Summary
Este trabajo describe tres protocolos complementarios para evaluar la toxicidad de poliglutaminas (polyQ)-expansión proteínas en la levadura
Abstract
Mal plegamiento de proteínas se asocia con muchas enfermedades humanas, especialmente enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington 1. La enfermedad de Huntington (HD) es causada por la expansión anormal de una poliglutaminas (polyQ) región dentro de la huntingtina proteína. La proteína huntingtina polyQ expandido alcanza una conformación aberrante (es decir, misfolds) y causa la toxicidad celular 2. Al menos ocho enfermedades neurodegenerativas adicionales son causados por las expansiones polyQ, incluyendo la espinocerebelosa Ataxias y la enfermedad de Kennedy 3.
El organismo modelo la levadura ha facilitado una mejor aproximación a las bases celulares y moleculares de polyQ toxicidad, incluyendo el impacto de los factores intra-e inter-molecular de polyQ toxicidad, y la identificación de las vías celulares que se dañan en las células que expresan polyQ expansión proteínas 3-8. Importantemente, muchos aspectos de la polyQ de toxicidad que se encuentran en la levadura se reproduce en otros sistemas experimentales y en cierta medida en las muestras de los pacientes en HD, lo que demuestra la importancia del modelo de levadura para el descubrimiento de los mecanismos básicos que sustentan polyQ toxicidad.
Una forma directa y relativamente simple para determinar polyQ de toxicidad en la levadura es la medición de los defectos de crecimiento de las células de levadura que expresan las proteínas polyQ expansión. Este manuscrito describe tres enfoques complementarios experimentales para determinar polyQ-toxicidad en la levadura mediante la medición del crecimiento de células de levadura que expresan expansión polyQ-proteínas. Los dos primeros métodos experimentales monitorear el crecimiento de levaduras en las placas, el tercer enfoque monitorea el crecimiento de cultivos de levaduras líquidas utilizando el instrumento BioscreenC.
Por otra parte, este manuscrito se describen las dificultades experimentales que pueden ocurrir cuando el manejo de los modelos de levadura polyQ y describe las estrategias que ayuden a evitar ominimizar estas dificultades. Los protocolos descritos aquí se pueden utilizar para identificar y caracterizar vías genéticas y pequeñas moléculas que modulan polyQ-toxicidad. Por otra parte, los ensayos descritos pueden servir de modelo para análisis precisos de la toxicidad causada por otras enfermedades asociadas a proteínas mal plegadas en los modelos de la levadura.
Protocol
1. Expresión de Tóxicos de expansión polyQ-proteínas en la levadura
Un análisis sistemático ha establecido la secuencia precisa de aminoácidos de una proteína polyQ-expansión que se requiere para producir toxicidad en la levadura 7. Este tóxico polyQ-expansión proteína contiene un amino-terminal-FLAG etiqueta seguido por 17 aminoácidos de la secuencia original de la proteína huntingtina, una región polyQ, y una fusión carboxi-terminal a una proteína fluorescente (GFP o bien PPC, véase la Figura 1 a). La expresión de las proteínas con las expansiones polyQ de 46 glutaminas o más (por ejemplo, 72 y 103 glutaminas) produce toxicidad en la levadura cuando se expresa bajo el control de la inducible y relativa fuerte promotor GAL1 7, 9.
Como se describió anteriormente, la toxicidad polyQ en la levadura es sólo aparente en las células que llevan el Rnq1p proteína prión en su conformación, [RNQ +], por ejemplo, la cepa de levadura W303 9. El tóxico polyQ expansión de proteínas recapitulates aspectos centrales de la polyQ-biología en la levadura, tales como polyQ duración que dependen de la toxicidad (ver abajo) y la agregación (Figura 1 B). En particular, tóxicos expansión polyQ proteínas no matan a las células de levadura de inmediato, sino que más bien poner en peligro o detener el ciclo celular y devision celular, por lo tanto disminuir o inhibir el crecimiento de colonias de levaduras en las placas o cultivos líquidos (nuestros datos no publicados).
2. Posibles problemas con las células de levadura que expresan tóxicos de expansión polyQ proteínas
Las células de levadura que expresan las proteínas polyQ otra tóxicos de expansión pueden no mostrar ningún defecto de crecimiento 9. La naturaleza genética de estos supresores de polyQ-toxicidad no parece estar basado en simples mutaciones mendelianas y por lo tanto puede ocurrir con una frecuencia relativamente alta (nuestros resultados no publicados). Los autores especulan que estos supresores espontáneos son causados por el endurecimiento de los priones no identificadas que funcionan de manera similar a [RNQ +] en la determinación de toxicity.Thes polyQe supresores espontáneos polyQ de toxicidad puede poner en peligro el éxito de cualquier experimento que tiene como objetivo caracterizar la toxicidad polyQ o para identificar y caracterizar los modificadores de la toxicidad polyQ.
Con el fin de evitar la ocurrencia frecuente de estos supresores espontáneas, seguir las medidas de precaución se describen a continuación, que han demostrado ser muy eficaz:
- Usar células frescas de levadura para los experimentos de toxicidad. No almacenar levadura durante períodos prolongados de tiempo. Frecuentemente recuperar las colonias de levadura fresca de material congelado.
- Frecuentemente controlar la expresión y la agregación de expansión tóxicos polyQ-proteínas por microscopía de fluorescencia.
- Mantener las células de levadura en los medios que reprimen la expresión de la toxicidad tóxico polyQ en todo momento (es decir, en medios selectivos que contienen glucosa como única fuente de carbono) antes de iniciar cualquier medición de toxicidad.
- Use al menos tres transformantes independientes para cada experimento polyQ toxicidad. </ Li>
3. Los ensayos de crecimiento
- Para cada condición experimental, inocular una colonia de cada tres transformantes independientes de células de levadura que albergan el tóxico polyQ-expansión de proteínas en 3 ml de medio de levadura selectivos con glucosa como única fuente de carbono.
- Incubar estas culturas durante la noche a 30 ° C. Bajo estas condiciones, las células no se expresa la proteína polyQ-expansión debido a que la glucosa en el medio reprime su expresión. No deje que estos crecen en exceso las culturas; mantener el OD 600 (de absorción de luz de longitud de onda de 600 nm) de los cultivos de una noche por debajo de 1.
- Habitualmente usamos tres ensayos diferentes para controlar los defectos de crecimiento de las células de levadura que expresan el tóxico polyQ expansión de proteínas:
3,1 Crecimiento en placas
- Diluir los cultivos de levaduras durante la noche (cultivados con agitación 220 rpm) hasta una DO 600 de 0.0005 (es decir, una dilución 1:1000 de un OD 600 = 0,5 la cultura) en selectiva mídia 7 de glucosa que contiene.
- Repartir uniformemente 50 l (que resulta en ca. 700 colonias por placa) de cada cultivo diluido en una placa (10 cm de diámetro) con medio selectivo que contiene glucosa como única fuente de carbono y una placa con medio selectivo que contiene galactosa como única fuente de carbono.
- Incubar las placas durante tres o cuatro días a 30 ° C. Después de la incubación, tomar fotografías de cada placa y contar el número de colonias en la glucosa y el número de colonias en las placas de galactosa. Bajo condiciones ideales, no debe haber ninguna o sólo muy pocas colonias en la placa de galactosa utilizando las células de levadura que expresa un altamente tóxico polyQ-expansión proteína (103 octodecies, la Figura 2a).
3.2 Los ensayos Spotting
Este ensayo es más cuantitativa que el ensayo de placas se ha descrito anteriormente y por lo tanto puede revelar incluso las diferencias sutiles en la toxicidad polyQ con el mismo experimento en la misma placa.
- Diluir el Overnculturas ight crecer en medio con glucosa a una DO 600 de 0,1.
- Pipetear 200 l de estas culturas estériles diluidas en placas de 96 pocillos y preparar cinco diluciones en serie cinco veces en agua estéril utilizando una pipeta multicanal.
- Usando un Frogger, (también llamado un observador, con 8 x 6 pines para la transferencia de las suspensiones celulares) transferir las suspensiones de células sobre placas que contienen medios selectivos con glucosa como única fuente de carbono y placas que contienen medios selectivos con galactosa como única fuente de carbono.
- Dejar que las placas se seque antes de su incubación a 30 ° C durante tres a cuatro días.
- Después de la incubación, tome fotografías de cada plato (Figura 2b).
3,3. Seguimiento de la toxicidad polyQ en la levadura por el crecimiento de cultivos líquidos
Este protocolo es el más cuantitativo (OD 600 números) de los tres ensayos descritos aquí y puede incluso detectar diferencias muy sutiles en la toxicidad polyQ. Lo anterior ocCurrence de supresores de espontáneos, sin embargo, lo que potencialmente puede producir resultados engañosos. Por lo tanto, recomendamos que la combinación de este ensayo con al menos uno de los dos ensayos de galvanoplastia descritos anteriormente. Se propone utilizar el instrumento BioscreenC para estos experimentos. El BioscreenC es un instrumento que mide automáticamente la densidad óptica de cultivos de levadura en 100-placas mientras se incuba a temperaturas definidas con agitación definido. Otros métodos para el cultivo de células de levadura y la medición de su densidad óptica también se pueden aplicar.
- Lavar las células de levadura de medio mínimo que contienen glucosa como única fuente de carbono tres veces en 3 ml de agua estéril.
- Diluir los cultivos de una noche que crecen en medio con galactosa a un OD 600 de 0,1.
- Llenar cada pocillo de la placa 100-BioscreenC bien con 300 l de los cultivos de levaduras.
- Abra el programa Easy Experimento Bioscreen. Determinar el número de muestras que desea monitorear (incluyendo espacios en blanco y único medio-controles), ajustar la temperatura a 30 ° C, fijar la duración de los experimentos de 3 días, establezca los intervalos de medición de 15 minutos, configurar el filtro para 600 nm / Brown, y establecer el modo de agitación a 15 segundos antes de cada medición en el de tipo medio.
- El instrumento BioscreenC y el software adjunto, va a producir hojas de cálculo Excel de cada punto de datos tomados durante el experimento.
- Preparar las curvas de crecimiento con Excel para cada muestra y comparar el crecimiento de diferentes muestras (Figura 2c). Una descripción detallada del análisis de los datos producidos por los experimentos BioscreenC se ha proporcionado antes 10.
4. Los resultados representativos
Figura 1. La levadura polyQ modelo. a) Representación esquemática de la expansión tóxica polyQ proteínas. b) La microscopia de fluorescencia que muestra las células de levadura que expresan un corto, no tóxico polyQlas células de proteínas de expansión (25Q, panel izquierdo) y la levadura que expresa una larga, tóxico-polyQ expansión de las proteínas (panel de 103 octodecies, derecha).
Figura 2. Los resultados representativos de los ensayos de crecimiento de células de levadura que expresan expansión polyQ-proteínas. a) Revestimiento de ensayo. Aproximadamente 700 células de levadura se extendió en placas y se incuba durante tres días a 30 ° C. El panel superior muestra una placa que contiene medio de glucosa, es decir, la expresión de la tóxico-polyQ expansión proteína (103 octodecies) no es inducida. El panel inferior muestra una placa de levadura que contiene el medio galactosa, es decir, la expresión de la tóxico-polyQ expansión proteína es inducida. Nótese que en el experimento mostrado aquí, no se produjo supresor espontánea. B) Manchado ensayo. Cinco serie de cinco diluciones de células de levadura albergar ya sea una proteína no tóxica polyQ (25Q) o un tóxico Protei polyQ-expansiónn (103 octodecies) fueron detectados en las placas de glucosa que reprimen la expresión de las proteínas (panel izquierdo) o en placas de galactosa que inducen su expresión. Las placas se incubaron entonces durante tres días a 30 ° C. c) experimento BioscreenC. El crecimiento de cultivos de células de levadura que expresan bien una proteína no tóxica polyQ (25Q) o un tóxico polyQ-expansión proteína (103 octodecies) fueron controlados por el instrumento BioscreenC. Las condiciones experimentales y el análisis de los experimentos BioscreenC se describen en el texto principal.
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Discussion
Este manuscrito describe tres enfoques complementarios experimentales destinados a medir polyQ de toxicidad en el organismo modelo la levadura sobre la base de la reducción del crecimiento de células de levadura que expresan tóxicos de expansión polyQ proteínas. Trabajo en la levadura se ofreció reflexiones profundas sobre los mecanismos celulares y moleculares básicos de mal plegamiento de proteínas y su toxicidad resultante, incluyendo el mal plegamiento y la toxicidad de las proteínas de expansión polyQ-9,11,12. Los experimentos basados en los protocolos que aquí se presentan han ayudado a identificar y caracterizar los potenciadores o supresores genéticos de toxicidad polyQ, modificadores de la toxicidad de moléculas pequeñas de polyQ y mecanismos celulares que sustentan polyQ toxicidad 5-8,13,14.
Los protocolos presentados se puede adaptar fácilmente para explorar otros modificadores de toxicidad polyQ tales como diferentes condiciones de crecimiento o mutaciones genéticas que reduzcan o exacerbar la toxicidad polyQ. Además, el protocolo presentado experimentalse puede ajustar fácilmente para probar la toxicidad de otras proteínas plegadas incorrectamente tóxicos en la levadura.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Trabajo en el laboratorio se Duennwald apoyado por becas de la Federación Americana para la Investigación del Envejecimiento (AFAR), la Fundación de Enfermedades Hereditarias (HDF) y la Fundación William Wood.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frogger (6x8 pins) | V&P Scientific | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growth Curves USA | 5101370 | |
| 100-well Honeycomb plates | Growth Curves USA | 9602550 |
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