración específica de las repeticiones de Laco y proteínas de ingeniería de fusión con GFP ^3. Aquí se describe un método cuantitativo para el análisis de células vivas de levadura de fisión. Protocolos adicionales para el análisis de células vivas de levadura de fisión se puede encontrar, por ejemplo sobre cómo hacer una película de los ⁴ comportamiento cromosómico meiótico. En este experimento en particular nos centramos en la organización subnuclear y cómo se ve afectada durante la inducción de genes. Hemos llamado a un grupo de genes, llamado chr1, por la introducción de sitios laco obligatorio en las proximidades de los genes. El grupo de genes se enriquece de los genes que se inducen durante la hambruna de principios de nitrógeno de la levadura de fisión ^5. En la tensión de la membrana nuclear (NM) es marcado por la unión de mCherry a la proteína Cut11 NM dando lugar a una señal fluorescente de color rojo. El polo del eje corporal (SPB) compuesto Sid4 está fusionado a la proteína roja fluorescente (Sid4-mRFP) ⁶ 7. El SPB se identifica como una gran estructura redonda en el NM. Por imágenes de antes y 20 minutos después de agotamiento de la fuente de nitrógeno que puede determinar la distancia entre el grupo de genes (GFP) y el NM / SPB. La distancia media o la mediana, antes y después de agotamiento de nitrógeno se comparan y que podemos cuantificar si existe o no un cambio en la localización subcelular de la agrupación de genes después de la depleción de nitrógeno.

Protocol

1. Cultura de la levadura de fisión

1. Prepare Edimburgo Minimal los medios de comunicación (EMM) y EMM sin ​​ammoniumchloride (EMM-N) ^8. Para reducir la autofluorescencia de la solución de glucosa no debe esterilizarse en autoclave, sino esterilizada por filtración usando un filtro de 0,2 micras y posteriormente se añadió a los medios de autoclave.
2. Inocular las células de la levadura de fisión recién cultivadas en una placa de agar con medios sofisticados, YEA ^8, en 3 ml de EMM medio líquido con glucosa esterilizada filtro. Use tubos de 13ml con una ligera empujó en la tapa para asegurar una buena ventilación de las celdas. Deje que las células crecen por agitación con 225 rpm en 30 ° C. Mantener el crecimiento de las células en la fase de registro (1 x 10 ⁶ - 2 x 10 ⁷ células / ml) durante 2 días, contando ellos con una cámara de Burker seguido por dilución adecuada, todas las mañanas y por la tarde.
3. En el día del experimento, asegúrese de tener las células en la fase de registro temprano, 5 x 10 ⁶ - 1 X 10 ⁷ células / ml.
4. A morir de hambre tque las células de nitrógeno durante 20 minutos de cambiar los medios de comunicación EMM EMM-N los medios de comunicación. Esto se hace por la recolección de 3 ml de células en un tubo Eppendorf de 1,5 ml en una centrífuga de mesa superior al máximo de 1,5 fcr como la centrifugación a una velocidad mayor podría inducir una respuesta de estrés en la levadura de fisión ^9. Utilice la técnica de doble giro, lo que significa; primera vuelta de 2 minutos, luego gire el tubo de Eppendorf de 180 ° y girar de nuevo a 1,5 fcr 2 min ^10. Esto ayuda a mantener todas las celdas de una bolita en la parte inferior del tubo. Lavar una vez con EMM-N y luego disolver el precipitado en EMM-N e incubar las células durante 15 minutos a 30 ° C con agitación a 225 rpm y luego continuar con el punto 2. Preparación de la muestra.

2. Preparación de la muestra

1. Cosecha de 1,5 ml de células en un tubo Eppendorf de 1,5 ml en una centrífuga de mesa superior al máximo de 1,5 fcr como la centrifugación a una velocidad mayor podría inducir una respuesta de estrés en la levadura de fisión ^9. Utilice la técnica de doble giro, Meaning, primera spin durante 2 minutos, luego gire el tubo de Eppendorf de 180 ° y girar de nuevo a 1,5 rcf durante 2 min ^10. Esto ayuda a mantener todas las celdas de una bolita en la parte inferior del tubo.
2. Eliminar el sobrenadante, pero dejan 10-15 l y resuspender las células en los medios restantes. Por otra parte añadir 10 l de medio fresco para resuspender el botón celular.
3. Asegúrese de tener las diapositivas de vidrio transparente y cubierta de vidrio (no 1.5). Normalmente, usted no tiene que limpiar, pero asegúrese de que no se llena de polvo.
4. Saca del congelador una parte alícuota de una solución de reserva de la lectina de 1mg/ml que ha sido esterilizada por filtración. La solución de lectina puede volver a congelar un par de veces. La lectina se utiliza para fijar las células de levadura en la cubierta de vidrio.
5. Coloque 5 l de EMM con glucosa esterilizada por filtración en el vaso objetivo.
6. Coloque 5 l de solución de lectina en la esquina de la cubierta de vidrio. Posteriormente el lugar 5 l de cultivo de células en la misma esquina, es decir, en la caída de la lectina. Mezclar con la pipeta un par de veces y luego se extendió el cultivo de células-lectina mezcla a lo largo de la cubierta de vidrio con el lado largo de la punta de la pipeta. Dependiendo de la densidad de la mezcla de células dejar todo o succionar el exceso de líquido en la esquina opuesta de la cubierta de vidrio.
7. Coloque la tapa de vidrio, hasta la parte superior, con una cara en el cristal del objetivo y el otro lado en el banco. Dejar que la cubierta de cristal se seque un poco durante unos minutos. No debe absolutamente estar completamente seca, pero no debe ser demasiado líquido en el vaso.
8. Coloque la tapa de vidrio con un Ángel · aproximadamente el 70 desde el cristal objetivo por la caída de la EMM. Dejar de lado la tapa de vidrio para que se caen de arriba hacia abajo en la caída de la EMM.
9. Para sellar los bordes con grasa de silicona preparar una jeringa de 2 ml. Cortar el extremo ancho de la punta de 200 l, y adjuntarlo a la jeringa. Llene la jeringa con aproximadamente 1 ml de grasa de silicona. Una línea muy fina de silicio se aplica a los bordes de la cubierta de vidrio suavemente pushing el émbolo de la jeringa. Ahora usted tiene una cámara de pequeño crecimiento de S. pombe células.

3. Microscopía

1. Inicia el microscopio de fluorescencia mediante la activación de la lámpara de mercurio / xenon, el microscopio y la computadora. Coloque la cámara de crecimiento de la levadura en el microscopio de fluorescencia. Utilice un objetivo de 63 X o un objetivo X 100 con NA = 1.3 o superior. Si un objetivo se utiliza el aceite, añadir el aceite.
2. Utilice el campo luminoso de encontrar las células y obtener una imagen nítida.
3. La configuración de la microscopía de fluorescencia variar en función de los fluorocromos utilizados para identificar a las células de levadura y el microscopio. Nosotros usamos un microscopio confocal Zeiss LSM 700 microscopio de escaneo láser con 63x Plan-Apochromat lente objetiva de petróleo (NA = 1,4) con la de 16 líneas ajuste promedio de escaneo plano. El agujero se debe establecer en 1 a 1,1 unidades de Airy, lo que da una porción óptica de 0,8 mm. Detectamos las buenas prácticas agrarias en la pista 1 usando el conjunto de filtros para Alexa 488 con un divisor de haz de 582 nm, por lo tanto detecting longitudes de onda entre 488 y 582 nm. En la pista 2 se utiliza un conjunto de filtros óptimos para mCherry utilizando un divisor de haz a 578 nm, por lo tanto detectar longitudes de onda entre 578 nm y 600 nm. Esto significa que en la pista 2, tanto la mRFP (SPB) y NM (mCherry) será detectado.
4. Tome todas las imágenes que necesitan para ser capaces de medir en 60 células diferentes para cada cepa. Por lo general, 15 fotografías de los campos de la microscopía independientes son suficientes. Se recomienda que una cámara de crecimiento con células frescas se hace si el tiempo de microscopía supera los 60 minutos.

4. La medición cuantitativa de las distancias subcelular

1. Abrir las imágenes en el programa Zeiss Zen Light Edition. Utilizando la herramienta de medida de las mediciones de la distancia en micras entre los fluorocromos diferentes en todas las células, donde todas las señales están en el mismo plano focal. Ajustar la intensidad de la luz y el contraste para identificar el centro de la señal fluorescente. Este protocolo simplificado sólo utiliza dos diferentes colours y por lo tanto el SPB y NM están en el mismo canal. El SPB se destaca por su gran estructura redonda en el NM. La transferencia de las distancias a una hoja de bloc de notas. Medida en al menos 60 células. Otros programas, como ImageJ también podría ser utilizado para medir la distancia, pero la luz Zeiss Zen es preferido debido a su mayor resolución de la imagen y la facilidad para acercar y alejar con ese programa. Las imágenes en formato lsm abrió sus puertas en ImageJ tendrá los dos canales en la parte superior de cada uno. Para hacer una foto con los dos canales, primero divide los dos canales, y posteriormente unirlos. A partir de entonces la herramienta de línea se puede utilizar para medir las distancias como se describió anteriormente.
2. Comparar las distancias subcelular media o la mediana entre las diferentes cepas y tratamientos con un programa estadístico, por ejemplo, t-test o prueba de Mann-Whitney rango suma, por ejemplo, utilizando el software SigmaStat-3.5. Con frecuencia los datos no se distribuyen normalmente, ya que habrá una selección de las células con una menordistancias entre las señales fluorescentes como todas las señales tienen que estar en el mismo plano focal a medir. Una t-test sólo se puede utilizar cuando los datos tiene una distribución normal, mientras que una prueba de Rango de Mann-Whitney suma permite la comparación de los conjuntos de datos que carecen de una distribución normal. En un t-test la media de dos diferentes conjuntos de datos se comparan, mientras que en una prueba de Rango de Mann-Whitney suma de la media se compara.

5. Resultados representante

Tensión PJ1185: (h ^{+ +} his7:: dis1placR - GFP chr1 [:: ura4 ⁺ hphMX6 laco] sid4-mRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18-32 leu1 ade6-DN / N) se cultivó en EMM . Una muestra fue retirada y se monta en una cámara de crecimiento de la pequeña y se tomaron las fotografías (Fig. 1A + N). Posteriormente, el medio de cultivo fue reemplazado por EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N), y las células se grown durante 15 minutos con agitación. Las células de nitrógeno hambre se montaron en una cámara de crecimiento con EMM-N y se tomaron las fotografías (Fig. 1A-N). La herramienta de medición se utilizó para medir la distancia entre el lugar (GFP) y el SPB (Fig. 1B y Tabla 1). Además, la distancia entre el lugar (GFP) y NM se midió (Fig. 1B y Tabla 2). Las distancias promedio subcelular antes y después del agotamiento de nitrógeno se compararon mediante la SigmaStat-3.5 del software (Tabla 3). Hubo un cambio estadísticamente significativo en la localización de la agrupación de genes en movimiento lejos de la NM hacia el PAS. Los datos de la medición de la distancia entre las buenas prácticas agrarias y la PAS había una distribución normal y por lo tanto las distancias medias (1.777 m + N y 1.587 m-N) se podría comparar con un t-test (Tabla 1 y 3). Hubo una diferencia significativa entre los dos valores medios (P = 0.008, t-test). Los datos de la medición de la distancia entre las buenas prácticas agrarias y NM no tenía una normal, distribution y por lo tanto las distancias promedio (0 m + N y 0,390 m-N) se compararon mediante la prueba de Rango de Mann-Whitney suma (Cuadro 2 y 3). Hubo una diferencia significativa entre los dos valores de la mediana (P <0,001, Mann-Whitney suma de rangos).

Figura 1. La localización de un grupo de genes llamado chr1, marcada por las buenas prácticas agrarias, cambió después de la muerte por inanición de nitrógeno. (A) en la columna izquierda, + N, núcleo de una célula de un representante de células cultivadas en la columna derecha EMM,-N, un representante del núcleo de la célula de una célula crece en EMM-N. El verde es la señal de las buenas prácticas agrarias de etiquetado del cluster chr1, el rojo es el mRFP mCherry y etiquetado del SPB y NM, respectivamente. (B) núcleo de la célula Igual que (A), pero ahora con las distancias medidas subnuclear, amarillo: el diámetro del núcleo de la célula, azul: la distancia entre el SPB y la señal de las buenas prácticas agrarias y de color rosa: la distancia entre la señal de las buenas prácticas agrarias y la membrana nuclear.

Tabla 1. Las distancias medidas en micras subnuclear de la cepa PJ1185 crecido en EMM. Primera fila, el diámetro de la célula (d), segunda fila, la distancia entre las buenas prácticas agrarias y el SPB, la tercera fila, la distancia entre las buenas prácticas agrarias y el NM.

Tabla 2. Las distancias medidas en micras subnuclear de la cepa cultivada en PJ1185 EMM-N. Primera fila, el diámetro de la célula (d), segunda fila, la distancia entre las buenas prácticas agrarias y el SPB, la tercera fila, la distancia entre las buenas prácticas agrarias y el NM.

Tabla 3. Estadística descriptiva de las distancias observadas subnuclear en la cepa PJ1185 antes (+ N) y después (-N) hambre de nitrógeno. Primera fila: el número de celular medida, de la segunda fila: el diámetro medio (d), tercera fila: diámetro medio (d), el cuarto consecutivo: la distancia media entre las buenas prácticas agrarias y el SPB, quinta fila: distancia media entre la GFP y NM.

Discussion

Durante la última década el uso de imágenes de células vivas para controlar los eventos celulares se ha convertido cada vez más popular. Todo comenzó con el uso de proteína de fluorescencia verde de la medusa Aequorea victoria, y ahora muchos fluorocromos diferentes están disponibles emitir fluorescencia a través de un espectro amplio de cian (475 nm) a rojo lejano (648 nm) ^11. Una de las principales ventajas de imágenes de células vivas por inmunofluorescencia es que las células no están fijadas por el formaldehído o el tratamiento con etanol / acetona antes de microscopía, evitando así posibles artefactos en el proceso de fijación. Además, imágenes de células vivas ofrece la posibilidad de seguir las células individuales y tomar fotos a intervalos frecuentes durante horas o días de incubación, lo que permite obtener películas de eventos celulares ^12. Las células de mamíferos tienen la ventaja de tener un mayor tamaño, con diámetros de alrededor de 100 micras, en comparación con la célula de levadura más pequeños con un diámetro de alrededor de 3.4 ymu; m. Por otro lado, la ventaja con la levadura es el genoma fácilmente manipulable. La recombinación homóloga se produce de manera muy eficiente en la levadura y se utiliza para fusionar las proteínas de interés para diferentes fluorocromos ^3. Por otra parte, mediante la integración específica de secuencias de Laco y posterior expresión de LACR-proteína GFP permite la detección de una parte específica del genoma en el núcleo de la célula ^2. Con S. pombe células en la microscopía tiene ventajas adicionales, ya que son naturales los organismos unicelulares que crecen con un tiempo de generación rápida de bajo coste condiciones de cultivo celular. Por otra parte, S. pombe es un organismo eucariota modelo excelente ya que se ha metazoos genes homólogos.

Una de las principales limitaciones de esta técnica es de autofluorescencia en la célula de levadura preocupante la detección de la señal real. Este problema se puede superar mediante el uso de medios mínimos de crecimiento con glucosa filtro en lugar de esterilizar en autoclave. EnAdemás de las células de la levadura debe ser cultivado durante 2 días en la fase de registro antes de su montaje. El protocolo que aquí se presenta ofrece un método relativamente simple, pero todavía cuantitativa para determinar la localización subcelular de las proteínas dentro de la célula de levadura. Además de tomar fotografías en diferentes momentos podemos seguir los eventos celulares.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lectin	Sigma-Aldrich	L1395
Silicon grease	Dow Corning
Laser scanning microscope LSM 700	Carl Zeiss, Inc.	LSM 700	Other confocal microscope could be used.
SigmaStat3.5	Statcon	SigmaStat3.5	Any software for statistical analysis could be used.